JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج فأر تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني الناجم عن فوسفات الكالسيوم (AAA) لدراسة السمات المرضية والآليات الجزيئية ل AAAs.

Abstract

تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) هو مرض قلبي وعائي يهدد الحياة ويحدث في جميع أنحاء العالم ويتميز بتمدد لا رجعة فيه للشريان الأورطي البطني. حاليا ، يتم استخدام العديد من نماذج AAA المستحثة كيميائيا ، كل منها يحاكي جانبا مختلفا من التسبب في AAA. نموذج AAA الناجم عن فوسفات الكالسيوم هو نموذج سريع وفعال من حيث التكلفة مقارنة بنماذج AAA التي يسببها الأنجيوتنسين II والإيلاستاز. يؤدي تطبيق بلورات CaPO4 على الشريان الأورطي للفأر إلى تدهور الألياف المرنة ، وفقدان خلايا العضلات الملساء ، والالتهاب ، وترسب الكالسيوم المرتبط بتمدد الأبهر. تقدم هذه المقالة بروتوكولا قياسيا لنموذج AAA المستحث CaPO4. يتضمن البروتوكول تحضير المواد ، والتطبيق الجراحي ل CaPO4 على ظهور الشريان الأورطي البطني تحت الكلوي ، وحصاد الأبهر لتصور تمدد الأوعية الدموية الأبهري ، والتحليلات النسيجية في الفئران.

Introduction

تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) هو مرض قلبي وعائي قاتل يتميز بالتمدد الدائم للشريان الأورطي البطني ، مع ارتفاع معدلات الوفيات بمجرد حدوث التمزق. يرتبط AAA بالشيخوخة والتدخين وجنس الذكور وارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم1. ثبت أن العديد من العمليات المرضية تساهم في تكوين AAA ، بما في ذلك التحلل البروتيني لألياف المصفوفة خارج الخلية ، وتسلل الخلايا المناعية ، وفقدان خلايا العضلات الملساء الوعائية. حاليا ، لا تزال الآليات المرضية ل AAA بعيدة المنال ، ولا توجد أدوية مثبتة لعلاج AAA1. البحث في AAA البشري محدود بسبب وجود عدد قليل من عينات الأبهر البشري. وهكذا ، تم إنشاء العديد من نماذج AAA الحيوانية التي يسببها التعديل الكيميائي واعتمادها على نطاق واسع ، بما في ذلك ضخ الأنجيوتنسين II (AngII) تحت الجلد ، وحضانة الإيلاستاز حول الأوعية الدموية أو داخل اللمعة ، وتطبيق فوسفات الكالسيوم حول الأوعية الدموية2. نموذج الفأر الشائع الاستخدام هو تطبيق فوسفات الكالسيوم (CaPO4) على ظهور الشريان الأورطي البطني تحت الكلوي ، وهو فعال من حيث التكلفة ولا يتطلب تعديلا وراثيا.

تم الإبلاغ عن التطبيق المباشر حول الأبهر ل CaCl2 على الشريان السباتي للأرانب للحث على تغيير تمدد الأوعية الدموية في البداية بواسطة Gertz et al.3 وتم تطبيقه لاحقا على الأبهر البطني للفئران. تم تطوير النموذج بواسطة Yamanouchi et al. لتسريع تمدد الأبهر باستخدام بلورات CaPO 4 في الفئران4. يلخص تسلل CaPO4 إلى أورتاس الفئران العديد من السمات المرضية التي لوحظت في AAAs البشرية ، بما في ذلك تسلل البلاعم العميق ، وتدهور المصفوفة خارج الخلية ، وترسب الكالسيوم. عوامل الخطر من AAA البشري ، مثل فرط شحميات الدم ، تزيد أيضا من AAA الناجم عن CaPO4 في الفئران5. على عكس AAA الناجم عن التروية AngII في الفئران ApoE / - أو LDLR-/- ، يحدث AAA الناجم عن CaPO4 في منطقة الأبهر تحت الكلوي ، والتي تحاكي AAA البشري. حاليا ، تم تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع لتقييم القابلية لتطوير AAA في الفئران المعدلة وراثيا وتقييم الآثار المضادة ل AAA للأدوية 6,7.

Protocol

تم إجراء الدراسات على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في مركز العلوم الصحية بجامعة بكين وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الطب الحيوي بجامعة بكين (LA2015142). تم تخدير جميع الفئران للجراحة باستخدام إيزوفلوران (1.5٪ -2٪) ، وتم مراقبة التخدير بعناية لتجنب الألم أو الانزعاج للفئران.

1. التحضير

  1. قطع شرائح بعرض 0.3 سم من القفازات المطاطية الخالية من البودرة والشاش.
  2. شراء الفئران الذكور C57BL / 6J البالغ من العمر 8-10 أسابيع. إيواء الحيوانات في بيئة مكيفة مع دورة 12 ساعة من الضوء والظلام وحرية الوصول إلى الطعام والماء.
  3. الأوتوكلاف الشاش ومسحات القطن والمقص والملقط قبل الجراحة.
  4. احصل على البيتادين و 70٪ إيثانول وغسول اليدين المطهر.
  5. ارتد قناعا وثوبا وقفازات معقمة.

2. الإجراء الجراحي

  1. قم بتغذية أقراص كاربروفين القابلة للمضغ (جرعة 5 مجم / كجم) على ماوس C57BL / 6J يبلغ من العمر 8-10 أسابيع قبل 2-4 ساعات من الجراحة. بعد ذلك ، ضع الماوس في غرفة الحث (206 مم × 210 مم × 140 مم) مع إيزوفلوران بمعدل تدفق 1.5٪ -2٪.
    1. راقب الماوس لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يتباطأ التنفس بشكل واضح. تأكد من أن الفأر ليس لديه استجابة لتحفيز الألم قبل الجراحة.
  2. ضع مرهما للعيون على العينين وقدم الدعم الحراري مع وسادة تدفئة أو بطانية. تأكد من عمق التخدير بقرصة إصبع القدم كل 15 دقيقة أثناء العملية الجراحية.
  3. حلق شعر البطن من الماوس باستخدام المقص الكهربائي أو كريم إزالة الشعر. مسحة ومسح المنطقة المحلوقة مع البيتادين ، تليها 70 ٪ من الإيثانول ، عدة مرات في حركة دائرية. تغيير القفازات للحفاظ على العقم.
  4. استخدم المقص لعمل شق ~ 1.5 سم في أسفل البطن على طول خط الوسط في البطن.
  5. استخدم قطعة قطن معقمة مبللة بمحلول ملحي عادي لإزالة الأمعاء بعناية حتى يصبح الشريان الأورطي تحت الكلوي مرئيا.
  6. تشريح النسيج الضام والدهون من الشريان الأورطي تحت الكلوي لقسم حوالي 0.5 سم. لاحظ الأوعية الصغيرة إلى الجانب الظهري وتجنب تمزيقها. ليست هناك حاجة لفصل الشريان الأورطي البطني عن الوريد الرئيسي في البطن.
  7. احزم قطعة من شريط القفازات المطاطي المنقوع بالمحلول الملحي تحت الشريان الأورطي البطني والوريد الرئيسي البطني. استخدم قطعة قطن لمسح السوائل الزائدة.
  8. حزمة قطعة من الشاش غارقة مع 0.5 M CaCl2 على adventitia من الأوعية الدموية تحت البطن لمدة 10 دقائق. بالنسبة لمجموعة الماوس الوهمية ، استبدل 0.5 M CaCl2 بمحلول ملحي عادي.
  9. قم بإزالة الشاش وقم بتعبئة قطعة أخرى من الشاش المنقوع بمحلول PBS لمدة 5 دقائق لتوليد بلورات CaPO4 في الموقع في ظهور الشريان الأورطي.
  10. قم بإزالة شريط القفازات المطاطي والشاش بعناية. إعادة ضبط القناة المعوية للماوس.
  11. خياطة شق البطن والجلد مع خياطة 5-0.
  12. ضع الماوس على وسادة التدفئة حتى يستعيد الماوس وعيه. توفير السكن وتسكين الألم بعد الجراحة ، وفقا للجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.
  13. ضع الماوس لمدة 14 يوما أخرى. راقب الماوس عن كثب بعد الجراحة ولاحظ ما لا يقل عن 1x كل يوم بعد ذلك. إجراء التشريح على الفور إذا مات أي الفئران خلال هذه الفترة.

3. الحصاد لتصوير الأبهر

  1. بعد 14 يوما من الجراحة ، ضحي بالفئران باستخدام CO2.
  2. قطع فتح تجاويف الصدر والبطن الفأر بطنيا وقطع فتح الأذين الأيمن.
  3. قم بتغذية الفئران باستخدام المخزن المؤقت PBS من خلال البطين الأيسر للقلب لإزالة الدم في الشريان الأورطي ، ثم قم بالظهور مع 4٪ بارافورمالدهيد كما هو موضح سابقا8.
  4. حصاد الشريان الأورطي تحت المجسم.
  5. ضع الأورتا المحصودة في أنابيب تحتوي على 5 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 48 ساعة.
  6. قم بإزالة الأنسجة العرضية والدهون بعناية تحت المجسم وقم بتثبيت الشريان الأورطي على صفيحة شمعية سوداء بإبر الحشرات.
  7. الحصول على صور الأبهر.

4. تقييم تدهور الألياف المرنة

  1. قطع أنسجة تمدد الأوعية الدموية الأبهري إلى عمليات تجميد متسلسلة (بسمك 7 ميكرومتر).
  2. قم بتحليل الألياف المرنة باستخدام مجموعة تلطيخ فان جيسون (EVG) التجارية المرنة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. الصف تدهور الإيلاستين. الصف 1: تدهور <25٪ ؛ الصف 2: تدهور 25٪ إلى 50٪ ؛ الصف 3: تدهور 50٪ إلى 75٪ ؛ أو الصف 4: تدهور >75٪.

النتائج

بعد 14 يوما من تطبيق CaPO4 ، تم القتل الرحيم للفئران الذكور C57BL / 6J ، وتم حصاد وتنظيف الأورتا الخاصة بهم. تم تصوير مورفولوجيا الأورتا لتصور تشكيل AAA. كما هو موضح في الشكل 1A-B ، أدى تطبيق CaPO4 إلى تمدد الشريان الأورطي البطني تحت الكلوي. من الناحية النسيج...

Discussion

التطبيق حول الأبهر ل CaPO4 هو نهج قوي للحث على AAA في الفئران. استخدمت العديد من الدراسات نموذج CaPO4 وأفادت باستمرار أن هذه طريقة سريعة وقابلة للتكرار لدراسة AAA في الفئران 7,9. يعتبر هذا النموذج ملخصا لجزء من ميزات تمدد الأوعية الدموية الأبهري البشري وي...

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، 81730010 ، 91839302 ، 81921001 ، 31930056 ، و 91529203) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA 0801600).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CaCl2MECKLINC805225
NaClBiomedSH5001-01
PBSHARVEYBIOMB5051
Small animal ventilatorRWDH1550501-012

References

  1. Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
  2. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  3. Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
  4. Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
  5. Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
  6. Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
  7. Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21 (2022).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  9. Yu, B., et al. CYLD deubiquitinates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 contributing to adventitial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1698-1709 (2017).
  10. Altobelli, E., Rapacchietta, L., Profeta, V. F., Fagnano, R. Risk factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2805 (2018).
  11. Theivacumar, N. S., Stephenson, M. A., Mistry, H., Valenti, D. Diabetes mellitus and aortic aneurysm rupture: A favorable association. Vascular and Endovascular Surgery. 48 (1), 45-50 (2014).
  12. Tanaka, T., Takei, Y., Yamanouchi, D. Hyperglycemia suppresses calcium phosphate-induced aneurysm formation through inhibition of macrophage activation. Journal of the American Heart Association. 5 (3), 003062 (2016).
  13. Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
  14. Urry, D. W. Neutral sites for calcium ion binding to elastin and collagen: A charge neutralization theory for calcification and its relationship to atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (4), 810-814 (1971).
  15. Li, Z. Q., et al. Runx2 (runt-related transcription factor 2)-mediated microcalcification is a novel pathological characteristic and potential mediator of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (5), 1352-1369 (2020).
  16. Kelly, M. J., Igari, K., Yamanouchi, D. Osteoclast-like cells in aneurysmal disease exhibit an enhanced proteolytic phenotype. International Journal of Molecular Sciences. 20 (19), 4689 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved