Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt ein Krebsimmuntherapiemodell mit zellbasierter Tumorimpfung mit Flt3L-exprimierendem B16-F10-Melanom vor. Dieses Protokoll demonstriert die Verfahren, einschließlich der Vorbereitung kultivierter Tumorzellen, der Tumorimplantation, der Zellbestrahlung, der Messung des Tumorwachstums, der Isolierung intratumoraler Immunzellen und der Durchflusszytometrieanalyse.

Zusammenfassung

Der Fms-ähnliche Tyrosinkinase-3-Ligand (Flt3L) ist ein hämatopoetisches Zytokin, das das Überleben und die Differenzierung von dendritischen Zellen (DCs) fördert. Es wurde in Tumorimpfstoffen verwendet, um die angeborene Immunität zu aktivieren und die Antitumorreaktionen zu verbessern. Dieses Protokoll zeigt ein therapeutisches Modell mit zellbasiertem Tumorimpfstoff, bestehend aus Flt3L-exprimierenden B16-F10-Melanomzellen sowie phänotypischer und funktioneller Analyse von Immunzellen in der Tumormikroumgebung (TME). Verfahren zur kultivierten Tumorzellpräparation, Tumorimplantation, Zellbestrahlung, Tumorgrößenmessung, intratumorale Immunzellisolierung und Durchflusszytometrieanalyse werden beschrieben. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein präklinisches solides Tumorimmuntherapiemodell und eine Forschungsplattform zur Untersuchung der Beziehung zwischen Tumorzellen und infiltrierenden Immunzellen bereitzustellen. Das hier beschriebene Immuntherapieprotokoll kann mit anderen therapeutischen Modalitäten wie Immun-Checkpoint-Blockade (Anti-CTLA-4, Anti-PD-1, Anti-PD-L1-Antikörper) oder Chemotherapie kombiniert werden, um die krebstherapeutische Wirkung des Melanoms zu verbessern.

Einleitung

Die Krebsimmuntherapie wurde aufgrund ihrer weniger toxischen Nebenwirkungen und dauerhafteren Reaktionen als vielversprechende therapeutische Strategie anerkannt. Es wurden verschiedene Arten von Immuntherapien entwickelt, darunter onkolytische Virustherapien, Krebsimpfstoffe, Zytokintherapien, monoklonale Antikörper, adoptiver Zelltransfer (CAR-T-Zellen oder CAR-NK) und Immun-Checkpoint-Blockade¹.

Für Krebsimpfstoffe gibt es verschiedene Formen von therapeutischen Impfstoffen, wie Ganzzellimpfstoffe, Protein- oder Peptidimpfstoffe sowie RNA- oder DNA-Impfstoffe. Die Impfung beruht auf der Fähigkeit von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs), Tumorantigene, einschließlich tumorspezifischer Antigene, zu verarbeiten und sie in immunogener Form T-Zellen zu präsentieren. Dendritische Zellen (DCs) sind bekanntermaßen die stärksten APCs und es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Antitumorimmunität spielen ^2,3. Diese Zellen nehmen Tumorantigene auf und verarbeiten sie und wandern dann zu den drainierenden Lymphknoten (dLN), um tumorspezifische T-Effektorzellen (Teff) durch Engagement des T-Zell-Rezeptors (TCR) und kostimulatorischer Moleküle vorzubereiten und zu aktivieren. Dies führt zu einer Differenzierung und Expansion von tumorspezifischen zytotoxischen T-Zellen (CTL), die den Tumor infiltrieren und Tumorzellen abtöten⁴. Folglich stellen Aktivierung und Reifung von DCs attraktive Strategien dar, um die Immunität gegen Tumorantigene zu stimulieren.

Es ist bekannt, dass Flt3L die Reifung und Expansion von funktionell reifen DCs fördert, die MHC-Proteine der Klassen II, CD11c, DEC205 und CD86 exprimieren⁵. Es wurde gezeigt, dass die intratumorale, aber nicht intravenöse Verabreichung eines Adenovirusvektors mit dem Flt3L-Gen (Adv-Flt3L) die immuntherapeutische Aktivität gegen orthrotope Tumoren fördert⁶. Flt3L wurde auch in Tumorzell-basierten Impfstoffen verwendet, die aus bestrahlten B16-F10-Zellen bestehen, die stabil retroviral transduziertes Flt3L exprimieren, um die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen durch DCs zu verbessern und somit die Antitumorreaktionen zu erhöhen. Das hier beschriebene Protokoll der B16-Flt3L-Tumorimpfung basiert auf einer Studie, die von Dr. James Allisons Gruppe⁷ veröffentlicht wurde. In dieser Arbeit berichteten sie, dass ein B16-Flt3L-Impfstoff in Kombination mit der CTLA-4-Blockade synergistisch die Abstoßung des etablierten Melanoms induzierte, was zu einem erhöhten Überleben führte.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein präklinisches Immuntherapiemodell für Melanome bereitzustellen. Hier werden detaillierte Verfahren zur Herstellung und Implantation von Tumorimpfstoffen sowie zur Analyse der Zusammensetzung und Funktion intratumoraler Immunzellen aus soliden Tumoren beschrieben.

Protokoll

Alle in der Studie verwendeten Mäuse wurden im Vivarium des La Jolla Institute for Immunology (LJI) unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gepflegt und untergebracht. Tierversuche wurden mit 8-14 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen gemäß den vom LJI Animal Care Committee genehmigten Richtlinien und Protokollen durchgeführt.

1. Vorbereitung kultivierter Tumorzellen für die Implantation

1. Kultur von B16-F10-Melanomzellen in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), das 10% hitzeinaktiviertes FBS, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM MEM nichtessentielle Aminosäuren und jeweils 100 U / ml Penicillin und Streptomycin enthält. Halten Sie die Zelllinie bei 37 °C unter 5% CO₂.
2. Aussaat 1,5-2 x 10⁶ B16-F10 Zellen in einem 175T-Kolben und Kultur für 2 Tage. Ernten Sie Zellen, wenn sie zu 75% -80% konfluieren.
3. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie den Kolben einmal mit PBS. PBS aspirieren und 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen, gefolgt von einem harten Klopfen auf den Rand des Kulturkolbens.
4. 15 ml Kulturmedium zugeben, um das Trypsin-EDTA zu neutralisieren, und den Inhalt des Kolbens in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen gießen. Waschen Sie die Geschirroberfläche mit 10 ml PBS und gießen Sie sie in dasselbe 50-ml-Röhrchen.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 200 x g. Verwerfen Sie den Überstand und brechen Sie das Zellpellet, indem Sie mit dem Finger auf den Boden des Röhrchens klopfen.
6. Fügen Sie kalte 10 ml PBS hinzu und pipepisieren Sie vorsichtig die Zellsuspension; Dann zählen Sie die Zellen manuell mit dem Hämozytometer. Halten Sie die Zellen vor der Injektion auf Eis.

2. Tumorimplantation

1. Gasanästhesieren Mäuse mit 5% Isofluran bei einer Gasdurchflussrate von 1,0 l pro min im Abzug. Ändern Sie die Flussrate auf die Erhaltungsdosis von 2% Isofluran, sobald die Mäuse vollständig betäubt sind. Für dieses Protokoll wurde die Anästhesie vom Tierarzt gemäß den Richtlinien für die institutionelle Tierpflege und -verwendung durchgeführt.
2. Rasieren Sie die Haare an der linken Flanke der Mäuse und sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit Alkoholtüchern. Intradermal (i.d.) implantieren B16-F10 Tumorzellen an 5 x 10⁵ Zellen in 50 μL kaltem PBS in der linken Flanke mit einer 30 G Nadel.
   HINWEIS: Die Dosis der implantierten B16-F10-Tumorzellen muss möglicherweise im Bereich von 0,5-5 x 10⁵ Zellen für eine erfolgreiche Tumorentwicklung angepasst werden.
3. Nach der Implantation messen Sie die Tumorlänge und -breite dreimal pro Woche mit einem elektronischen digitalen Messschieber. Berechnen Sie das Tumorvolumen (mm³) mit der Formel:
   Tumorvolumen (mm³) = Breite² × Länge × 0,5
   Behandeln Sie Mäuse mit Tumorimpfstoff, wenn Tumore eine Größe von ≥2 mm erreicht haben.
   HINWEIS: Tumore können in der Regel am Tag 3 nach Implantation von 5 x 10⁵ Tumorzellen gemessen werden. Eine schnellere B16-F10-Tumorwachstumsrate wurde bei männlichen C57BL/6-, Rag1-/- oder Rag2-/-γc-/--^-Mäusen beobachtet. Eine ähnliche Beobachtung wurde in anderen Studien beschrieben⁸. Es wird empfohlen, das Geschlecht der Mäuse konsistent zu halten. Beachten Sie jedoch, dass das NIH den Schwerpunkt auf das Geschlecht als wichtige biologische Variable in der biomedizinischen Forschung legt.

3. Impfstoffherstellung und Injektion von Flt3L-exprimierenden B16-F10 (B16-Flt3L)-Zellen

1. Halten Sie die B16-Flt3L-Zellen in DMEM, die 8% hitzeinaktiviertes FBS, 2 mM Glutamin und jeweils 100 U / ml Penicillin und Streptomycin enthalten, bei 37 ° C unter 5% CO₂.
2. Aussaat 1 x 10⁶ B16-Flt3L-Zellen in einem 175T-Kolben und Kultur für 2 Tage. Ernten Sie Zellen, wenn sie 75% -80% konfluent sind, wie in den Schritten 1.3 bis 1.6 beschrieben, und suspendieren Sie in 1 ml kaltem PBS.
3. Bestrahlung von Zellen mit 150 Gy Gammastrahlendosis mit Röntgenbestrahlungsgerät mit 160 kV und 25 mA Parametereinstellung. Zählen und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung vor der Injektion.
4. Gasanästhesieren Sie Mäuse wie zuvor beschrieben und sterilisieren Sie die Injektionsstelle mit Alkoholtüchern. Intradermal injizieren Sie den Mäusen 1 x 10 6 bestrahlte B16-Flt3L-Zellen in 50 μL kaltem PBS auf derselben Flanke wie die ursprüngliche Tumorimplantation, ~1 cm entfernt von der Stelle des Primärtumors an den Tagen 3,⁶ und 9 nach der ersten Zellimplantation.
5. Markieren Sie die Impfstoffinjektionsstellen mit einem farbigen Stift, um sie vom Primärtumor zu unterscheiden.
   HINWEIS: Wenn anfänglich 0,5 x 10⁵ B16-F10-Zellen implantiert werden, wird empfohlen, eine Impfbehandlung an den Tagen 8, 11 und 14 durchzuführen.

4. Intratumorale Immunzellisolierung

1. Opfern Sie Mäuse mit CO₂ und zervikaler Dislokation im Abzug am Ende des Experiments (am Tag 15 nach der Tumorimplantation; Abbildung 1).
2. Entfernen Sie den Tumor chirurgisch mit der Haut von jeder Maus und legen Sie ihn in eine 24-Well-Platte mit 1 ml 10% FBS / RPMI-1640-Medium. Trocknen Sie die Tumore mit einem Papiertuch, bevor Sie es wiegen.
3. Schneiden Sie die Tumore in kleine Stücke. 2 ml Aufschlusspuffer (100 μg/ml TL Liberase und 200 μg/ml DNase I in RPMI-1640 Medium) zugeben und 25 min bei 37 °C inkubieren.
4. Fügen Sie 10 ml 10% FBS / RPMI-1640-Medium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Übertragen Sie die Zellen mit einer 25-ml-serologischen Pipette und verwenden Sie den Kolben einer 1-ml-Spritze, um Gewebe auf einem 40-μm-Zellsieb zu schleifen.
5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL 40% Dichte gradient spezifisches Medium in PBS, verdünnt auf 1x Konzentration).
6. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf 5 ml 80% dichtegradientenspezifisches Medium hinzu, das PBS enthält. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 325 x g mit niedriger Bremseinstellung für 23 min bei Raumtemperatur (RT).
7. Nach der Zentrifugation die Leukozytenschicht an der Grenzfläche zwischen 40% und 80% dichtegradientenspezifischem Medium vorsichtig auffangen und durch ein 40 μm großes Zellsieb leiten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
8. Inkubieren Sie das Pellet in 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer (RBC) für 5 Minuten bei RT. Nach der Inkubation 10 ml 10% FBS/RPMI-1640-Medium hinzufügen, um den RBC-Lysepuffer zu löschen.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml 10% FBS/RPMI-1640-Medium und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen vor der weiteren Analyse.
   HINWEIS: Sammeln Sie die Milz oder dLN als Kontrollen für die Gating-Strategie von Immunzelluntergruppen durch Durchflusszytometrie-Analyse. Befolgen Sie die oben beschriebene Zellisolierungsmethode mit den folgenden Änderungen: Verwenden Sie den Kolben einer 1-ml-Spritze, um Gewebe auf einem 70-μm-Netzfilter zu schleifen. Waschen Sie das Gewebe mit 10% FBS / RPMI-1640-Medium, um einzellige Suspensionen zu erhalten. Lysieren Sie die RBC wie beschrieben.

5. Durchflusszytometrie-Analyse

HINWEIS: Zellen, die aus der Leukozytenschicht gewonnen werden, enthalten Immunzellen und Tumorzellen. Zwei unabhängige Färbeplatten werden empfohlen.

1. Oberflächenfärbung
   1. Übertragen Sie die Zellen in eine 96-Well-V-förmige Bodenplatte. Waschen Sie die Zellen mit PBS und färben Sie sie mit Zelllebensfähigkeitsfarbstoff (50-100 μL / Well) für 15 min bei RT.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Färben Sie die Oberflächenmarker mit gemischten Antikörpern (detaillierte Verdünnung finden Sie in der Materialtabelle) in FACS-Puffer (1% FBS und 0,05% NaN₃ in PBS) für 30 min auf Eis (50-100 μL / Well).
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min und waschen Sie sie zweimal mit FACS-Puffer.
   4. Fixieren Sie die Zellen mit Zellfixierpuffer (50-100 μL/ Well) für 35 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min und waschen Sie sie zweimal mit FACS-Puffer.
   5. Lagern Sie die Proben im FACS-Puffer (150-200 μL/Röhrchen) bei 4 °C und schützen Sie sie vor Licht. Erfassen Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer. Befolgen Sie für DCs und T-Zellen die Gating-Strategien in Abbildung 2B und Abbildung 3A.
      HINWEIS: Für die Färbung myeloider DCs wird empfohlen, FC-Blocker (Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32) für 15 min auf Eis zu inkubieren, bevor die Oberflächenantikörperinkubation (Schritt 5.1.2) inkubiert wird.
2. Zytokinanalyse bei ex vivo Restimulation
   1. Die Zellen werden in vollständigem Medium (RPMI-1640 ergänzt mit 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM nicht-essentieller Aminosäure, 1 mM Natriumpyruvat, je 100 U/ml Penicillin und Streptomycin, 50 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin) beschichtet und mit 50 ng/ml PMA plus 1 μM Ionomycin in Gegenwart von Proteintransportinhibitor für 4 h bei 37 °C unter 5%_CO2 stimuliert.
   2. Führen Sie die Oberflächenfärbung für Oberflächenmarker wie oben in Schritt 5.1 beschrieben durch.
   3. Fügen Sie die Permeabilisierungslösung (50-100 μL / Well) hinzu und inkubieren Sie für 5 min bei RT für die intrazelluläre Färbung. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern, die spezifisch für Zytokine oder Kernproteine sind, in Permeabilisierungslösung (50-100 μL/Well) für 60 min auf Eis oder über Nacht bei 4 °C.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min und waschen Sie sie zweimal mit FACS-Puffer. Die Proben bei 4 °C lagern und vor Licht schützen. Erfassen Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer.
      HINWEIS: Die Antikörperverdünnung muss möglicherweise bei Bedarf angepasst werden, um eine optimale Färbung zu erreichen.

Ergebnisse

Ein sichtbarer schwarzer Punkt der implantierten B16-F10-Zellen wird normalerweise ~3 Tage nach der Tumorimplantation auf der Hautoberfläche beobachtet. Mäuse werden 3, 6 und 9 Tage nach Erreichen einer Größe von ≥2 mm mit dem Tumorimpfstoff behandelt. Wir beobachteten eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums in der Gruppe der geimpften Mäuse ~2 Wochen nach der Tumorimplantation (Abbildung 1). Am Ende des Experiments isolierten wir die intratumoralen Immunzellen und analysier...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der Studie von Allisons Gruppe. Sie zeigten, dass die Kombination von B16-Flt3L-Impfstoff mit CTLA-4-Blockade einen synergistischen Effekt auf die Überlebensrate und das Tumorwachstum zeigte, während bei Mäusen, die den B16-Flt3L-Impfstoff oder die Anti-CTLA-4-Antikörperbehandlung allein erhielten, keine Verringerung des Tumorwachstums beobachtet wurde⁷. Neuere Studien haben einen neuartigen Treg-intrinsischen CTLA4-PKCη-Signalweg aufgedeckt, der ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200