Modèle d’anévrisme de l’aorte abdominale de souris induit par le phosphate de calcium

Résumé

Ce protocole décrit un modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale induit par le phosphate de calcium (AAA) pour étudier les caractéristiques pathologiques et les mécanismes moléculaires des AAA.

Résumé

Un anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une maladie cardiovasculaire potentiellement mortelle qui survient dans le monde entier et se caractérise par une dilatation irréversible de l’aorte abdominale. Actuellement, plusieurs modèles murins AAA induits chimiquement sont utilisés, chacun simulant un aspect différent de la pathogenèse de l’AAA. Le modèle AAA induit par le phosphate de calcium est un modèle rapide et rentable par rapport aux modèles AAA induits par l’angiotensine II et l’élastase. L’application de cristaux de CaPO₄ à l’aorte de la souris entraîne une dégradation des fibres élastiques, une perte de cellules musculaires lisses, une inflammation et un dépôt de calcium associé à la dilatation aortique. Cet article présente un protocole standard pour le modèle AAA induit par CaPO₄. Le protocole comprend la préparation du matériel, l’application chirurgicale du CaPO₄ à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale, la récolte des aortes pour visualiser les anévrismes de l’aorte et les analyses histologiques chez la souris.

Introduction

Un anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une maladie cardiovasculaire mortelle caractérisée par une dilatation permanente de l’aorte abdominale, avec des taux de mortalité élevés une fois la rupture survenue. L’AAA est associé au vieillissement, au tabagisme, au sexe masculin, à l’hypertension et à l’hyperlipidémie¹. Il a été démontré que plusieurs processus pathologiques contribuent à la formation d’AAA, notamment la protéolyse des fibres de la matrice extracellulaire, l’infiltration des cellules immunitaires et la perte des cellules musculaires lisses vasculaires. Actuellement, les mécanismes pathologiques de l’AAA restent insaisissables et il n’existe aucun médicament éprouvé pour le traitement de l’AAA¹. La recherche sur l’AAA humain est limitée en raison de l’existence de peu d’échantillons aortiques humains; ainsi, plusieurs modèles AAA animaux induits par des modifications chimiques ont été établis et largement adoptés, y compris la perfusion sous-cutanée d’angiotensine II (AngII), l’incubation périvasculaire ou intraluminale d’élastase et l’application périvasculaire de phosphate^{de calcium 2}. Un modèle murin couramment utilisé est l’application de phosphate de calcium (CaPO₄) à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale, ce qui est rentable et ne nécessite pas de modification génétique.

L’application périaortique directe de CaCl₂ sur l’artère carotide de lapins pour induire un changement anévrysmal a été initialement rapportée par Gertz et ^al.3 et a ensuite été appliquée aux aortes abdominales de souris. Le modèle a été développé par Yamanouchi et al. pour accélérer la dilatation aortique en utilisant des cristaux CaPO 4 chez la souris⁴. L’infiltration de CaPO₄ dans les aortes de souris récapitule de nombreuses caractéristiques pathologiques observées chez les AAA humains, notamment l’infiltration profonde des macrophages, la dégradation de la matrice extracellulaire et le dépôt de calcium. Les facteurs de risque de l’AAA humain, tels que l’hyperlipidémie, augmentent également l’AAA induit par CaPO₄ chez la souris⁵. Contrairement à l’AAA induit par la perfusion AngII chez les souris ApoE-/- ou LDLR^-/-, l’AAA induit par CaPO 4 se produit dans la région aortique infrarénale, qui imite l’AAA humain. Actuellement, cette méthode a été largement appliquée pour évaluer la sensibilité au développement de l’AAA chez les souris génétiquement modifiées et évaluer les effets anti-AAA des médicaments ^6,7.

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Protocole

Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin et ont été approuvées par le Comité d’éthique biomédicale de l’Université de Pékin (LA2015142). Toutes les souris pour la chirurgie ont été anesthésiées avec de l’isoflurane (1,5%-2%), et l’anesthésie a été soigneusement surveillée pour éviter la douleur ou l’inconfort pour les souris.

1. Préparation

1. Coupez des bandes de 0,3 cm de large de gants en caoutchouc sans poudre et de gaze.
2. Achetez des souris mâles C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines. Hébergez les animaux dans un environnement climatisé avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
3. Autoclavez la gaze, les cotons-tiges, les ciseaux et les forceps avant la chirurgie.
4. Procurez-vous de la bétadine, de l’éthanol à 70 % et un lavage antiseptique des mains.
5. Mettez un masque, une blouse et des gants stériles.

2. Intervention chirurgicale

1. Donnez des comprimés de carprofène à croquer (dose de 5 mg/kg) à une souris C57BL/6J âgée de 8 à 10 semaines 2 à 4 h avant la chirurgie. Ensuite, placez la souris dans une chambre d’induction (206 mm x 210 mm x 140 mm) avec de l’isoflurane à un débit de 1,5% à 2%.
   1. Surveillez la souris pendant environ 5 minutes jusqu’à ce que la respiration soit visiblement ralentie. Assurez-vous que la souris n’a pas de réponse à la stimulation de la douleur avant la chirurgie.
2. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et fournissez un soutien thermique avec un coussin chauffant ou une couverture. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement d’orteil toutes les 15 minutes pendant l’intervention chirurgicale.
3. Rasez les poils abdominaux de la souris à l’aide d’une tondeuse électrique ou d’une crème dépilatoire. Écouvillonnez et essuyez la zone rasée avec de la bétadine, suivie d’éthanol à 70%, plusieurs fois dans un mouvement circulaire. Changez de gants pour maintenir la stérilité.
4. Utilisez des ciseaux pour faire une incision de ~ 1,5 cm au bas de l’abdomen le long de la ligne médiane de l’abdomen.
5. Utilisez un coton-tige stérile humidifié avec une solution saline normale pour retirer soigneusement l’intestin jusqu’à ce que l’aorte infrarénale soit visible.
6. Disséquer le tissu conjonctif et la graisse de l’aorte infrarénale pour une section d’environ 0,5 cm. Remarquez les petits vaisseaux du côté dorsal et évitez de les déchirer. Il n’est pas nécessaire de séparer l’aorte abdominale de la veine principale abdominale.
7. Emballez un morceau de la bande de gants en caoutchouc imbibée de solution saline sous l’aorte abdominale et la veine principale abdominale. Utilisez un coton-tige pour essuyer l’excès de liquide.
8. Emballez un morceau de gaze imbibé de 0,5 M de CaCl₂ sur l’adventice du système vasculaire abdominal infrarénal pendant 10 min. Pour le groupe des souris factices, remplacer le CaCl₂ 0,5 M par une solution saline normale.
9. Retirez la gaze et emballez un autre morceau de gaze imbibé de solution de PBS pendant 5 minutes pour générer des cristaux de CaPO₄ in situ dans l’adventice de l’aorte.
10. Retirez délicatement la bande de gants en caoutchouc et la gaze. Réinitialisez le tractus intestinal de la souris.
11. Suturer l’incision abdominale et la peau avec une suture 5-0.
12. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Fournir un logement de récupération de la douleur postopératoire et une analgésie, selon le comité local d’éthique animale.
13. Hébergez la souris pendant encore 14 jours. Surveillez la souris de près après la chirurgie et observez-la au moins 1x chaque jour par la suite. Effectuez une nécropsie immédiatement si des souris meurent pendant cette période.

3. Récolte pour l’imagerie des aortes

1. 14 jours après la chirurgie, sacrifiez les souris en utilisant du CO₂.
2. Coupez les cavités thoracique et abdominale de la souris ventralement et ouvrez l’oreillette droite.
3. Perfuser les souris avec un tampon PBS à travers le ventricule gauche du cœur pour éliminer le sang dans l’aorte, puis perfuser avec 4% de paraformaldéhyde comme décrit précédemment⁸.
4. Récoltez l’aorte sous le stéréoscope.
5. Placer les aortes récoltées dans des tubes contenant 5 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h.
6. Enlevez soigneusement le tissu adventice et la graisse sous le stéréoscope et épinglez l’aorte sur une plaque de cire noire avec des aiguilles d’insectes.
7. Acquérir des images aortiques.

4. Evaluation de la dégradation des fibres élastiques

1. Couper les tissus anévrismaux de l’aorte en cryosections en série (7 μm d’épaisseur).
2. Analysez les fibres élastiques à l’aide d’un kit de coloration élastique commercial van Gieson (EVG) selon le protocole du fabricant.
3. Classer la dégradation de l’élastine. Grade 1 : dégradation de <25 %; grade 2 : dégradation de 25 % à 50 %; grade 3 : dégradation de 50 % à 75 %; ou grade 4 : dégradation de >75 %.

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Résultats

14 jours après l’application de CaPO₄, les souris mâles C57BL/6J ont été euthanasiées et leurs aortes ont été récoltées et nettoyées. La morphologie des aortes a été imagée pour visualiser la formation d’AAA. Comme le montre la figure 1A-B, l’application de CaPO₄ a entraîné une dilatation de l’aorte abdominale infrarénale. Histologiquement, CaPO₄ a entraîné une dégradation spectaculaire des fibres ?...

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Discussion

L’application périaortique de CaPO₄ est une approche robuste pour induire l’AAA chez la souris. Plusieurs études ont utilisé le modèle CaPO₄ et ont systématiquement rapporté qu’il s’agit d’une méthode rapide et reproductible pour étudier l’AAA chez la souris ^7,9. Ce modèle est considéré comme récapitulant une partie des caractéristiques de l’anévrisme de l’aorte humaine et fournissant des informations mécaniste...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012