Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Resumen

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Resumen

El ligando tirosina quinasa 3 similar a Fms (Flt3L) es una citocina hematopoyética que promueve la supervivencia y diferenciación de las células dendríticas (DC). Se ha utilizado en vacunas tumorales para activar la inmunidad innata y mejorar las respuestas antitumorales. Este protocolo demuestra un modelo terapéutico que utiliza una vacuna tumoral basada en células que consiste en células de melanoma B16-F10 que expresan Flt3L junto con análisis fenotípico y funcional de células inmunes en el microambiente tumoral (TME). Se describen los procedimientos para la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación de tumores, la irradiación celular, la medición del tamaño del tumor, el aislamiento de células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un modelo preclínico de inmunoterapia de tumores sólidos y una plataforma de investigación para estudiar la relación entre las células tumorales y las células inmunes infiltrantes. El protocolo de inmunoterapia descrito aquí se puede combinar con otras modalidades terapéuticas, como el bloqueo del punto de control inmunitario (anticuerpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) o la quimioterapia para mejorar el efecto terapéutico del melanoma en el cáncer.

Introducción

La inmunoterapia contra el cáncer ha sido reconocida como una estrategia terapéutica prometedora basada en sus efectos secundarios menos tóxicos y respuestas más duraderas. Se han desarrollado varios tipos de inmunoterapias, incluidas las terapias contra virus oncolíticos, vacunas contra el cáncer, terapias con citoquinas, anticuerpos monoclonales, transferencia adoptiva de células (células CAR-T o CAR-NK) y bloqueo del punto de control inmunitario¹.

Para las vacunas contra el cáncer, existen diferentes formas de vacunas terapéuticas, como las vacunas basadas en células completas, las vacunas de proteínas o péptidos y las vacunas de ARN o ADN. La vacunación se basa en la capacidad de las células presentadoras de antígeno (APC) para procesar antígenos tumorales, incluidos los antígenos específicos del tumor, y presentarlos en forma inmunogénica a las células T. Se sabe que las células dendríticas (DC) son las APC más potentes y se cree que desempeñan un papel importante en la inmunidad antitumoral ^2,3. Estas células absorben y procesan antígenos tumorales, y luego migran a los ganglios linfáticos de drenaje (dLN) para preparar y activar las células T efectoras específicas del tumor (Teff) a través del compromiso del receptor de células T (TCR) y las moléculas coestimuladoras. Esto resulta en la diferenciación y expansión de las células T citotóxicas específicas del tumor (CTL), que se infiltran en el tumor y destruyen las células tumorales⁴. En consecuencia, la activación y maduración de las CD representan estrategias atractivas para estimular la inmunidad contra los antígenos tumorales.

Se sabe que Flt3L promueve la maduración y expansión de CD funcionalmente maduras que expresan proteínas MHC clase II, CD11c, DEC205 y CD86⁵. Se ha demostrado que la administración intratumoral, pero no intravenosa, de un vector de adenovirus que incorpora el gen Flt3L (Adv-Flt3L) promueve la actividad inmunoterapéutica contra los tumores ortrotópicos⁶. Flt3L también se ha utilizado en vacunas basadas en células tumorales que consisten en células B16-F10 irradiadas que expresan de manera estable Flt3L transducido retroviralmente como una forma de mejorar la presentación cruzada de antígenos tumorales por parte de las CD y, por lo tanto, aumentar las respuestas antitumorales. El protocolo de vacunación contra tumores B16-Flt3L descrito aquí se basa en un estudio publicado por el grupo⁷ del Dr. James Allison. En este documento, informaron que una vacuna B16-Flt3L combinada con el bloqueo de CTLA-4 indujo sinérgicamente el rechazo del melanoma establecido, lo que resultó en una mayor supervivencia.

El objetivo de este protocolo es proporcionar un modelo de inmunoterapia preclínica para el melanoma. Aquí, se describen procedimientos detallados de cómo preparar e implantar vacunas tumorales, y cómo analizar la composición y función de las células inmunes intratumorales de tumores sólidos.

Protocolo

Todos los ratones utilizados en el estudio se mantuvieron y alojaron en el vivero del Instituto de Inmunología de La Jolla (LJI) en condiciones específicas libres de patógenos con temperatura y humedad controladas. Los experimentos con animales se realizaron con ratones hembra C57BL / 6 de 8-14 semanas de edad de acuerdo con las pautas y protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de LJI.

1. Preparación de células tumorales cultivadas para la implantación

1. Cultivo de células de melanoma B16-F10 en el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) que contiene 10% de FBS inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de aminoácidos no esenciales MEM y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. Mantener la línea celular a 37 °C por debajo del 5% de_CO2.
2. Sembrar 1.5-2 x 10⁶ células B16-F10 en un matraz de 175T y cultivar durante 2 días. Cosechar células cuando son 75% -80% confluentes.
3. Retirar el medio de cultivo y lavar el matraz una vez con PBS. Aspirar PBS y añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,25% seguido de golpes fuertes en el borde del matraz de cultivo.
4. Añadir 15 ml de medio de cultivo para neutralizar la tripsina-EDTA y verter el contenido del matraz en un tubo de centrífuga de 50 ml. Lave la superficie del plato con 10 ml de PBS y vierta en el mismo tubo de 50 ml.
5. Centrifugar las células durante 5 min a 200 x g. Deseche el sobrenadante y rompa la bolita celular golpeando con el dedo la parte inferior del tubo.
6. Agregue 10 ml fríos de PBS y pipete suavemente la suspensión celular; Luego, cuente manualmente las células con hemocitómetro. Mantenga las células en hielo antes de la inyección.

2. Implantación del tumor

1. Anestesiar con gas a los ratones con isoflurano al 5% a un caudal de gas de 1,0 L por minuto en la campana extractora. Cambie el caudal a la dosis de mantenimiento de isoflurano al 2% una vez que los ratones estén completamente anestesiados. Para este protocolo, la anestesia fue realizada por el veterinario siguiendo las pautas institucionales de cuidado y uso de animales.
2. Afeite el pelo en el flanco izquierdo de los ratones y esterilice el lugar de la inyección con toallitas con alcohol. Implantar por vía intradérmica (i.d.) células tumorales B16-F10 a^{5 células en} 50 μL de PBS frío en el flanco izquierdo usando una aguja de 30 G.
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la dosis de células tumorales B16-F10 implantadas en el rango de 0.5-5 x 10⁵ células para un desarrollo exitoso del tumor.
3. Después de la implantación, mida la longitud y anchura del tumor tres veces a la semana con un calibrador digital electrónico. Calcule el volumen del tumor (mm³) usando la fórmula:
   Volumen tumoral (mm³) = anchura² × longitud × 0,5
   Tratar ratones con la vacuna tumoral cuando los tumores han alcanzado un tamaño de ≥2 mm.
   NOTA: Los tumores generalmente se pueden medir el día 3 después de la implantación de 5 x 10⁵ células tumorales. Se observó una tasa de crecimiento tumoral B16-F10 más rápida en ratones machos C57BL/6, Rag1-/^-, o Rag2-/-γc-/-. Una observación similar fue descrita en otros estudios⁸. Se recomienda mantener el sexo de los ratones consistente. Sin embargo, tenga en cuenta que el NIH pone énfasis en el sexo como una variable biológica importante en la investigación biomédica.

3. Preparación de la vacuna e inyección de células B16-F10 que expresan Flt3L (B16-Flt3L)

1. Mantener las células B16-Flt3L en DMEM que contienen 8% de FBS inactivado por calor, 2 mM de glutamina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina a 37 °C bajo 5% de_CO2.
2. Sembrar 1 x 10⁶ células B16-Flt3L en un matraz de 175T y cultivar durante 2 días. Recolectar células cuando estén 75% -80% confluentes como se describe en los pasos 1.3 a 1.6 y suspender en 1 ml de PBS frío.
3. Irradiar células a dosis de rayos gamma de 150 Gy utilizando un irradiador de rayos X con ajuste de parámetros de 160 kV y 25 mA. Contar y comprobar la viabilidad celular mediante tinción de azul de tripano antes de la inyección.
4. Anestesiar con gas a los ratones como se describió anteriormente y esterilizar el lugar de la inyección con toallitas con alcohol. Inyectar intradérmicamente a los ratones 1 x 10 6 células B16-Flt3L irradiadas en 50 μL de PBS frío en el mismo flanco que la implantación original del tumor, ~ 1 cm de distancia del sitio del tumor primario en los días 3,⁶ y 9 después de la implantación celular inicial.
5. Marque los sitios de inyección de la vacuna con una pluma de color para distinguirla del tumor primario.
   NOTA: Si inicialmente se implantan 0,5 x 10⁵ células B16-F10, se recomienda realizar el tratamiento con la vacuna los días 8, 11 y 14.

4. Aislamiento intratumoral de células inmunes

1. Sacrificar ratones usando_CO2 y dislocación cervical en la campana extractora al final del experimento (el día 15 después de la implantación del tumor; Figura 1).
2. Extirpar quirúrgicamente el tumor con la piel de cada ratón y colocarlo en una placa de 24 pocillos con 1 ml de medio FBS/RPMI-1640 al 10%. Seque los tumores con una toalla de papel antes de pesarla.
3. Cortar los tumores en trozos pequeños. Añadir 2 ml de tampón digestivo (100 μg/ml TL liberasa y 200 μg/ml DNasa I en medio RPMI-1640) e incubar durante 25 min a 37 °C.
4. Agregue 10 ml de medio FBS/RPMI-1640 al 10% para detener la digestión. Transfiera las células con una pipeta serológica de 25 ml y utilice el émbolo de una jeringa de 1 ml para moler tejido en un filtro de células de 40 μm.
5. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet en 5 mL de medio específico de gradiente de densidad al 40% en PBS, diluido a concentración 1x).
6. Agregue la suspensión celular lentamente sobre 5 ml de medio específico de gradiente de densidad al 80% que contenga PBS. Centrifugar las celdas a 325 x g con un ajuste de freno bajo durante 23 minutos a temperatura ambiente (RT).
7. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente la capa de leucocitos en la interfaz entre 40% y 80% de medio específico de gradiente de densidad y pásela a través de un filtro celular de 40 μm. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Incubar el pellet en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) durante 5 min a RT. Después de la incubación, agregue 10 ml de medio FBS/RPMI-1640 al 10% para apagar el tampón de lisis RBC.
9. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender las células en 0,5 ml de medio FBS/RPMI-1640 al 10% y contar el número total de células antes de su uso para su posterior análisis.
   NOTA: Recolectar el bazo o dLN como controles para la estrategia de gating de subconjuntos de células inmunes mediante análisis de citometría de flujo. Siga el método de aislamiento celular descrito anteriormente con los siguientes cambios: Utilice el émbolo de una jeringa de 1 ml para moler tejido en un filtro de malla de 70 μm. Lave el pañuelo con medio FBS/RPMI-1640 al 10% para obtener suspensiones unicelulares. Lisar el RBC como se describe.

5. Análisis de citometría de flujo

NOTA: Las células recolectadas de la capa de leucocitos contienen células inmunitarias y células tumorales. Se recomiendan dos paneles de tinción independientes.

1. Tinción superficial
   1. Transfiera las células a una placa inferior en forma de V de 96 pocillos. Lavar las células con PBS y teñirlas con colorante de viabilidad celular (50-100 μL/pocillo) durante 15 min a RT.
   2. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Manchar los marcadores de superficie con anticuerpos mixtos (la dilución detallada se proporciona en la Tabla de materiales) en tampón FACS (1% FBS y 0,05% NaN₃ en PBS) durante 30 min en hielo (50-100 μL/pocillo).
   3. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min y lavarlas con tampón FACS dos veces.
   4. Fijar las células con tampón de fijación celular (50-100 μL/pocillo) durante 35 min sobre hielo. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min y lavarlas dos veces con tampón FACS.
   5. Conservar las muestras en tampón FACS (150-200 μL/tubo) a 4 °C y protegerlas de la luz. Adquiera las muestras en un citómetro de flujo. Para la población de DC y células T, siga las estrategias de activación proporcionadas en la Figura 2B y la Figura 3A.
      NOTA: Para la tinción de CD mieloides, se recomienda incubar el bloqueador FC (rata anti-ratón CD16/CD32) durante 15 minutos en hielo antes de la incubación de anticuerpos de superficie (paso 5.1.2).
2. Análisis de citoquinas tras la reestimulación ex vivo
   1. Platear las células en medio completo (RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 10 mM de HEPES, pH 7.2-7.6, 0.1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/mL de cada penicilina y estreptomicina, 50 μM de 2-mercaptoetanol y 2 mM de L-glutamina) y estimular con 50 ng/mL de PMA más 1 μM de ionomicina en presencia de inhibidor del transporte de proteínas durante 4 h a 37 °C bajo 5% de_CO2.
   2. Realice la tinción de la superficie para los marcadores de superficie como se describe anteriormente en el paso 5.1.
   3. Añadir la solución de permeabilización (50-100 μL/pocillo) e incubar durante 5 min a RT para la tinción intracelular. Incubar las células con anticuerpos específicos para citocinas o proteínas nucleares en solución de permeabilización (50-100 μL/pocillo) durante 60 min en hielo o durante la noche a 4 °C.
   4. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min y lavarlas con tampón FACS dos veces. Conservar las muestras a 4 °C y protegerlas de la luz. Adquiera las muestras en un citómetro de flujo.
      NOTA: La dilución de anticuerpos puede tener que ajustarse según sea necesario para lograr una tinción óptima.

Resultados

Un punto negro visible de las células B16-F10 implantadas generalmente se observa en la superficie de la piel ~ 3 días después de la implantación del tumor. Los ratones son tratados con la vacuna tumoral 3, 6 y 9 días después de que el nódulo tumoral haya alcanzado un tamaño de ≥2 mm. Observamos una reducción significativa en el crecimiento tumoral en el grupo de ratones vacunados ~ 2 semanas después de la implantación del tumor (Figura 1). Al final del experimento, aislamos las...

Discusión

El protocolo descrito aquí se basa en el estudio del grupo de Allison. Demostraron que la combinación de la vacuna B16-Flt3L con el bloqueo de CTLA-4 mostró un efecto sinérgico sobre la tasa de supervivencia y el crecimiento tumoral, mientras que no se observó una reducción del crecimiento tumoral en ratones que recibieron la vacuna B16-Flt3L o el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA-4 solos⁷. Estudios recientes han revelado una nueva vía de señalización CTLA4-PKCη intrínseca a Treg qu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200