Un modelo de aneurisma aórtico abdominal de ratón inducido por fosfato de calcio

Resumen

Este protocolo describe un modelo de ratón de aneurisma aórtico abdominal (AAA) inducido por fosfato de calcio para estudiar las características patológicas y los mecanismos moleculares de los AAA.

Resumen

Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una enfermedad cardiovascular potencialmente mortal que ocurre en todo el mundo y se caracteriza por una dilatación irreversible de la aorta abdominal. Actualmente, se utilizan varios modelos murinos AAA inducidos químicamente, cada uno simulando un aspecto diferente de la patogénesis de AAA. El modelo AAA inducido por fosfato de calcio es un modelo rápido y rentable en comparación con los modelos AAA inducidos por angiotensina II y elastasa. La aplicación de cristales de CaPO₄ a la aorta del ratón da como resultado la degradación de la fibra elástica, la pérdida de células musculares lisas, la inflamación y la deposición de calcio asociada con la dilatación aórtica. Este artículo presenta un protocolo estándar para el modelo AAA inducido por CaPO₄. El protocolo incluye la preparación de materiales, la aplicación quirúrgica del CaPO₄ a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal, la recolección de aortas para visualizar aneurismas aórticos y análisis histológicos en ratones.

Introducción

Un aneurisma aórtico abdominal (AAA) es una enfermedad cardiovascular letal caracterizada por la dilatación permanente de la aorta abdominal, con altas tasas de mortalidad una vez que se produce la ruptura. El AAA se asocia con el envejecimiento, el tabaquismo, el sexo masculino, la hipertensión y la hiperlipidemia¹. Se ha demostrado que varios procesos patológicos contribuyen a la formación de AAA, incluida la proteólisis de fibras de la matriz extracelular, la infiltración de células inmunes y la pérdida de células del músculo liso vascular. Actualmente, los mecanismos patológicos de AAA siguen siendo difíciles de alcanzar, y no hay medicamentos probados para el tratamiento de AAA¹. La investigación sobre AAA humanos es limitada debido a la existencia de pocas muestras de aorta humana; por lo tanto, se han establecido y adoptado ampliamente varios modelos animales AAA inducidos por modificación química, incluida la infusión subcutánea de angiotensina II (AngII), la incubación de elastasa perivascular o intraluminal y la aplicación de fosfato de calcio perivascular². Un modelo de ratón comúnmente utilizado es la aplicación de fosfato de calcio (CaPO₄) a la adventicia de la aorta abdominal infrarrenal, que es rentable y no requiere modificación genética.

La aplicación periaórtica directa de CaCl₂ a la arteria carótida de conejos para inducir un cambio aneurismático fue reportada inicialmente por Gertz et ^al.3 y posteriormente se aplicó a las aortas abdominales de ratones. El modelo fue desarrollado por Yamanouchi et al. para acelerar la dilatación aórtica mediante el uso de cristales de CaPO 4 en ratones₄. La infiltración de CaPO₄ en aortas de ratones recapitula muchas características patológicas observadas en AAA humanos, incluida la infiltración profunda de macrófagos, la degradación de la matriz extracelular y la deposición de calcio. Los factores de riesgo del AAA humano, como la hiperlipidemia, también aumentan el AAA inducido por CaPO₄ en ratones⁵. En contraste con el AAA inducido por perfusión AngII en ratones ApoE-/- o LDLR-^/-, el AAA inducido por CaPO₄ ocurre en la región aórtica infrarrenal, que imita el AAA humano. Actualmente, este método ha sido ampliamente aplicado para evaluar la susceptibilidad al desarrollo de AAA en ratones modificados genéticamente y evaluar los efectos anti-AAA de los fármacos ^6,7.

Protocolo

Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín y fueron aprobados por el Comité de Ética Biomédica de la Universidad de Pekín (LA2015142). Todos los ratones para cirugía fueron anestesiados con isoflurano (1,5%-2%), y la anestesia fue monitoreada cuidadosamente para evitar dolor o molestias para los ratones.

1. Preparación

1. Corte tiras de 0,3 cm de ancho de guantes de goma sin polvo y gasa.
2. Compre ratones machos C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad. Aloje a los animales en un ambiente climatizado con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso gratuito a alimentos y agua.
3. Autoclave la gasa, hisopos de algodón, tijeras y fórceps antes de la cirugía.
4. Obtenga betadina, etanol al 70% y lavado de manos antiséptico.
5. Póngase una máscara, bata y guantes estériles.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Alimente con tabletas masticables de carprofeno (dosis de 5 mg / kg) a un ratón C57BL / 6J de 8-10 semanas de edad 2-4 h antes de la cirugía. Luego, coloque el ratón en una cámara de inducción (206 mm x 210 mm x 140 mm) con isoflurano a un caudal de 1.5% -2%.
   1. Controle al ratón durante unos 5 minutos hasta que la respiración disminuya visiblemente. Asegúrese de que el ratón no tenga respuesta a la estimulación del dolor antes de la cirugía.
2. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos y proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica o una manta. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie cada 15 minutos durante el procedimiento quirúrgico.
3. Afeite el vello abdominal del ratón con una cortadora eléctrica o crema depilatoria. Frote y limpie el área afeitada con betadina, seguida de etanol al 70%, varias veces con movimientos circulares. Cámbiese los guantes para mantener la esterilidad.
4. Use tijeras para hacer una incisión de ~ 1.5 cm en la parte inferior del abdomen a lo largo de la línea media del abdomen.
5. Use un hisopo de algodón estéril humedecido con solución salina normal para extraer cuidadosamente el intestino hasta que la aorta infrarrenal sea visible.
6. Diseccionar el tejido conectivo y la grasa de la aorta infrarrenal durante una sección de aproximadamente 0,5 cm. Tenga en cuenta los pequeños vasos en el lado dorsal y evite rasgarlos. No hay necesidad de separar la aorta abdominal de la vena principal abdominal.
7. Empaque un pedazo de la tira de guante de goma empapada en solución salina debajo de la aorta abdominal y la vena principal abdominal. Use un hisopo de algodón para limpiar el exceso de líquido.
8. Empaque un trozo de gasa empapado con CaCl₂ 0.5 M en la adventicia de la vasculatura abdominal infrarrenal durante 10 min. Para el grupo de ratones simulados, sustituya el CaCl₂ de 0,5 M por solución salina normal.
9. Retire la gasa y empaque otra pieza de gasa empapada con solución de PBS durante 5 min para generar cristales de CaPO₄ in situ en la adventicia de la aorta.
10. Retire con cuidado la tira del guante de goma y la gasa. Restablezca el tracto intestinal del ratón.
11. Suturar la incisión abdominal y la piel con una sutura 5-0.
12. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica hasta que el ratón recupere la conciencia. Proporcionar alojamiento de recuperación del dolor postquirúrgico y analgesia, de acuerdo con el comité local de ética animal.
13. Aloja el ratón durante otros 14 días. Controle al ratón de cerca después de la cirugía y observe al menos 1 vez al día posteriormente. Realice una necropsia inmediatamente si algún ratón muere durante este período.

3. Recolección para imágenes de aortas

1. 14 días después de la cirugía, sacrifique a los ratones usando_CO2.
2. Abra las cavidades torácica y abdominal del ratón ventralmente y abra la aurícula derecha.
3. Perfundir los ratones con tampón PBS a través del ventrículo izquierdo del corazón para eliminar la sangre en la aorta, y luego perfundir con paraformaldehído al 4% como se describió anteriormente⁸.
4. Cosecha la aorta bajo el estereoscopio.
5. Coloque las aortas cosechadas en tubos que contengan 5 ml de paraformaldehído al 4% durante 48 h.
6. Retire el tejido adventicio y la grasa con cuidado debajo del estereoscopio y fije la aorta en una placa de cera negra con agujas para insectos.
7. Adquirir imágenes aórticas.

4. Evaluación de la degradación de las fibras elásticas

1. Cortar los tejidos del aneurisma aórtico en criosecciones seriadas (7 μm de espesor).
2. Analice las fibras elásticas utilizando un kit de tinción elástico comercial van Gieson (EVG) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
3. Grado de degradación de elastina. Grado 1: degradación del <25%; grado 2: degradación del 25% al 50%; grado 3: 50% a 75% de degradación; o grado 4: >75% de degradación.

Resultados

14 días después de la aplicación de CaPO₄, los ratones machos C57BL / 6J fueron sacrificados, y sus aortas fueron cosechadas y limpiadas. Se obtuvo una imagen de la morfología de las aortas para visualizar la formación de AAA. Como se muestra en la Figura 1A-B, la aplicación de CaPO₄ condujo a la dilatación de la aorta abdominal infrarrenal. Histológicamente, CaPO₄ resultó en una degradación dramática de las fibras...

Discusión

La aplicación periártica de CaPO₄ es un enfoque robusto para inducir AAA en ratones. Varios estudios han utilizado el modelo CaPO₄ y consistentemente informaron que este es un método rápido y reproducible para estudiar AAA en ratones ^7,9. Se considera que este modelo recapitula parte de las características del aneurisma aórtico humano y proporciona información mecanicista sobre la patogénesis AAA, incluida la inflamación y la degrad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012