Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Resumen

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Resumen

El ligando tirosina quinasa 3 similar a Fms (Flt3L) es una citocina hematopoyética que promueve la supervivencia y diferenciación de las células dendríticas (DC). Se ha utilizado en vacunas tumorales para activar la inmunidad innata y mejorar las respuestas antitumorales. Este protocolo demuestra un modelo terapéutico que utiliza una vacuna tumoral basada en células que consiste en células de melanoma B16-F10 que expresan Flt3L junto con análisis fenotípico y funcional de células inmunes en el microambiente tumoral (TME). Se describen los procedimientos para la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación de tumores, la irradiación celular, la medición del tamaño del tumor, el aislamiento de células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un modelo preclínico de inmunoterapia de tumores sólidos y una plataforma de investigación para estudiar la relación entre las células tumorales y las células inmunes infiltrantes. El protocolo de inmunoterapia descrito aquí se puede combinar con otras modalidades terapéuticas, como el bloqueo del punto de control inmunitario (anticuerpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la quimioterapia para mejorar el efecto terapéutico del melanoma en el cáncer.

Introducción

La inmunoterapia contra el cáncer ha sido reconocida como una estrategia terapéutica prometedora basada en sus efectos secundarios menos tóxicos y respuestas más duraderas. Se han desarrollado varios tipos de inmunoterapias, incluidas las terapias contra virus oncolíticos, vacunas contra el cáncer, terapias con citoquinas, anticuerpos monoclonales, transferencia adoptiva de células (células CAR-T o CAR-NK) y bloqueo del punto de control inmunitario¹.

Para las vacunas contra el cáncer, existen diferentes formas de vacunas terapéuticas, como las vacunas basadas en células completas, las vacunas de proteínas o péptidos ....

Protocolo

Todos los ratones utilizados en el estudio se mantuvieron y alojaron en el vivero del Instituto de Inmunología de La Jolla (LJI) en condiciones específicas libres de patógenos con temperatura y humedad controladas. Los experimentos con animales se realizaron con ratones hembra C57BL / 6 de 8-14 semanas de edad de acuerdo con las pautas y protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de LJI.

1. Preparación de células tumorales cultivadas para la implantación

1. Cultivo de células de melanoma B16-F10 en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) que contiene 10% de FBS inactivado por calor, 2 mM de gl....

Resultados

Un punto negro visible de las células B16-F10 implantadas generalmente se observa en la superficie de la piel ~ 3 días después de la implantación del tumor. Los ratones son tratados con la vacuna tumoral 3, 6 y 9 días después de que el nódulo tumoral haya alcanzado un tamaño de ≥2 mm. Observamos una reducción significativa en el crecimiento tumoral en el grupo de ratones vacunados ~ 2 semanas después de la implantación del tumor (Figura 1). Al final del experimento, aislamos las.......

Discusión

El protocolo descrito aquí se basa en el estudio del grupo de Allison. Demostraron que la combinación de la vacuna B16-Flt3L con el bloqueo de CTLA-4 mostró un efecto sinérgico sobre la tasa de supervivencia y el crecimiento tumoral, mientras que no se observó una reducción del crecimiento tumoral en ratones que recibieron la vacuna B16-Flt3L o el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 solos⁷. Estudios recientes han revelado una nueva vía de señalización CTLA4-PKCη intrínseca a Treg qu.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200