מודל אימונותרפיה ניסיוני למלנומה באמצעות חיסון לגידול עם ציטוקין המטופויאטי

Summary

הפרוטוקול מציג מודל אימונותרפיה לסרטן באמצעות חיסון מבוסס תאים עם מלנומה B16-F10 המבטאת Flt3L. פרוטוקול זה מדגים את ההליכים, כולל הכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת צמיחת הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה.

Abstract

טירוזין קינאז 3 ליגנד דמוי FMS (Flt3L) הוא ציטוקין המטופויאטי המקדם הישרדות והתמיינות של תאים דנדריטיים (DCs). הוא שימש בחיסונים נגד גידולים כדי להפעיל חסינות מולדת ולהגביר את התגובות האנטי-סרטניות. פרוטוקול זה מדגים מודל טיפולי המשתמש בחיסון גידולי מבוסס תאים המורכב מתאי מלנומה B16-F10 המבטאים Flt3L יחד עם ניתוח פנוטיפי ותפקודי של תאי מערכת החיסון במיקרו-סביבה של הגידול (TME). מתוארים נהלים להכנת תאי גידול בתרבית, השתלת גידול, הקרנת תאים, מדידת גודל הגידול, בידוד תאי חיסון תוך-גופיים וניתוח ציטומטריה של זרימה. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפיה פרה-קליני מוצק לגידול, ופלטפורמת מחקר לחקר הקשר בין תאי הגידול לתאי מערכת החיסון החודרים. ניתן לשלב את פרוטוקול האימונותרפיה המתואר כאן עם שיטות טיפוליות אחרות, כגון חסימת מחסום חיסוני (נוגדנים נגד CTLA-4, אנטי-PD-1, אנטי-PD-L1) או כימותרפיה על מנת לשפר את ההשפעה הטיפולית לסרטן של מלנומה.

Introduction

אימונותרפיה של סרטן הוכרה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה המבוססת על תופעות הלוואי הפחות רעילות שלה ותגובות עמידות יותר. פותחו מספר סוגים של אימונותרפיות, כולל טיפולים בנגיף אונקוליטי, חיסונים לסרטן, טיפולי ציטוקינים, נוגדנים חד שבטיים, העברת תאים מאמצים (תאי CAR-T או CAR-NK) וחסימת מחסום חיסוני¹.

עבור חיסונים לסרטן, ישנן צורות שונות של חיסונים טיפוליים, כגון חיסונים מבוססי תאים שלמים, חיסונים נגד חלבונים או פפטידים, וחיסוני RNA או DNA. החיסון מסתמך על יכולתם של תאים המציגים אנטיגן (APCs) לעבד אנטיגנים סרטניים, כולל אנטיגנים ספציפיים לגידול, ולהציג אותם בצורה אימונוגנית לתאי T. תאים דנדריטיים (DCs) ידועים כנגמ"שים החזקים ביותר ומאמינים שהם ממלאים תפקיד חשוב בחסינות נגד גידולים ^2,3. תאים אלה קולטים ומעבדים אנטיגנים של גידולים, ולאחר מכן נודדים לבלוטות הלימפה המתנקזות (dLN) כדי להתחיל ולהפעיל תאי T אפקטור (Teff) ספציפיים לגידול באמצעות מעורבות של קולטן תאי T (TCR) ומולקולות קוסטימולטוריות. התוצאה היא התמיינות והרחבה של תאי T ציטוטוקסיים ספציפיים לגידול (CTL), אשר חודרים לגידול והורגים תאים סרטניים⁴. כתוצאה מכך, הפעלה והבשלה של DCs מייצגים אסטרטגיות אטרקטיביות כדי לעורר חסינות נגד אנטיגנים הגידול.

Flt3L ידוע כמקדם הבשלה והרחבה של DCs בוגרים מבחינה תפקודית המבטאים חלבוני MHC Class II, CD11c, DEC205 ו-CD86⁵. מתן תוך-ורידי, אך לא תוך-ורידי, של וקטור אדנו-וירוס המשלב את הגן Flt3L ( Adv-Flt3L ) הוכח כמקדם פעילות טיפולית חיסונית נגד גידולים אורתרוטופיים⁶. Flt3L שימש גם בחיסונים מבוססי תאי גידול המורכבים מתאי B16-F10 מוקרנים המבטאים ביציבות Flt3L מומרים רטרו-ויראליים כדרך לשפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים סרטניים על ידי DCs, ובכך להגדיל את תגובות האנטי-סרטניות. הפרוטוקול של חיסון גידול B16-Flt3L המתואר כאן מבוסס על מחקר שפורסם על ידי קבוצת⁷ של ד"ר ג'יימס אליסון. במאמר זה הם דיווחו כי חיסון B16-Flt3L בשילוב עם מצור CTLA-4 גרם באופן סינרגטי לדחייה של מלנומה מבוססת, וכתוצאה מכך להישרדות מוגברת.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מודל אימונותרפי פרה-קליני למלנומה. כאן מתוארים נהלים מפורטים של כיצד להכין ולהשתיל חיסונים לגידולים, וכיצד לנתח את הרכב ותפקוד תאי החיסון התוך-גופיים מגידול מוצק.

Protocol

כל העכברים ששימשו במחקר נשמרו ושוכנו בוויבריום של מכון לה ג'ולה לאימונולוגיה (LJI) בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים עם טמפרטורה ולחות מבוקרות. ניסויים בבעלי חיים נערכו עם נקבות C57BL/6 עכברות בנות 8-14 שבועות על פי הנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של LJI.

1. הכנת תאי גידול בתרבית להשתלה

1. תרבית B16-F10 תאי מלנומה במדיום של דולבקו מעובד (IMDM) של Iscove המכילה 10% FBS מומת בחום, 2 mM גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, 1 mM MEM חומצות אמינו לא חיוניות, ו-100 U/mL כל אחד של פניצילין וסטרפטומיצין. שמור על קו התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO₂.
2. זרעו 1.5-2 x 10⁶ תאי B16-F10 בבקבוקון 175T ובתרבית למשך יומיים. קציר תאים כאשר הם 75%-80% מפגש.
3. הסר את מדיום התרבית ושטוף את הבקבוקון פעם אחת עם PBS. שאפו PBS והוסיפו 5 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ואחריו טפחו בחוזקה על שפת בקבוק התרבות.
4. הוסף 15 מ"ל של מדיום תרבות כדי לנטרל את הטריפסין-EDTA ולשפוך את תוכן הבקבוקון לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל. לשטוף את פני השטח עם 10 מ"ל של PBS ויוצקים לתוך אותו צינור 50 מ"ל.
5. צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 200 x גרם. השליכו את הסופר-נטנט ושברו את כדור התא על ידי הקשה באצבע על תחתית הצינור.
6. הוסף קר 10 מ"ל של PBS בעדינות pipet את ההשעיה התא; לאחר מכן, לספור באופן ידני תאים באמצעות hemocytometer. שמור את התאים על הקרח לפני ההזרקה.

2. השתלת גידולים

1. מרדים עכברים בגז עם 5% איזופלוראן בקצב זרימת גז של 1.0 ליטר לדקה במכסה האדים. שנה את קצב הזרימה למינון תחזוקה של 2% איזופלוראן לאחר שהעכברים מורדמים במלואם. עבור פרוטוקול זה, ההרדמה בוצעה על ידי הווטרינר בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
2. לגלח את השיער בצד שמאל של העכברים ולעקר את אתר ההזרקה באמצעות מגבונים אלכוהוליים. באופן תוך-עורי (i.d.) משתילים תאי גידול B16-F10 ב-5 x 10^{5 תאים} ב-50 μL של PBS קר באגף שמאל באמצעות מחט של 30 גרם.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את המינון של תאי גידול B16-F10 מושתלים בטווח של 0.5-5 x 10^{5 תאים} להתפתחות מוצלחת של הגידול.
3. לאחר ההשתלה, יש למדוד את אורך ורוחב הגידול שלוש פעמים בשבוע באמצעות קליפר דיגיטלי אלקטרוני. חשב את נפח הגידול (מ"מ³) באמצעות הנוסחה:
   נפח הגידול (מ"מ³) = רוחב² × אורך × 0.5
   לטפל בעכברים עם חיסון הגידול כאשר הגידולים הגיעו לגודל של ≥2 מ"מ.
   הערה: גידולים בדרך כלל ניתן למדוד ביום 3 לאחר השתלה של 5 x 10 5^{תאים סרטניים}. קצב גדילה מהיר יותר של גידול B16-F10 נצפה בעכברים זכרים C57BL/6, Rag1-/-, או Rag2-/-γc-^/-. תצפית דומה תוארה במחקרים אחרים⁸. מומלץ לשמור על מין העכברים עקבי. עם זאת, שימו לב שה-NIH שם דגש על מין כמשתנה ביולוגי חשוב במחקר הביו-רפואי.

3. הכנה והזרקה של חיסון של תאי B16-F10 (B16-Flt3L) המבטאים Flt3L

1. שמור על תאי B16-Flt3L ב-DMEM המכילים 8% FBS מומת בחום, 2 mM גלוטמין ו-100 U/mL כל אחד של פניצילין וסטרפטומיצין בטמפרטורה של 37°C תחת 5% CO₂.
2. זרעו 1 x 10⁶ תאי B16-Flt3L בבקבוקון 175T ותרבית למשך יומיים. קציר תאים כאשר הם 75%-80% confluent כמתואר בשלבים 1.3 עד 1.6 ולהשהות 1 מ"ל של PBS קר.
3. להקרין תאים במינון של 150 Gy של קרני גמא באמצעות קרינת רנטגן עם הגדרת פרמטרים של 160 kV ו- 25 mA. לספור ולבדוק את כדאיות התא על ידי מכתים כחולים טריפאן לפני ההזרקה.
4. גזים מרדימים עכברים כפי שתואר קודם לכן ומעקרים את מקום ההזרקה באמצעות מגבוני אלכוהול. להזריק לעכברים 1 x 10 6 תאי B16-Flt3L מוקרנים ב-50 μL של PBS קר באותו אגף של השתלת הגידול המקורית, ~ 1 ס"מ מאתר הגידול הראשוני בימים 3,⁶ ו -9 לאחר השתלת התא הראשונית.
5. סמן את אתרי הזרקת החיסון בעט צבעוני כדי להבדיל אותו מהגידול הראשוני.
   הערה: אם 0.5 x 10⁵ תאי B16-F10 הושתלו לראשונה, מומלץ לבצע טיפול חיסוני בימים 8, 11 ו-14.

4. בידוד תאי חיסון תוך-גופיים

1. להקריב עכברים באמצעות CO₂ ונקע צוואר הרחם במכסה האדים בסוף הניסוי (ביום 15 לאחר השתלת הגידול; איור 1).
2. בניתוח להסיר את הגידול עם העור מכל עכבר ולשים אותו לתוך צלחת 24-well עם 1 מ"ל 10% FBS / RPMI-1640 בינוני. יבשו את הגידולים באמצעות מגבת נייר לפני שקילתה.
3. חותכים את הגידולים לחתיכות קטנות. מוסיפים 2 מ"ל של מאגר עיכול (100 מיקרוגרם/מ"ל TL ליבראז ו-200 מיקרוגרם/מ"ל DNase I במדיום RPMI-1640) ודוגרים במשך 25 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
4. יש להוסיף 10 מ"ל של 10% FBS/RPMI-1640 בינוני כדי לעצור את העיכול. מעבירים את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ"ל ומשתמשים בבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי לטחון רקמות על מסננת תאים של 40 מיקרומטר.
5. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש לתלות את הכדור ב-5 מ"ל של מדיום ספציפי בצפיפות של 40% ב-PBS, מדולל לריכוז של פי 1).
6. הוסף את תרחיף התא באיטיות על גבי 5 מ"ל של 80% מדיום ספציפי לשיפוע צפיפות המכיל PBS. צנטריפוגה של התאים בגודל 325 x g עם הגדרת בלמים נמוכה למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
7. לאחר צנטריפוגה, לאסוף בזהירות את שכבת לויקוציטים בממשק בין 40% ל 80% צפיפות ספציפית מדיום ספציפי ולהעביר אותו דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
8. לדגור את הכדור ב 2 מ"ל של תאי דם אדומים (RBC) lysis buffer במשך 5 דקות ב RT. לאחר הדגירה, הוסף 10 מ"ל של 10% FBS / RPMI-1640 בינוני כדי להרוות את מאגר ה- RBC lysis.
9. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השהה את התאים במדיום של 0.5 מ"ל של 10% FBS/RPMI-1640 וספור את מספר התאים הכולל לפני השימוש לניתוח נוסף.
   הערה: אסוף את הטחול או את ה-dLN כבקרות לאסטרטגיה של תת-קבוצות של תאי מערכת החיסון על-ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה. בצע את שיטת בידוד התאים כמתואר לעיל עם השינויים הבאים: השתמש בבוכנה של מזרק 1 מ"ל כדי לטחון רקמות על מסנן רשת 70 מיקרומטר. שטפו את הרקמה עם 10% FBS/RPMI-1640 בינוני כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים. Lyse את RBC כפי שתואר.

5. ניתוח ציטומטריה של זרימה

הערה: תאים שנאספו משכבת הלוקוציטים מכילים תאי חיסון ותאי גידול. מומלץ להשתמש בשני לוחות צביעה עצמאיים.

1. צביעת פני השטח
   1. מעבירים את התאים לצלחת תחתית בצורת V של 96 בארות. שטפו את התאים עם PBS והכתימו אותם בצבע כדאיות התאים (50-100 μL/well) למשך 15 דקות ב-RT.
   2. צנטריפוגה התאים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הכתימו את סמני פני השטח בנוגדנים מעורבים (דילול מפורט מסופק בטבלת החומרים) במאגר FACS (1% FBS ו-0.05% NaN₃ ב-PBS) למשך 30 דקות על קרח (50-100 μL/ well).
   3. צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם עם חיץ FACS פעמיים.
   4. תקן את התאים עם מאגר קיבוע תאים (50-100 μL / טוב) במשך 35 דקות על קרח. צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם פעמיים עם חיץ FACS.
   5. אחסן את הדגימות במאגר FACS (150-200 μL/tube) ב-4 °C והגן מפני אור. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה. עבור אוכלוסיית תאי DCs ותאי T, עקבו אחר אסטרטגיות הגידור המופיעות באיור 2B ובאיור 3A.
      הערה: להכתמה של DCs מיאלואידים, מומלץ לדגור על חוסם FC (Rat anti-mouse CD16/CD32) למשך 15 דקות על קרח לפני דגירה של נוגדנים על פני השטח (שלב 5.1.2).
2. ניתוח ציטוקינים על גירוי מחדש של ex vivo
   1. צלחת את התאים במדיום שלם (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7.2-7.6, 0.1 mM חומצת אמינו לא חיונית, 1 mM נתרן פירובט, 100 U/mL כל פניצילין וסטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol, ו 2 mM L-גלוטמין) ולעורר עם 50 ng/mL של PMA בתוספת 1 μM ionomycin בנוכחות מעכב הובלת חלבונים במשך 4 שעות ב 37 °C תחת 5% CO₂.
   2. ביצוע צביעת פני השטח עבור סמני פני השטח כמתואר לעיל בשלב 5.1.
   3. מוסיפים את תמיסת החדירה (50-100 μL/well) ומדגרים במשך 5 דקות ב-RT להכתמה תוך-תאית. דגירה של התאים עם נוגדנים ספציפיים לציטוקינים או חלבונים גרעיניים בתמיסת חלחול (50-100 μL/well) למשך 60 דקות על קרח או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   4. צנטריפוגה של התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם עם חיץ FACS פעמיים. אחסן את הדוגמאות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והגן מפני אור. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את דילול הנוגדנים לפי הצורך כדי להשיג צביעה מיטבית.

תוצאות

נקודה שחורה גלויה של תאי B16-F10 המושתלים נצפית בדרך כלל על פני העור ~ 3 ימים לאחר השתלת הגידול. עכברים מטופלים בחיסון הגידול 3, 6 ו -9 ימים לאחר שגולם הגידול הגיע לגודל של ≥2 מ"מ. ראינו ירידה משמעותית בצמיחת הגידול בקבוצת עכברים מחוסנים ~2 שבועות לאחר השתלת הגידול (איור 1). בסוף הניס?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על המחקר של קבוצתו של אליסון. הם הראו כי שילוב של חיסון B16-Flt3L עם חסימת CTLA-4 הראה השפעה סינרגטית על קצב ההישרדות וצמיחת הגידול, בעוד שלא נצפתה הפחתה בצמיחת הגידול בעכברים שקיבלו את החיסון B16-Flt3L או טיפול בנוגדנים נגד CTLA-4 בלבד⁷. מחקרים אחרונים חשפו מסלול ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200