Kalsiyum Fosfat Kaynaklı Fare Abdominal Aort Anevrizması Modeli

Özet

Bu protokol, AAA'ların patolojik özelliklerini ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kalsiyum fosfata bağlı abdominal aort anevrizması (AAA) fare modelini tanımlamaktadır.

Özet

Abdominal aort anevrizması (AAA), tüm dünyada görülen, hayatı tehdit eden ve abdominal aortun geri dönüşümsüz genişlemesi ile karakterize kardiyovasküler bir hastalıktır. Günümüzde, her biri AAA'nın patogenezinin farklı bir yönünü simüle eden çeşitli kimyasal olarak indüklenmiş murin AAA modelleri kullanılmaktadır. Kalsiyum fosfat kaynaklı AAA modeli, anjiyotensin II ve elastaz kaynaklı AAA modellerine kıyasla hızlı ve uygun maliyetli bir modeldir. CaPO₄ kristallerinin fare aortuna uygulanması, elastik lif yıkımı, düz kas hücrelerinin kaybı, iltihaplanma ve aort dilatasyonu ile ilişkili kalsiyum birikimi ile sonuçlanır. Bu makalede, CaPO₄ kaynaklı AAA modeli için standart bir protokol tanıtılmaktadır. Protokol, materyal hazırlamayı, CaPO_4'ün infrarenal abdominal aortun adventitisine cerrahi olarak uygulanmasını, aort anevrizmalarını görselleştirmek için aortların toplanmasını ve farelerde histolojik analizleri içerir.

Giriş

Abdominal aort anevrizması (AAA), abdominal aortun kalıcı genişlemesi ile karakterize, rüptür meydana geldiğinde yüksek mortalite oranları olan ölümcül bir kardiyovasküler hastalıktır. AAA yaşlanma, sigara içme, erkek cinsiyet, hipertansiyon ve hiperlipidemi ile ilişkilidir¹. Hücre dışı matriks lif proteolizi, immün hücre infiltrasyonu ve vasküler düz kas hücrelerinin kaybı dahil olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerin AAA oluşumuna katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Şu anda, AAA'nın patolojik mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır ve AAA^1'in tedavisi için kanıtlanmış bir ilaç yoktur. İnsan AAA'sı üzerine yapılan araştırmalar, az sayıda insan aort örneğinin varlığı nedeniyle sınırlıdır; Bu nedenle, subkutan anjiyotensin II (AngII) infüzyonu, perivasküler veya intraluminal elastaz inkübasyonu ve perivasküler kalsiyum fosfat uygulaması² dahil olmak üzere çeşitli kimyasal modifikasyona bağlı hayvan AAA modelleri kurulmuş ve yaygın olarak benimsenmiştir. Yaygın olarak kullanılan bir fare modeli, infrarenal abdominal aortun adventitisine kalsiyum fosfatın (CaPO₄) uygulanmasıdır, bu da uygun maliyetlidir ve genetik modifikasyon gerektirmez.

Anevrizmal değişikliği indüklemek için tavşanların karotis arterine CaCl_2'nin doğrudan periaort uygulaması başlangıçta Gertz ve ^ark.3 tarafından bildirilmiş ve daha sonra farelerin abdominal aortlarına uygulanmıştır. Model, farelerde CaPO 4 kristalleri kullanılarak aort genişlemesini hızlandırmak için Yamanouchi ve ark.^tarafından geliştirilmiştir₄. CaPO_4'ün farelerin aortlarına infiltrasyonu, derin makrofaj infiltrasyonu, hücre dışı matriks yıkımı ve kalsiyum birikimi dahil olmak üzere insan AAA'larında gözlenen birçok patolojik özelliği özetler. Hiperlipidemi gibi insan AAA'sının risk faktörleri, farelerde CaPO₄ kaynaklı AAA'yı da arttırır⁵. ApoE-/- veya LDLR^-/- farelerde AngII perfüzyona bağlı AAA'nın aksine, CaPO₄ kaynaklı AAA, insan AAA'sını taklit eden infrarenal aort bölgesinde meydana gelir. Günümüzde bu yöntem, genetiği değiştirilmiş farelerde AAA gelişimine duyarlılığı değerlendirmek ve ilaçların anti-AAA etkilerini değerlendirmek için yaygın olarak uygulanmaktadır ^6,7.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pekin Üniversitesi Biyomedikal Etik Kurulu (LA2015142) tarafından onaylanmıştır. Ameliyat için tüm fareler izofluran (% 1.5 -% 2) ile uyuşturuldu ve fareler için ağrı veya rahatsızlıktan kaçınmak için anestezi dikkatle izlendi.

1. Hazırlık

1. 0,3 cm genişliğinde pudrasız lastik eldiven ve gazlı bez şeritlerini kesin.
2. 8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareleri satın alın. Hayvanları, 12 saatlik açık-karanlık döngüsünün yanı sıra yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayan klimalı bir ortamda barındırın.
3. Ameliyattan önce gazlı bez, pamuklu çubuklar, makas ve forsepsleri otoklav edin.
4. Betadin,% 70 etanol ve antiseptik el yıkama elde edin.
5. Bir maske, önlük ve steril eldivenler giyin.

2. Cerrahi prosedür

1. Ameliyattan 2-4 saat önce çiğnenebilir karprofen tabletlerini (5 mg / kg doz) 8-10 haftalık bir C57BL / 6J fareye besleyin. Ardından, fareyi% 1,5 -% 2'lik bir akış hızında izofluran içeren bir indüksiyon odasına (206 mm x 210 mm x 140 mm) yerleştirin.
   1. Solunum gözle görülür şekilde yavaşlayana kadar fareyi yaklaşık 5 dakika izleyin. Ameliyattan önce farenin ağrı stimülasyonuna yanıt vermediğinden emin olun.
2. Gözlere oftalmik bir merhem uygulayın ve bir ısıtma yastığı veya battaniye ile termal destek sağlayın. Cerrahi prosedür sırasında her 15 dakikada bir ayak parmağı tutamağı ile anestezi derinliğini onaylayın.
3. Farenin karın kıllarını elektrikli kesme makinesi veya epilasyon kremi kullanarak tıraş edin. Tıraş edilen bölgeyi betadin ile sürünceme, ardından dairesel bir hareketle birkaç kez% 70 etanol ile silin. Steriliteyi korumak için eldivenleri değiştirin.
4. Alt karın bölgesinde karın orta hattı boyunca ~ 1,5 cm'lik bir kesi yapmak için makas kullanın.
5. İnfrarenal aort görünene kadar bağırsağı dikkatlice çıkarmak için normal salin ile nemlendirilmiş steril bir pamuklu çubuk kullanın.
6. Bağ dokusunu ve yağını infrarenal aorttan yaklaşık 0.5 cm'lik bir kesit için diseke edin. Küçük damarları sırt tarafına not edin ve yırtılmaktan kaçının. Abdominal aortu abdominal ana venden ayırmaya gerek yoktur.
7. Salin batırılmış kauçuk eldiven şeridinin bir parçasını abdominal aort ve abdominal ana venin altına yerleştirin. Fazla sıvıyı silmek için pamuklu çubukla temizleyin.
8. İnfrarenal abdominal vaskülatürün adventitiasında 0,5 M CaCl₂ ile ıslatılmış bir gazlı bez parçasını 10 dakika boyunca paketleyin. Sahte fare grubu için 0,5 M CaCl_2'yi normal salin ile değiştirin.
9. Gazlı bezi çıkarın ve aortun adventitiasında in situ CaPO₄ kristalleri üretmek için 5 dakika boyunca PBS çözeltisi ile ıslatılmış başka bir gazlı bez parçası paketleyin.
10. Kauçuk eldiven şeridini ve gazlı bezi dikkatlice çıkarın. Farenin bağırsak sistemini sıfırlayın.
11. Karın kesisini ve cildi 5-0 dikişle dikin.
12. Fare bilincini yeniden kazanana kadar fareyi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Yerel hayvan etik komitesine göre, ameliyat sonrası ağrı iyileşme konutu ve analjezi sağlayın.
13. Fareyi 14 gün daha bekletin. Ameliyattan sonra fareyi yakından izleyin ve daha sonra her gün en az 1 kat gözlemleyin. Bu dönemde herhangi bir fare ölürse hemen bir nekropsi yapın.

3. Aortların görüntülenmesi için hasat

1. Ameliyattan 14 gün sonra, CO 2 kullanarak fareleri feda_edin.
2. Fare torasik ve abdominal boşluklarını ventralal olarak kesin ve sağ atriyumu açın.
3. Aorttaki kanı çıkarmak için PBS tamponu ile fareleri kalbin sol ventrikülünden geçirin ve daha sonra daha önce tarif edildiği gibi% 4 paraformaldehit ile perfüze^{edin 8}.
4. Aortu stereoskop altında hasat edin.
5. Hasat edilen aortları 48 saat boyunca 5 mL% 4 paraformaldehit içeren tüplere yerleştirin.
6. Adventitial dokuyu ve yağları stereoskop altında dikkatlice çıkarın ve aortu böcek iğneleriyle siyah bir balmumu plakasına sabitleyin.
7. Aort görüntüleri elde edin.

4. Elastik liflerin parçalanmasının değerlendirilmesi

1. Aort anevrizması dokularını seri kriyozitler halinde (7 μm kalınlığında) kesin.
2. Elastik elyafları, üreticinin protokolüne göre ticari bir elastik van Gieson (EVG) boyama kiti kullanarak analiz edin.
3. Elastin bozunmasını derecelendirin. Sınıf 1: <% 25 bozulma; sınıf 2:% 25 ila% 50 bozulma; sınıf 3:% 50 ila% 75 bozulma; veya sınıf 4: >75% bozulma.

Sonuçlar

CaPO_{4 uygulamasından 14} gün sonra, C57BL / 6J erkek fareleri ötenazi yapıldı ve aortları hasat edildi ve temizlendi. AAA oluşumunu görselleştirmek için aortların morfolojisi görüntülendi. Şekil 1A-B'de gösterildiği gibi, CaPO 4 uygulaması infrarenal abdominal aortun genişlemesine yol açmıştır. Histolojik olarak, CaPO₄, elastin kırılmaları ile gösterildiği gibi, elastik liflerin dramatik bir şekil...

Tartışmalar

CaPO_4'ün periaortik uygulaması, farelerde AAA'yı indüklemek için sağlam bir yaklaşımdır. Birkaç çalışma CaPO₄ modelini kullanmış ve sürekli olarak bunun farelerde AAA'yı incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu bildirmiştir ^7,9. Bu modelin insan aort anevrizmasının özelliklerinin bir kısmını özetlediği ve inflamasyon ve hücre dışı matriks yıkımı da dahil olmak üzere AAA patogenezi hak...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012