Модель аневризмы брюшной аорты мыши, индуцированная фосфатом кальция

Резюме

Этот протокол описывает мышиную модель мышиной аневризмы брюшной аорты (ААА), индуцированную фосфатом кальция, для изучения патологических особенностей и молекулярных механизмов ААА.

Аннотация

Аневризма брюшной аорты (ААА) является опасным для жизни сердечно-сосудистым заболеванием, которое встречается во всем мире и характеризуется необратимым расширением брюшной аорты. В настоящее время используется несколько химически индуцированных мышиных моделей ААА, каждая из которых имитирует отдельный аспект патогенеза ААА. Модель ААА, индуцированная фосфатом кальция, является быстрой и экономически эффективной моделью по сравнению с моделями ААА, индуцированными ангиотензином II и эластазой. Применение кристаллов CaPO₄ к аорте мыши приводит к деградации эластичных волокон, потере гладкомышечных клеток, воспалению и отложению кальция, связанному с расширением аорты. В этой статье представлен стандартный протокол для модели ААА, индуцированной CaPO₄. Протокол включает подготовку материала, хирургическое применение CaPO₄ к адвентициям инфраренальной брюшной аорты, сбор аорты для визуализации аневризм аорты и гистологические анализы у мышей.

Введение

Аневризма брюшной аорты (ААА) является смертельным сердечно-сосудистым заболеванием, характеризующимся постоянным расширением брюшной аорты, с высокими показателями смертности после разрыва. ААА связана со старением, курением, мужским полом, гипертонией и гиперлипидемией¹. Было показано, что несколько патологических процессов способствуют образованию ААА, включая протеолиз волокон внеклеточного матрикса, инфильтрацию иммунных клеток и потерю гладкомышечных клеток сосудов. В настоящее время патологические механизмы ААА остаются неуловимыми, и не существует проверенных препаратов для лечения ААА¹. Исследования ААА человека ограничены из-за существования небольшого количества образцов аорты человека; таким образом, было создано и широко принято несколько моделей ААА животных, индуцированных химической модификацией, включая подкожную инфузию ангиотензина II (AngII), периваскулярную или внутрипросветную инкубацию эластазы и периваскулярное применение фосфата кальция². Широко используемой моделью мыши является применение фосфата кальция (CaPO₄) к адвентиции инфраренальной брюшной аорты, что является экономически эффективным и не требует генетической модификации.

Прямое периаортальное применение CaCl₂ к сонной артерии кроликов для индуцирования аневризмальных изменений первоначально сообщалось Gertz et ^al.3, а затем было применено к брюшной аорте мышей. Модель была разработана Yamanouchi et al. для ускорения расширения аорты с использованием кристаллов CaPO₄ у мышей⁴. Инфильтрация CaPO₄ в аорту мышей рекапитулирует многие патологические особенности, наблюдаемые в ААА человека, включая глубокую инфильтрацию макрофагов, деградацию внеклеточного матрикса и отложение кальция. Факторы риска ААА человека, такие как гиперлипидемия, также увеличивают CaPO 4-индуцированную ААА у мышей⁵. В отличие от AngII перфузионно-индуцированной ААА у мышей ApoE^-/- или LDLR^-/-, CaPO 4-индуцированная ААА встречается в инфраренальной аортальной области, которая имитирует ААА человека. В настоящее время этот метод широко применяется для оценки восприимчивости к развитию ААА у генетически модифицированных мышей и оценки анти-ААА эффектов препаратов ^6,7.

протокол

Исследования на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Научного центра здравоохранения Пекинского университета и были одобрены Комитетом по биомедицинской этике Пекинского университета (LA2015142). Всех мышей для операции анестезировали изофлураном (1,5%-2%), а анестезию тщательно контролировали, чтобы избежать боли или дискомфорта для мышей.

1. Подготовка

1. Вырежьте полоски резиновых перчаток и марли шириной 0,3 см.
2. Приобретите 8-10-недельных самцов мышей C57BL/6J. Размещайте животных в кондиционированной среде с 12-часовым циклом света и темноты и свободным доступом к пище и воде.
3. Автоклав марли, ватных тампонов, ножниц и щипцов перед операцией.
4. Получайте бетадин, 70% этанол и антисептическое средство для мытья рук.
5. Наденьте маску, халат и стерильные перчатки.

2. Хирургическая процедура

1. Кормите жевательными таблетками карпрофена (доза 5 мг/кг) 8-10-недельной мыши C57BL/6J за 2-4 ч до операции. Затем поместите мышь в индукционную камеру (206 мм х 210 мм х 140 мм) с изофлураном со скоростью потока 1,5%-2%.
   1. Наблюдайте за мышью около 5 минут, пока дыхание не будет заметно замедлено. Убедитесь, что мышь не реагирует на болевую стимуляцию перед операцией.
2. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза и обеспечьте тепловую поддержку грелкой или одеялом. Подтверждайте глубину анестезии ущемлением пальца ноги каждые 15 минут во время хирургической процедуры.
3. Сбрить волосы на животе мышки с помощью электрического машинки для стрижки или крема для удаления волос. Смазать и протереть выбритый участок бетадином, а затем 70% этанолом, несколько раз круговыми движениями. Меняйте перчатки, чтобы сохранить стерильность.
4. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез ~ 1,5 см в нижней части живота вдоль средней линии живота.
5. Используйте стерильный ватный тампон, смоченный нормальным физиологическим раствором, чтобы осторожно удалить кишечник до тех пор, пока не будет видна инфраренальная аорта.
6. Рассекните соединительную ткань и жир от инфраренальной аорты на участок примерно 0,5 см. Обратите внимание на мелкие сосуды к спинному борту и избегайте их разрыва. Нет необходимости отделять брюшную аорту от брюшной главной вены.
7. Упакуйте кусочек пропитанной физиологическим раствором резиновой полоски перчаток под брюшную аорту и брюшную основную вену. Используйте ватный тампон, чтобы вытереть лишнюю жидкость.
8. Уложить кусочек марли, пропитанный 0,5 М CaCl₂ на адвентицию инфраренальной брюшной сосудистой системы в течение 10 мин. Для фиктивной мышиной группы замените 0,5 M CaCl₂ обычным физиологическим раствором.
9. Снимите марлю и упакуйте еще один кусочек марли, пропитанный раствором PBS, в течение 5 минут, чтобы получить кристаллы CaPO₄ in situ в адвентиции аорты.
10. Аккуратно снимите резиновую полоску перчатки и марлю. Сброс кишечного тракта мыши.
11. Зашить разрез живота и кожу швом 5-0.
12. Поместите мышь на грелку до тех пор, пока мышь не придет в сознание. Обеспечить послеоперационное восстановление боли и обезболивание, согласно местному комитету по этике животных.
13. Разместите мышь еще на 14 дней. Внимательно следите за мышью после операции и наблюдайте не менее 1 раза каждый день впоследствии. Немедленно выполните некропсию, если в этот период погибнут мыши.

3. Сбор урожая для визуализации аорты

1. Через 14 дней после операции принесите в жертву мышей, используя CO₂.
2. Вентрально разрезать грудную и брюшную полости мыши и разрезать правое предсердие.
3. Перфузируйте мышей с буфером PBS через левый желудочек сердца для удаления крови в аорте, а затем перфьюируйте 4% параформальдегида, как описано ранее⁸.
4. Собирают аорту под стереоскопом.
5. Поместите заготовленную аорту в пробирки, содержащие 5 мл 4% параформальдегида, на 48 ч.
6. Аккуратно удалите адвентициальную ткань и жир под стереоскопом и прикрепите аорту к черной восковой пластине с помощью игл насекомых.
7. Получение изображений аорты.

4. Оценка деградации эластических волокон

1. Разрезать ткани аневризмы аорты на серийные криосекции (толщиной 7 мкм).
2. Проанализируйте эластичные волокна с помощью коммерческого комплекта для окрашивания эластичного фургона Gieson (EVG) в соответствии с протоколом производителя.
3. Сортировать деградацию эластина. Степень 1: деградация <25%; степень 2: деградация от 25% до 50%; степень 3: деградация от 50% до 75%; или степень 4: деградация >75%.

Результаты

Через 14 дней после применения CaPO₄ самцы мышей C57BL/6J были усыплены, а их аорты были собраны и очищены. Морфология аорты была изображена для визуализации образования ААА. Как показано на фиг.1А-В, применение CaPO₄ приводило к расширению инфраренал...

Обсуждение

Периаортальное применение CaPO₄ является надежным подходом к индуцированию ААА у мышей. В нескольких исследованиях использовалась модель CaPO₄ и последовательно сообщалось, что это быстрый и воспроизводимый метод изучения ААА у мышей ^7,9. Считает...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012