מודל מפרצת אבי העורקים בבטן הנגרמת על-ידי סידן פוספט על-ידי עכבר

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר של מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) המושרה על-ידי סידן פוספט, כדי לחקור את התכונות הפתולוגיות והמנגנונים המולקולריים של AAAs.

Abstract

מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) היא מחלה קרדיווסקולרית מסכנת חיים המתרחשת ברחבי העולם ומאופיינת בהתרחבות בלתי הפיכה של אבי העורקים הבטני. נכון לעכשיו, נעשה שימוש במספר מודלים של מורין AAA המושרים כימית, שכל אחד מהם מדמה היבט אחר של הפתוגנזה של AAA. מודל AAA המושרה על-ידי סידן פוספט הוא מודל מהיר וחסכוני בהשוואה למודלים של אנגיוטנסין II ואלסטאז המושרה על-ידי AAA. היישום של גבישי CaPO₄ על אבי העורקים של העכבר גורם לפירוק סיבים אלסטיים, אובדן תאי שריר חלק, דלקת ותצהיר סידן הקשור להתרחבות אבי העורקים. מאמר זה מציג פרוטוקול סטנדרטי עבור מודל AAA המושרה_{על-ידי CaPO 4}. הפרוטוקול כולל הכנה חומרית, היישום הכירורגי של CaPO₄ לאדוונטיטיה של אבי העורקים הבטני התת-קרקעי, קצירת אאורטות כדי לדמיין מפרצות אבי העורקים, וניתוחים היסטולוגיים בעכברים.

Introduction

מפרצת אבי העורקים הבטני (AAA) היא מחלה קרדיווסקולרית קטלנית המאופיינת בהתרחבות קבועה של אבי העורקים הבטני, עם שיעורי תמותה גבוהים לאחר התרחשות הקרע. AAA קשור להזדקנות, עישון, מין הגבר, יתר לחץ דם והיפרליפידמיה¹. מספר תהליכים פתולוגיים הוכחו כתורמים ליצירת AAA, כולל פרוטאוליזה של סיבי מטריצה חוץ-תאית, חדירת תאי מערכת החיסון ואובדן תאי שריר חלק של כלי הדם. נכון לעכשיו, המנגנונים הפתולוגיים של AAA נשארים חמקמקים, ואין תרופות מוכחות לטיפול ב- AAA¹. המחקר על AAA אנושי מוגבל בשל קיומן של דגימות אבי העורקים האנושיות המעטות; לפיכך, מספר מודלים של AAA בעלי חיים המושרים על ידי שינוי כימי הוקמו ואומצו באופן נרחב, כולל אינפוזיה תת-עורית אנגיוטנסין II (AngII), דגירה של אלסטאז פריווסקולרי או תוך-לומינלי, ויישום סידן פוספט פריווסקולרי². מודל עכבר נפוץ הוא יישום של סידן פוספט (CaPO₄) על אדוונטיטיה של אבי העורקים הבטני infrarenal, שהוא חסכוני ואינו דורש שינוי גנטי.

יישום פריאורטי ישיר של CaCl₂ לעורק הצוואר של ארנבות כדי לגרום לשינוי מפרצת דווח בתחילה על ידי Gertz et ^al.3 ומאוחר יותר הוחל על aortas הבטן של עכברים. המודל פותח על ידי Yamanouchi et al. כדי להאיץ התרחבות אבי העורקים על ידי שימוש בגבישי CaPO 4 בעכברים⁴. חדירה של CaPO₄ לעכברים משחזרת תכונות פתולוגיות רבות שנצפו ב-AAAs אנושיים, כולל חדירת מקרופאגים עמוקה, פירוק מטריצה חוץ-תאית ותצהיר סידן. גורמי הסיכון של AAA אנושי, כגון היפרליפידמיה, גם להגדיל את AAA המושרה על ידי CaPO₄ בעכברים⁵. בניגוד ל-AAA המושרה על-ידי AngII בעכברי ApoE-/- או LDLR-/- , AAA המושרה על-ידי CaPO₄ מתרחש באזור אבי העורקים התת-קרקעי, המחקה את ^ה-AAA האנושי. נכון לעכשיו, שיטה זו יושמה באופן נרחב כדי להעריך רגישות להתפתחות AAA בעכברים מהונדסים גנטית ולהעריך את ההשפעות האנטי-AAA של תרופות ^6,7.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת פקין ואושרו על ידי ועדת האתיקה הביו-רפואית של אוניברסיטת פקין (LA2015142). כל העכברים שנותחו הורדו באיזופלוראן (1.5%-2%), וההרדמה נותקה בקפידה כדי למנוע כאב או אי נוחות לעכברים.

1. הכנה

1. חותכים רצועות ברוחב 0.3 ס"מ של כפפות גומי וגזה ללא אבקה.
2. רכשו עכברים זכרים C57BL/6J בני 8-10 שבועות. שכנו את בעלי החיים בסביבה ממוזגת עם מחזור אור-חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ולמים.
3. אוטוקלאב את הגזה, מקלוני הכותנה, המספריים והמלקחיים לפני הניתוח.
4. יש להשיג בטאדין, 70% אתנול ושטיפת ידיים אנטיספטית.
5. לבשו מסכה, חלוק וכפפות סטריליות.

2. הליך כירורגי

1. יש להזין טבליות קרפרופן לעיסות (מינון של 5 מ"ג/ק"ג) לעכבר C57BL/6J בן 8-10 שבועות 2-4 שעות לפני הניתוח. לאחר מכן, הנח את העכבר בתא אינדוקציה (206 מ"מ x 210 מ"מ x 140 מ"מ) עם איזופלוראן בקצב זרימה של 1.5%-2%.
   1. נטר את העכבר במשך כ-5 דקות עד להאטת הנשימה באופן ניכר. ודא שלעכבר אין תגובה לגירוי כאב לפני הניתוח.
2. החל משחה אופטלמית על העיניים ולספק תמיכה תרמית עם כרית חימום או שמיכה. אשר את עומק ההרדמה עם צביטה בבוהן כל 15 דקות במהלך ההליך הכירורגי.
3. לגלח את שיער הבטן של העכבר באמצעות קוצץ חשמלי או קרם להסרת שיער. מטושים ומנגבים את האזור המגולח עם בטאדין, ואחריו 70% אתנול, מספר פעמים בתנועה מעגלית. החלף כפפות כדי לשמור על סטריליות.
4. השתמש במספריים כדי לבצע חתך של ~ 1.5 ס"מ בבטן התחתונה לאורך קו האמצע של הבטן.
5. השתמש צמר גפן סטרילי רטוב עם מלח רגיל כדי להסיר בזהירות את המעי עד אבי העורקים infrarenal גלוי.
6. נתחו את רקמת החיבור והשומן מאבי העורקים התת-קרקעי למשך כ-0.5 ס"מ. שימו לב לכלים הקטנים לצד הגבי והימנעו מקריעתם. אין צורך להפריד את אבי העורקים הבטני מווריד הבטן הראשי.
7. ארזו חתיכה מרצועת כפפת הגומי הספוגה במי מלח מתחת לאבי העורקים הבטני והווריד הראשי של הבטן. השתמשו בצמר גפן כדי לנגב את עודפי הנוזלים.
8. לארוז חתיכת גזה ספוג עם 0.5 M CaCl₂ על אדוונטיציה של כלי הדם בטן infrarenal במשך 10 דקות. עבור קבוצת עכברי הבושה, החלף את 0.5 M CaCl₂ בתמיסת מלח רגילה.
9. הסר את הגזה וארוז חתיכה נוספת של גזה ספוגה בתמיסת PBS למשך 5 דקות כדי ליצור גבישי CaPO₄ באתרם באדוונטיטיה של אבי העורקים.
10. הסר בזהירות את רצועת כפפת הגומי ואת גזה. אפס את מערכת העיכול של העכבר.
11. לתפור את החתך בבטן ואת העור עם תפר 5-0.
12. הניחו את העכבר על כרית חימום עד שהעכבר יחזור להכרה. לספק דיור התאוששות כאב לאחר הניתוח ושיכוך כאבים, על פי ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים.
13. הבית את העכבר במשך 14 ימים נוספים. עקוב אחר העכבר מקרוב לאחר הניתוח והתבונן לפחות 1x בכל יום לאחר מכן. בצע נמק מיד אם עכברים מתים במהלך תקופה זו.

3. קציר להדמיית אאורטות

1. 14 יום לאחר הניתוח, הקריבו את העכברים באמצעות CO₂.
2. חותכים לפתוח את עכבר החזה ואת חללי הבטן הגחון לחתוך לפתוח את אטריום ימין.
3. Perfuse העכברים עם חיץ PBS דרך החדר השמאלי של הלב כדי להסיר דם באבי העורקים, ולאחר מכן perfuse עם 4% paraformaldehyde כפי שתואר קודם^{לכן 8}.
4. קוצרים את אבי העורקים תחת הסטריאוסקופ.
5. מניחים את האאורטות שנקטפו בצינורות המכילים 5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד למשך 48 שעות.
6. הסר רקמת הרפתקנות ושומן בזהירות מתחת לסטריאוסקופ והצמד את אבי העורקים על צלחת שעווה שחורה עם מחטי חרקים.
7. לרכוש תמונות אבי העורקים.

4. הערכת השפלה של הסיבים האלסטיים

1. חותכים את רקמות המפרצת של אבי העורקים לקריותרציות סדרתיות (בעובי 7 מיקרומטר).
2. נתחו את הסיבים האלסטיים באמצעות ערכת צביעה מסחרית של ואן גייסון (EVG) על פי פרוטוקול היצרן.
3. ציון השפלת האלסטין. דרגה 1: השפלה של <25%; דרגה 2: השפלה של 25% עד 50%; ציון 3: 50% עד 75% השפלה; או כיתה ד': השפלה של >75%.

תוצאות

14 יום לאחר מריחת CaPO₄, העכברים הזכרים C57BL/6J הומתו, והאורטות שלהם נקטפו ונוקו. המורפולוגיה של האאורטות צולמה כדי להמחיש את היווצרות AAA. כפי שניתן לראות באיור 1A-B, היישום של CaPO₄ הוביל להתרחבות של אבי העורקים הבטני התת-קרקעי. מבחינה היסטולוגית, CaPO₄

Discussion

יישום פריאורטי של CaPO₄ הוא גישה חזקה להשראת AAA בעכברים. מספר מחקרים השתמשו במודל CaPO₄ ודיווחו בעקביות כי זוהי שיטה מהירה וניתנת לשחזור לחקר AAA בעכברים ^7,9. מודל זה נחשב לספיג חלק מהתכונות של מפרצת אבי העורקים האנושית ולספק תובנות מכניסטיות על פתוגנזה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012