Modelo Experimental de Imunoterapia para Melanoma utilizando Vacinação Tumoral com Citocina Hematopoiética

Resumo

O protocolo apresenta um modelo de imunoterapia contra o câncer utilizando a vacinação tumoral baseada em células com melanoma B16-F10 expressando Flt3L. Este protocolo demonstra os procedimentos, incluindo a preparação de células tumorais cultivadas, implantação tumoral, irradiação celular, medição do crescimento tumoral, isolamento de células imunes intratumorais e análise de citometria de fluxo.

Resumo

O ligante tirosina quinase 3 semelhante ao Fms (Flt3L) é uma citocina hematopoiética que promove a sobrevivência e diferenciação de células dendríticas (DCs). Tem sido usado em vacinas tumorais para ativar a imunidade inata e melhorar as respostas antitumorais. Este protocolo demonstra um modelo terapêutico usando vacina tumoral baseada em células que consiste em células de melanoma B16-F10 expressando Flt3L, juntamente com análise fenotípica e funcional de células imunes no microambiente tumoral (TME). Procedimentos para preparação de células tumorais cultivadas, implantação de tumor, irradiação celular, medição do tamanho do tumor, isolamento intratumoral de células imunes e análise de citometria de fluxo são descritos. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um modelo pré-clínico de imunoterapia de tumores sólidos e uma plataforma de pesquisa para estudar a relação entre células tumorais e células imunes infiltrantes. O protocolo de imunoterapia aqui descrito pode ser combinado com outras modalidades terapêuticas, como bloqueio de checkpoint imunológico (anticorpos anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1) ou quimioterapia, a fim de melhorar o efeito terapêutico do melanoma sobre o câncer.

Introdução

A imunoterapia contra o câncer tem sido reconhecida como uma estratégia terapêutica promissora com base em seus efeitos colaterais menos tóxicos e respostas mais duráveis. Vários tipos de imunoterapias foram desenvolvidos, incluindo terapias com vírus oncolíticos, vacinas contra o câncer, terapias com citocinas, anticorpos monoclonais, transferência de células adotivas (células CAR-T ou CAR-NK) e bloqueio de ponto de verificação imune¹.

Para vacinas contra o câncer, existem diferentes formas de vacinas terapêuticas, como vacinas baseadas em células inteiras, vacinas de proteínas ou peptídeos e vacinas de RNA ou DNA. A vacinação baseia-se na capacidade das células apresentadoras de antígenos (APCs) de processar antígenos tumorais, incluindo antígenos específicos do tumor, e apresentá-los de forma imunogênica às células T. Sabe-se que as células dendríticas (DCs) são as APCs mais potentes e acredita-se que desempenhem um papel importante na imunidade antitumoral ^2,3. Essas células absorvem e processam antígenos tumorais e, em seguida, migram para os gânglios linfáticos drenantes (dLN) para preparar e ativar células efetoras T específicas do tumor (Teff) através do envolvimento do receptor de células T (TCR) e moléculas costimulatórias. Isso resulta na diferenciação e expansão das células T citotóxicas específicas do tumor (CTL), que se infiltram no tumor e matam as células tumorais⁴. Consequentemente, a ativação e a maturação das DO representam estratégias atraentes para estimular a imunidade contra antígenos tumorais.

Sabe-se que o Flt3L promove a maturação e expansão de CDs funcionalmente maduras que expressam as proteínas MHC classe II, CD11c, DEC205 e CD86⁵. A administração intratumoral, mas não intravenosa, de um vetor de adenovírus incorporando o gene Flt3L (Adv-Flt3L) demonstrou promover atividade imunoterapêutica contra tumores ortrotópicos⁶. O Flt3L também tem sido usado em vacinas baseadas em células tumorais que consistem em células B16-F10 irradiadas expressando de forma estável o Flt3L transduzido retroviralmente como forma de melhorar a apresentação cruzada de antígenos tumorais por CDs e, assim, aumentar as respostas antitumorais. O protocolo de vacinação contra o tumor B16-Flt3L descrito aqui é baseado em um estudo publicado pelo grupo⁷ do Dr. James Allison. Neste artigo, eles relataram que uma vacina B16-Flt3L combinada com o bloqueio CTLA-4 induziu sinergicamente a rejeição do melanoma estabelecido, resultando em aumento da sobrevida.

O objetivo deste protocolo é fornecer um modelo de imunoterapia pré-clínica para melanoma. Aqui, procedimentos detalhados de como preparar e implantar vacinas tumorais e como analisar a composição e a função das células imunes intratumorais do tumor sólido são descritos.

Protocolo

Todos os camundongos utilizados no estudo foram mantidos e alojados no biotério do Instituto de Imunologia de La Jolla (LJI) em condições específicas livres de patógenos com temperatura e umidade controladas. Experimentos em animais foram realizados com camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-14 semanas de idade de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo LJI Animal Care Committee.

1. Preparação de células tumorais cultivadas para implantação

1. Cultura de células de melanoma B16-F10 no meio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) contendo 10% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mM de aminoácidos não essenciais MEM e 100 U/mL de penicilina e estreptomicina. Manter a linhagem celular a 37 °C a 5% de CO₂.
2. Sementes 1,5-2 x 10⁶ células B16-F10 em balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colha as células quando elas são 75%-80% confluentes.
3. Retire o meio de cultura e lave o balão uma vez com PBS. Aspirar PBS e adicionar 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25%, seguido de bater duramente na borda do frasco de cultura.
4. Adicionar 15 ml de meio de cultura para neutralizar o EDTA de tripsina e deitar o conteúdo do balão num tubo de centrífuga de 50 ml. Lave a superfície do prato com 10 mL de PBS e despeje no mesmo tubo de 50 mL.
5. Centrifugar as células durante 5 min a 200 x g. Descarte o sobrenadante e quebre a pastilha celular batendo com o dedo no fundo do tubo.
6. Adicionar frio 10 mL de PBS e pipetar suavemente a suspensão celular; em seguida, conte manualmente as células usando hemocitômetro. Mantenha as células no gelo antes da injeção.

2. Implantação do tumor

1. O gás anestesia camundongos com isoflurano a 5% a uma taxa de fluxo de gás de 1,0 L por minuto no exaustor. Altere a taxa de fluxo para a dose de manutenção de isoflurano a 2%, uma vez que os ratos estejam totalmente anestesiados. Para este protocolo, a anestesia foi realizada pelo médico veterinário seguindo as diretrizes institucionais de cuidados e uso dos animais.
2. Raspe o cabelo no flanco esquerdo dos ratos e esterilize o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Implante intradérmico (i.d.) células tumorais B16-F10 em 5 x 10⁵ células em 50 μL de PBS frio no flanco esquerdo usando uma agulha 30 G.
   NOTA: A dose de células tumorais B16-F10 implantadas pode precisar ser ajustada na faixa de 0,5-5 x 10⁵ células para o desenvolvimento bem-sucedido do tumor.
3. Após o implante, meça o comprimento e a largura do tumor três vezes por semana usando um paquímetro digital eletrônico. Calcule o volume do tumor (mm³) usando a fórmula:
   Volume do tumor (mm³) = largura² × comprimento × 0,5
   Trate ratos com vacina contra tumores quando os tumores atingirem um tamanho de ≥2 mm.
   NOTA: Os tumores geralmente podem ser medidos no dia 3 após a implantação de 5 x 10⁵ células tumorais. Maior taxa de crescimento do tumor B16-F10 foi observada em camundongos machos C57BL/6, Rag1-/-, ou Rag2-/-γc-^/-. Observação semelhante foi descrita em outros estudos⁸. Recomenda-se manter o gênero dos ratos consistente. No entanto, note que o NIH coloca ênfase no sexo como uma variável biológica importante na pesquisa biomédica.

3. Preparação e injeção da vacina de células B16-F10 (B16-Flt3L) que expressam Flt3L

1. Manter as células B16-Flt3L em DMEM contendo 8% de FBS inativado pelo calor, 2 mM de glutamina e 100 U/mL cada de penicilina e estreptomicina a 37 °C sob 5% de CO₂.
2. Sementes 1 x 10⁶ células B16-Flt3L num balão de 175T e cultura durante 2 dias. Colhem as células quando estiverem 75%-80% confluentes, conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.6, e suspendam em 1 mL de PBS frio.
3. Irradiar células na dose de 150 Gy de raios gama utilizando Irradiador de Raios X com parametrização de 160 kV e 25 mA. Conte e verifique a viabilidade celular por coloração azul de tripano antes da injeção.
4. O gás anestesia os ratos conforme descrito anteriormente e esteriliza o local da injeção usando lenços umedecidos com álcool. Injetar intradermicamente os camundongos com 1 x 10 6 células B16-Flt3L irradiadas em 50 μL de PBS frio no mesmo flanco do implante tumoral original, ~1 cm de distância do local do tumor primário nos dias 3,⁶ e 9 após o implante celular inicial.
5. Marque os locais de injeção da vacina com uma caneta colorida para distingui-la do tumor primário.
   NOTA: Se 0,5 x 10⁵ células B16-F10 forem inicialmente implantadas, recomenda-se realizar o tratamento vacinal nos dias 8, 11 e 14.

4. Isolamento intratumoral de células imunes

1. Sacrificar camundongos usando CO₂ e luxação cervical no exaustor no final do experimento (no dia 15 após o implante do tumor; Figura 1).
2. Remova cirurgicamente o tumor com a pele de cada rato e coloque-o em placa de 24 poços com 1 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10%. Seque os tumores usando uma toalha de papel antes de pesá-lo.
3. Corte os tumores em pequenos pedaços. Adicionar 2 mL de tampão de digestão (100 μg/mL TL Liberase e 200 μg/mL DNase I em meio RPMI-1640) e incubar por 25 min a 37 °C.
4. Adicione 10 mL de 10% de meio FBS/RPMI-1640 para interromper a digestão. Transfira as células usando uma pipeta sorológica de 25 mL e use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro celular de 40 μm.
5. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 40% em PBS, diluído para concentração de 1x).
6. Adicione a suspensão celular lentamente em cima de 5 mL de meio específico de gradiente de densidade de 80% contendo PBS. Centrifugar as células a 325 x g com travagem baixa durante 23 minutos à temperatura ambiente (RT).
7. Após a centrifugação, coletar cuidadosamente a camada de leucócitos na interface entre 40% e 80% de meio específico de gradiente de densidade e passá-la através de um filtro celular de 40 μm. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
8. Incubar o pellet em 2 mL de tampão de lise de hemácias (hemácias) por 5 min no RT. Após a incubação, adicione 10 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% para extinguir o tampão de lise RBC.
9. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspender as células em 0,5 mL de meio FBS/RPMI-1640 a 10% e contar o número total de células antes do uso para análise posterior.
   NOTA: Coletar o baço ou dLN como controles para a estratégia de gating de subconjuntos de células imunes por análise de citometria de fluxo. Siga o método de isolamento celular descrito acima com as seguintes alterações: Use o êmbolo de uma seringa de 1 mL para moer o tecido em um filtro de malha de 70 μm. Lave o tecido com 10% de meio FBS/RPMI-1640 para obter suspensões unicelulares. Lyse o RBC como descrito.

5. Análise da citometria de fluxo

NOTA: As células coletadas da camada de leucócitos contêm células imunes e células tumorais. Recomendam-se dois painéis de coloração independentes.

1. Coloração de superfície
   1. Transfira as células para uma placa inferior em forma de V de 96 poços. Lave as células com PBS e manche-as com corante de viabilidade celular (50-100 μL/poço) por 15 min no RT.
   2. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Coloração dos marcadores de superfície com anticorpos mistos (diluição detalhada é fornecida na Tabela de Materiais) em tampão FACS (1% FBS e 0,05% NaN₃ em PBS) por 30 min em gelo (50-100 μL / poço).
   3. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes.
   4. Fixe as células com tampão de fixação celular (50-100 μL / poço) por 35 min no gelo. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 min e lavá-las duas vezes com tampão FACS.
   5. Armazenar as amostras em tampão FACS (150-200 μL/tubo) a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo. Para a população de CDs e células T, siga as estratégias de gating fornecidas na Figura 2B e na Figura 3A.
      NOTA: Para a coloração de CDs mielóides, recomenda-se a incubação do bloqueador FC (Rat anti-rato CD16/CD32) durante 15 minutos no gelo antes da incubação dos anticorpos de superfície (passo 5.1.2).
2. Análise de citocinas na reestimulação ex vivo
   1. Chapear as células em meio completo (RPMI-1640 suplementado com FBS a 10%, HEPES 10 mM, pH 7,2-7,6, aminoácido não essencial 0,1 mM, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/mL cada penicilina e estreptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanol e 2 mM L-glutamina) e estimular com 50 ng/mL de PMA mais 1 μM de ionomicina na presença de inibidor de transporte de proteínas por 4 h a 37 °C sob 5% de CO₂.
   2. Efectuar a coloração da superfície para os marcadores de superfície, conforme descrito acima no passo 5.1.
   3. Adicionar a solução de permeabilização (50-100 μL/poço) e incubar por 5 min no RT para coloração intracelular. Incubar as células com anticorpos específicos para citocinas ou proteínas nucleares em solução de permeabilização (50-100 μL/poço) durante 60 min no gelo ou durante a noite a 4 °C.
   4. Centrifugar as células a 500 x g durante 5 minutos e lavá-las com tampão FACS duas vezes. Conservar as amostras a 4 °C e proteger da luz. Adquira as amostras em um citômetro de fluxo.
      NOTA: A diluição de anticorpos pode ter que ser ajustada conforme necessário para realizar a coloração ideal.

Resultados

Um ponto preto visível das células B16-F10 implantadas é geralmente observado na superfície da pele ~ 3 dias após o implante do tumor. Os ratos são tratados com a vacina tumoral 3, 6 e 9 dias após o nódulo tumoral ter atingido um tamanho de ≥2 mm. Observamos uma redução significativa no crescimento tumoral no grupo de camundongos vacinados ~2 semanas após o implante do tumor (Figura 1). Ao final do experimento, isolamos as células imunes intratumorais e analisamos seu número e...

Discussão

O protocolo aqui descrito é baseado no estudo do grupo de Allison. Eles demonstraram que a combinação da vacina B16-Flt3L com o bloqueio CTLA-4 mostrou um efeito sinérgico na taxa de sobrevivência e no crescimento do tumor, enquanto nenhuma redução do crescimento tumoral foi observada em camundongos que receberam a vacina B16-Flt3L ou o tratamento com anticorpos anti-CTLA-4 isoladamente⁷. Estudos recentes revelaram uma nova via de sinalização CTLA4-PKCη intrínseca ao Treg que desempenha...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
10% heat-inactivated FBS	Omega Scientific	FB-02	Lot# 209018
30G needle	BD Biosciences	305106
96 well V-shape-bottom plate	SARSTEDT	83.3926.500
B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L)	Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI		Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1
B16-F10 cell lines	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Cytofix fixation buffer	BD Biosciences	BDB554655	Cell fixation buffer (4.2% PFA)
Cytofix/Cytoperm kit	BD Biosciences	554714	Fixation/Permeabilization Solution Kit
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM)	Corning	10013CV
Electronic digital caliper	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo software	Tree Star		Flow cytometer data analysis
GolgiStop (protein transport inhibitor)	BD Biosciences	554724	1:1500 dilution
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Ionomycin	Sigma	I0634
Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053
LSR-II cytometers	BD Biosciences		Flow cytometer
MEM nonessential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	density gradient specific medium
PMA	Sigma	P1585
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 medium	Corning	10-040-CV
RS2000 X-ray Irradiator	Rad Source Technologies
sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Sterile cell strainer 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
Sterile cell strainer 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua fixable viability kit	BioLegend	423101
Antibodies
Anti-mCD45	BioLegend	103135	Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200
Anti-mCD3ε	BioLegend	100327	Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200
Anti-mCD8	BioLegend	100730 100724	Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD4	BioLegend	100414	Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mFoxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100
Anti-m/hGzmB	BioLegend	372208	Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100
Anti-mIFNg	BioLegend	505826	Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD19	BioLegend	115543	Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100
Anti-mGr1	BioLegend	108423	Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200
Anti-mCD11b	BioLegend	101223	Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100
Anti-mF4/80	BioLegend	123114	Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100
Anti-mCD11c	BioLegend	117328	Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100
Anti-mMHCII	BioLegend	107622	Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400
Anti-mCD103	BioLegend	121410	Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200
Anti-mCD86	BioLegend	105007	Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200
FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32)	BD Biosciences	553141	Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200