Экспериментальная модель иммунотерапии меланомы с использованием вакцинации против опухоли с помощью кроветворного цитокина

Резюме

В протоколе представлена модель иммунотерапии рака с использованием клеточной вакцинации опухоли с Flt3L-экспрессирующей меланомой B16-F10. Этот протокол демонстрирует процедуры, включая подготовку культивируемых опухолевых клеток, имплантацию опухоли, облучение клеток, измерение роста опухоли, выделение внутриопухолевых иммунных клеток и анализ проточной цитометрии.

Аннотация

Fms-подобный тирозинкиназа 3 лиганд (Flt3L) представляет собой кроветворный цитокин, который способствует выживанию и дифференцировке дендритных клеток (DC). Он был использован в опухолевых вакцинах для активации врожденного иммунитета и усиления противоопухолевых реакций. Этот протокол демонстрирует терапевтическую модель с использованием клеточной опухолевой вакцины, состоящей из Flt3L-экспрессирующих клеток меланомы B16-F10 вместе с фенотипическим и функциональным анализом иммунных клеток в микроокружении опухоли (TME). Описаны процедуры культивируемой подготовки опухолевых клеток, имплантации опухоли, облучения клеток, измерения размера опухоли, выделения внутриопухолевых иммунных клеток и анализа проточной цитометрии. Общей целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии солидной опухоли и исследовательской платформы для изучения взаимосвязи между опухолевыми клетками и инфильтрирующими иммунными клетками. Протокол иммунотерапии, описанный здесь, может быть объединен с другими терапевтическими методами, такими как блокада иммунных контрольных точек (анти-CTLA-4, анти-PD-1, анти-PD-L1 антитела) или химиотерапия с целью улучшения терапевтического эффекта меланомы.

Введение

Иммунотерапия рака была признана многообещающей терапевтической стратегией, основанной на ее менее токсичных побочных эффектах и более длительных ответах. Было разработано несколько типов иммунотерапии, включая онколитическую вирусную терапию, противораковые вакцины, цитокиновую терапию, моноклональные антитела, перенос приемных клеток (CAR-T-клетки или CAR-NK) и блокаду иммунных контрольных точек¹.

Для противораковых вакцин существуют различные формы терапевтических вакцин, такие как цельноклеточные вакцины, белковые или пептидные вакцины и РНК- или ДНК-вакцины. Вакцинация опирается на способность антигенпрезентирующих клеток (АПК) обрабатывать опухолевые антигены, включая опухолеспецифические антигены, и представлять их в иммуногенной форме Т-клеткам. Дендритные клетки (ДК), как известно, являются наиболее мощными АПК и, как полагают, играют важную роль в противоопухолевом ^{иммунитете 2,3}. Эти клетки поглощают и обрабатывают опухолевые антигены, а затем мигрируют в дренирующие лимфатические узлы (dLN), чтобы праймировать и активировать опухолеспецифические Т-эффекторные (Teff) клетки путем вовлечения рецептора Т-клеток (TCR) и костимуляторных молекул. Это приводит к дифференцировке и расширению опухолеспецифических цитотоксических Т-клеток (CTL), которые проникают в опухоль и убивают опухолевые клетки⁴. Следовательно, активация и созревание ДК представляют собой привлекательные стратегии для стимуляции иммунитета против опухолевых антигенов.

Известно, что Flt3L способствует созреванию и расширению функционально зрелых DC, которые экспрессируют белки MHC класса II, CD11c, DEC205 и CD86⁵. Было показано, что внутриопухолевое, но не внутривенное введение вектора аденовируса, включающего ген Flt3L (Adv-Flt3L), способствует иммунной терапевтической активности в отношении ортропотопических опухолей⁶. Flt3L также используется в вакцинах на основе опухолевых клеток, состоящих из облученных клеток B16-F10, стабильно экспрессирующих ретровирусно трансдуцированный Flt3L в качестве способа усиления перекрестной презентации опухолевых антигенов ДК и, таким образом, увеличения противоопухолевых ответов. Протокол вакцинации против опухоли B16-Flt3L, описанный здесь, основан на исследовании, опубликованном группой⁷ доктора Джеймса Эллисона. В этой статье они сообщили, что вакцина B16-Flt3L в сочетании с блокадой CTLA-4 синергетически индуцировала отторжение установленной меланомы, что приводило к увеличению выживаемости.

Целью этого протокола является предоставление доклинической модели иммунотерапии меланомы. Здесь подробно описаны процедуры того, как приготовить и имплантировать опухолевые вакцины, а также как проанализировать состав и функцию внутриопухолевых иммунных клеток из солидной опухоли.

протокол

Все мыши, использованные в исследовании, содержались и размещались в виварии Института иммунологии Ла-Хойя (LJI) в специфических условиях, свободных от патогенов, с контролируемой температурой и влажностью. Эксперименты на животных проводились с 8-14-недельными самками мышей C57BL/6 в соответствии с руководящими принципами и протоколами, одобренными Комитетом по уходу за животными LJI.

1. Подготовка культивируемых опухолевых клеток к имплантации

1. Культивирование клеток меланомы B16-F10 в модифицированной среде Дульбекко (IMDM) Iscove, содержащей 10% термоинактивированного FBS, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 мМ MEM заменимых аминокислот и 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Поддерживайте клеточную линию при 37 °C при 5% CO₂.
2. Семена 1,5-2 х 10⁶ B16-F10 клеток в колбе 175T и культуре в течение 2 дней. Собирайте клетки, когда они на 75%-80% сливаются.
3. Снимите питательную среду и промойте колбу один раз PBS. Аспирировать PBS и добавить 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА с последующим резким постукиванием по ободу колбы для культивирования.
4. Добавьте 15 мл питательной среды для нейтрализации трипсина-ЭДТА и перелейте содержимое колбы в трубку центрифуги объемом 50 мл. Вымойте поверхность посуды 10 мл PBS и перелейте в ту же 50 мл трубку.
5. Центрифугировать ячейки в течение 5 мин при 200 х г. Выбросьте супернатант и разбейте гранулу ячейки пальцем, постукивая по дну трубки.
6. Добавьте холодные 10 мл PBS и осторожно пипетируйте клеточную суспензию; затем вручную подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра. Держите клетки на льду перед инъекцией.

2. Имплантация опухоли

1. Газ обезболивает мышей 5% изофлураном при расходе газа 1,0 л в минуту в вытяжном шкафу. Измените скорость потока на поддерживающую дозу 2% изофлурана, как только мыши будут полностью обезболены. Для этого протокола анестезия была выполнена ветеринаром в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными и их использованию.
2. Сбрить волосы на левом боку мышей и стерилизовать место инъекции с помощью спиртовых салфеток. Внутрикожно (т.д.) имплантируют опухолевые клетки B16-F10 в 5 х 10⁵ клеток в 50 мкл холодного PBS в левом боку с помощью иглы 30 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доза имплантированных опухолевых клеток B16-F10 может потребоваться скорректировать в диапазоне 0,5-5 х 10⁵ клеток для успешного развития опухоли.
3. После имплантации измеряют длину и ширину опухоли три раза в неделю с помощью электронного цифрового суппорта. Рассчитайте объем опухоли (³ мм) по формуле:
   Объем опухоли (³ мм) = ширина² × длина × 0,5
   Лечить мышей опухолевой вакциной, когда опухоли достигли размера ≥2 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли обычно можно измерить на 3 день после имплантации 5 х 10⁵ опухолевых клеток. Более высокая скорость роста опухоли B16-F10 наблюдалась у самцов C57BL/6, Rag1^-/-, или Rag2-/-γc-/-мышей. Аналогичное наблюдение было описано в других исследованиях⁸. Рекомендуется поддерживать пол мышей последовательным. Тем не менее, обратите внимание, что NIH делает акцент на сексе как важной биологической переменной в биомедицинских исследованиях.

3. Подготовка вакцины и инъекция Flt3L-экспрессирующих B16-F10 (B16-Flt3L) клеток

1. Поддерживать клетки B16-Flt3L в DMEM, содержащие 8% термоинактивированного FBS, 2 мМ глутамина и 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина при 37 °C при 5% CO₂.
2. Семена 1 х 10⁶ B16-Flt3L клеток в колбе 175T и культуры в течение 2 дней. Собирают клетки, когда они на 75%-80% сливаются, как описано на этапах 1,3-1,6, и суспендируют в 1 мл холодного PBS.
3. Облучение клеток при дозе 150 Гр гамма-лучей с помощью рентгеновского облучателя с настройкой параметров 160 кВ и 25 мА. Подсчитайте и проверьте жизнеспособность клеток, окрашивая их в синий цвет перед инъекцией.
4. Газ обезболивает мышей, как описано ранее, и стерилизует место инъекции с помощью спиртовых салфеток. Внутрикожно вводят мышам 1 х 10⁶ облученных B16-Flt3L клеток в 50 мкл холодного PBS на том же фланге, что и первоначальная имплантация опухоли, ~ 1 см от места первичной опухоли на 3, 6 и 9 день после первоначальной имплантации клеток.
5. Пометьте места инъекции вакцины цветной ручкой, чтобы отличить ее от первичной опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если первоначально имплантировано^0,5 х 10 5 клеток B16-F10, рекомендуется проводить вакцинацию на 8, 11 и 14 день.

4. Изоляция внутриопухолевых иммунных клеток

1. Жертвоприношение мышей с использованием_СО2 и вывиха шейки матки в вытяжном капюшоне в конце эксперимента (на 15 день после имплантации опухоли; Рисунок 1).
2. Хирургически удаляют опухоль с кожей у каждой мыши и помещают ее в 24-луночную пластину с 1 мл 10% среды FBS/RPMI-1640. Высушите опухоли с помощью бумажного полотенца перед взвешиванием.
3. Разрежьте опухоли на мелкие кусочки. Добавьте 2 мл буфера пищеварения (100 мкг/мл TL Liberase и 200 мкг/мл ДНКазы I в среде RPMI-1640) и инкубируйте в течение 25 мин при 37 °C.
4. Добавьте 10 мл 10% среды FBS/RPMI-1640, чтобы остановить пищеварение. Перенесите клетки с помощью серологической пипетки объемом 25 мл и используйте поршень шприца объемом 1 мл для измельчения ткани на клеточном ситечке 40 мкм.
5. Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируют гранулы в 5 мл 40% градиента плотности удельной среды в PBS, разбавленной до 1x концентрации).
6. Медленно добавляйте клеточную суспензию поверх 5 мл 80% градиентно-специфической среды плотности, содержащей PBS. Центрифугирование ячеек при разрешении 325 x g с низкой настройкой тормозов в течение 23 мин при комнатной температуре (RT).
7. После центрифугирования тщательно соберите слой лейкоцитов на границе раздела между 40% и 80% плотностью-градиент-специфической средой и пропустите его через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм. Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
8. Инкубировать гранулу в 2 мл буфера лизиса эритроцитов (ЭРИАК) в течение 5 мин при РТ. После инкубации добавляют 10 мл 10% среды FBS/RPMI-1640 для закалки буфера лизиса RBC.
9. Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендируют клетки в 0,5 мл 10% среды FBS/RPMI-1640 и подсчитывают общее количество клеток перед использованием для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите селезенку или dLN в качестве контроля для стратегии определения стратегии иммунных клеток с помощью анализа проточной цитометрии. Следуйте методу изоляции клеток, как описано выше, со следующими изменениями: Используйте поршень шприца объемом 1 мл для измельчения ткани на сетчатом фильтре 70 мкм. Промыть ткань 10% средой FBS/RPMI-1640 для получения одноклеточных суспензий. Lyse РБК, как описано.

5. Анализ проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, собранные из слоя лейкоцитов, содержат иммунные клетки и опухолевые клетки. Рекомендуется использовать две независимые окрашивающие панели.

1. Окрашивание поверхности
   1. Переместите ячейки в 96-луночную V-образную нижнюю пластину. Промыть клетки PBS и окрасить их красителем жизнеспособности клеток (50-100 мкл/хорошо) в течение 15 мин при РТ.
   2. Центрифугировать ячейки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Окрашивают поверхностные маркеры смешанными антителами (подробное разведение приведено в Таблице материалов) в буфере FACS (1% FBS и 0,05% NaN₃ в PBS) в течение 30 мин на льду (50-100 мкл/лунка).
   3. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS.
   4. Зафиксируйте клетки с буфером фиксации клеток (50-100 мкл / колодец) в течение 35 мин на льду. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS.
   5. Храните образцы в буфере FACS (150-200 мкл/пробирка) при температуре 4 °C и защищайте от света. Приобретайте образцы на проточном цитометре. Для популяции ДК и Т-клеток следуйте стратегиям гаширования, представленным на рисунке 2B и рисунке 3A.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания миелоидных ДК рекомендуется инкубировать FC-блокатор (Rat anti-mouse CD16/CD32) в течение 15 мин на льду перед инкубацией поверхностных антител (этап 5.1.2).
2. Анализ цитокинов при повторной стимуляции ex vivo
   1. Обложите клетки в полной среде (RPMI-1640, дополненный 10% FBS, 10 мМ HEPES, рН 7,2-7,6, 0,1 мМ заменимой аминокислоты, 1 мМ пирувата натрия, 100 МД/мл каждого пенициллина и стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ Л-глутамина) и стимулируйте 50 нг/мл PMA плюс 1 мкМ иономицина в присутствии ингибитора транспорта белка в течение 4 ч при 37 °C при 5% CO₂.
   2. Выполните окрашивание поверхности для поверхностных маркеров, как описано выше на шаге 5.1.
   3. Добавляют раствор для пермеабилизации (50-100 мкл/лунка) и инкубируют в течение 5 мин при РТ для внутриклеточного окрашивания. Инкубируют клетки с антителами, специфичными для цитокинов или ядерных белков, в пермеабилизационном растворе (50-100 мкл/лунка) в течение 60 мин на льду или на ночь при 4 °C.
   4. Центрифугируйте ячейки при 500 х г в течение 5 мин и дважды промывайте их буфером FACS. Храните образцы при температуре 4 °C и защищайте от света. Приобретайте образцы на проточном цитометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител, возможно, придется корректировать по мере необходимости для достижения оптимального окрашивания.

Результаты

Видимая черная точка имплантированных клеток B16-F10 обычно наблюдается на поверхности кожи ~ через 3 дня после имплантации опухоли. Мышей лечат опухолевой вакциной через 3, 6 и 9 дней после того, как узелок опухоли достиг размера ≥2 мм. Мы наблюдали значительное снижение роста опухоли у вакц...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, основан на исследовании группы Эллисон. Они продемонстрировали, что комбинация вакцины B16-Flt3L с блокадой CTLA-4 показала синергетический эффект на выживаемость и рост опухоли, тогда как у мышей, получавших вакцину B16-Flt3L или лечение антителами против CTLA-4^...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200