磷酸钙诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

摘要

该协议描述了磷酸钙诱导的腹主动脉瘤（AAA）小鼠模型，以研究AAA的病理特征和分子机制。

摘要

腹主动脉瘤 （AAA） 是一种危及生命的心血管疾病，在世界范围内发生，其特征是腹主动脉不可逆扩张。目前，使用了几种化学诱导的鼠AAA模型，每个模型都模拟AAA发病机制的不同方面。与血管紧张素II和弹性蛋白诱导的AAA模型相比，磷酸钙诱导的AAA模型是一种快速且具有成本效益的模型。将CaPO₄ 晶体应用于小鼠主动脉会导致弹性纤维降解，平滑肌细胞丢失，炎症和与主动脉扩张相关的钙沉积。本文介绍了CaPO₄诱导的AAA模型的标准协议。该方案包括材料制备，将CaPO₄手术应用于肾下腹主动脉的外膜，收获主动脉以可视化主动脉瘤以及小鼠的组织学分析。

引言

腹主动脉瘤 （AAA） 是一种致命的心血管疾病，其特征是腹主动脉永久性扩张，一旦破裂，死亡率很高。AAA 与衰老、吸烟、男性、高血压和高脂血症有关¹。几种病理过程已被证明有助于AAA的形成，包括细胞外基质纤维蛋白水解，免疫细胞浸润和血管平滑肌细胞的丧失。目前，AAA的病理机制仍然难以捉摸，并且没有经过验证的药物治疗AAA¹。由于人类主动脉样本很少，对人类AAA的研究受到限制;因此，已经建立并广泛采用几种化学修饰诱导的动物AAA模型，包括皮下血管紧张素II（AngII）输注，血管周围或腔内弹性蛋白酶孵育以及血管周围磷酸钙应用²。常用的小鼠模型是将磷酸钙（CaPO₄）应用于肾下腹主动脉的外膜，具有成本效益且不需要基因修饰。

Gertz等人最初报道了将CaCl₂直接应用于兔颈动脉以诱导动脉瘤变化，后来应用于小鼠的腹主动脉。该模型由Yamanouchi等人开发，通过在小鼠^中使用CaPO 4晶体来加速主动脉扩张₄。CaPO₄浸润到小鼠主动脉中概括了在人类AAA中观察到的许多病理特征，包括深度巨噬细胞浸润，细胞外基质降解和钙沉积。人类AAA的危险因素，如高脂血症，也增加了CaPO₄诱导的小鼠^AAA5。与ApoE-/-或LDLR-^/-小鼠中AngII灌注诱导的AAA相反，CaPO₄诱导的AAA发生在肾下主动脉区域，其模拟人类AAA。目前，该方法已广泛应用于评估转基因小鼠对AAA发展的敏感性和评估药物^6，7的抗AAA作用。

研究方案

动物研究按照北京大学医学部机构动物护理与使用委员会的指导方针进行，并得到北京大学生物医学伦理委员会（LA2015142）的批准。所有用于手术的小鼠均用异氟醚（1.5%-2%）麻醉，并仔细监测麻醉以避免小鼠疼痛或不适。

1. 准备

1. 切下0.3厘米宽的无粉橡胶手套和纱布。
2. 购买8-10周龄的C57BL / 6J雄性小鼠。将动物安置在空调环境中，进行12小时的明暗循环，并免费获得食物和水。
3. 手术前高压灭菌纱布、棉签、剪刀和镊子。
4. 获取倍他定、70% 乙醇和消毒洗手液。
5. 戴上口罩、防护服和无菌手套。

2. 外科手术

1. 手术前2-4小时将咀嚼片卡洛芬片（5mg / kg剂量）喂给8-10周大的C57BL / 6J小鼠。然后，将小鼠置于含有异氟醚的诱导室（206mm x 210 mm x 140 mm）中，流速为1.5%-2%。
   1. 监测小鼠约5分钟，直到呼吸明显减慢。确保小鼠在手术前对疼痛刺激没有反应。
2. 在眼睛上涂抹眼药膏，并用加热垫或毯子提供热支持。在手术过程中，每15分钟用脚趾捏一下确认麻醉深度。
3. 使用电动剪或脱毛膏剃掉鼠标的腹毛。用甜菜碱擦拭并擦拭剃光区域，然后用70%乙醇打圈数次。更换手套以保持无菌。
4. 用剪刀沿着腹部中线在下腹部做一个~1.5厘米的切口。
5. 使用蘸有生理盐水的无菌棉签小心地取出肠道，直到可见肾下主动脉。
6. 从肾下主动脉解剖结缔组织和脂肪约 0.5 cm 切片。注意背侧的小血管，避免撕裂它们。无需将腹主动脉与腹主静脉分开。
7. 在腹主动脉和腹主静脉下包装一块盐水浸泡的橡胶手套条。使用棉签擦去多余的液体。
8. 在肾下腹部脉管系统的外罩上包装一块浸有0.5M CaCl₂ 的纱布10分钟。对于假小鼠组，用生理盐水替换0.5M CaCl₂ 。
9. 取下纱布并包装另一块浸有PBS溶液5分钟的纱布，以在主动脉外膜原位产生CaPO₄晶体。
10. 小心地取下橡胶手套条和纱布。重置鼠标的肠道。
11. 用5-0缝合缝合腹部切口和皮肤。
12. 将鼠标放在加热垫上，直到鼠标恢复意识。根据当地动物伦理委员会的说法，提供术后疼痛恢复住房和镇痛。
13. 将鼠标再放置 14 天。手术后密切监测小鼠，随后每天至少观察1次。如果在此期间有任何小鼠死亡，请立即进行尸检。

3. 采集用于主动脉成像

1. 手术后14天，使用CO₂处死小鼠。
2. 在腹侧切开小鼠胸腔和腹腔，切开右心房。
3. 通过心脏左心室向小鼠灌注PBS缓冲液以去除主动脉中的血液，然后如^前所述用4%多聚甲醛灌注8。
4. 在立体镜下收获主动脉。
5. 将收获的主动脉置于含有5mL 4%多聚甲醛的管中48小时。
6. 在立体镜下小心地去除外源组织和脂肪，并用昆虫针将主动脉钉在黑色蜡板上。
7. 获取主动脉图像。

4. 弹性纤维降解的评估

1. 将主动脉瘤组织切成连续冷冻切片（7μm厚）。
2. 根据制造商的方案，使用商用弹性货车 （EVG） 染色试剂盒分析弹性纤维。
3. 对弹性蛋白降解进行分级。1级:降解<25%;2 级:降解 25%-50%;3 级:降解 50% 至 75%;或 4 级:降解>75%。

结果

施用CaPO₄后14天，对C57BL/6J雄性小鼠实施安乐死，收获并清洁其主动脉。对主动脉的形态进行成像以可视化AAA形成。如图1A-B所示，CaPO₄的应用导致肾下腹主动脉扩张。在组织学上，CaPO₄导致弹性纤维的显着降解，如弹性蛋白断裂所示（图1C）。

讨论

CaPO₄的手术周围应用是在小鼠中诱导AAA的可靠方法。一些研究使用了CaPO₄模型，并一致报告说这是一种快速且可重复的方法来研究小鼠^的AAA7^，9。该模型被认为概括了人主动脉瘤的部分特征，并为AAA发病机制提供了机制见解，包括炎症和细胞外基质降解。

人类AAA的危险因素主要包括衰老、男性、吸烟、高脂血症、高?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012