Ein Calciumphosphat-induziertes Maus-Bauchaortenaneurysma-Modell

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Calciumphosphat-induziertes Bauchaortenaneurysma (AAA) Mausmodell, um die pathologischen Merkmale und molekularen Mechanismen von AAAs zu untersuchen.

Zusammenfassung

Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) ist eine lebensbedrohliche Herz-Kreislauf-Erkrankung, die weltweit auftritt und durch eine irreversible Erweiterung der Bauchaorta gekennzeichnet ist. Derzeit werden mehrere chemisch induzierte murine AAA-Modelle verwendet, die jeweils einen anderen Aspekt der Pathogenese von AAA simulieren. Das Calciumphosphat-induzierte AAA-Modell ist ein schnelles und kostengünstiges Modell im Vergleich zu den Angiotensin-II- und Elastase-induzierten AAA-Modellen. Die Anwendung von CaPO_4-Kristallen auf die Aorta der Maus führt zu elastischem Faserabbau, Verlust glatter Muskelzellen, Entzündungen und Kalziumablagerungen im Zusammenhang mit Aortendilatation. In diesem Artikel wird ein Standardprotokoll für das CaPO 4-induzierte AAA-Modell vorgestellt. Das Protokoll umfasst die Materialvorbereitung, die chirurgische Anwendung des CaPO₄ auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta, die Entnahme von Aorten zur Visualisierung von Aortenaneurysmen und histologische Analysen an Mäusen.

Einleitung

Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) ist eine tödliche kardiovaskuläre Erkrankung, die durch eine dauerhafte Erweiterung der Bauchaorta gekennzeichnet ist, mit hohen Sterblichkeitsraten nach einer Ruptur. AAA ist mit Alterung, Rauchen, männlichem Geschlecht, Bluthochdruck und Hyperlipidämie^{assoziiert 1}. Es wurde gezeigt, dass mehrere pathologische Prozesse zur AAA-Bildung beitragen, einschließlich extrazellulärer Matrixfaserproteolyse, Immunzellinfiltration und Verlust von vaskulären glatten Muskelzellen. Derzeit sind die pathologischen Mechanismen von AAA schwer fassbar, und es gibt keine bewährten Medikamente zur Behandlung von AAA¹. Die Erforschung der menschlichen AAA ist aufgrund der Existenz weniger menschlicher Aortenproben begrenzt; Daher wurden mehrere chemische Modifikationsinduzierte tierische AAA-Modelle etabliert und weit verbreitet, einschließlich subkutaner Angiotensin II (AngII) -Infusion, perivaskulärer oder intraluminaler Elastase-Inkubation und perivaskulärer Calciumphosphatanwendung². Ein häufig verwendetes Mausmodell ist die Anwendung von Calciumphosphat (CaPO₄) auf die Adventitia der infrarenalen Bauchaorta, die kostengünstig ist und keine genetische Veränderung erfordert.

Die direkte periaortale Applikation von CaCl₂ auf die Halsschlagader von Kaninchen zur Induktion einer aneurysmatischen Veränderung wurde ursprünglich von Gertz et ^al.3 berichtet und später auf die Bauchaorten von Mäusen angewendet. Das Modell wurde von Yamanouchi et al. entwickelt, um die Aortendilatation unter Verwendung von CaPO 4-Kristallen in Mäusen^zu beschleunigen₄. Die Infiltration von CaPO₄ in die Aorten von Mäusen rekapituliert viele pathologische Merkmale, die bei menschlichen AAAs beobachtet wurden, einschließlich tiefgreifender Makrophageninfiltration, extrazellulärem Matrixabbau und Kalziumablagerung. Die Risikofaktoren für menschliche AAA, wie Hyperlipidämie, erhöhen auch CaPO 4-induzierte AAA bei Mäusen⁵. Im Gegensatz zu AngII-perfusionsinduzierter AAA bei ApoE-/- oder LDLR-/- Mäusen tritt CaPO ^4-induzierte AAA in der infrarenalen Aortenregion auf, die menschliche AAA nachahmt. Derzeit wird diese Methode häufig angewendet, um die Anfälligkeit für die Entwicklung von AAA bei genetisch veränderten Mäusen zu bewerten und die Anti-AAA-Wirkungen von Medikamenten^{zu bewerten 6,7}.

Protokoll

Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Beijing University Health Science Center durchgeführt und vom Biomedical Ethics Committee der Peking University genehmigt (LA2015142). Alle Mäuse für die Operation wurden mit Isofluran (1,5% -2%) betäubt, und die Anästhesie wurde sorgfältig überwacht, um Schmerzen oder Beschwerden für die Mäuse zu vermeiden.

1. Vorbereitung

1. Schneiden Sie 0,3 cm breite Streifen aus puderfreien Gummihandschuhen und Gaze.
2. Kaufen Sie 8-10 Wochen alte männliche C57BL / 6J-Mäuse. Unterbringung der Tiere in einer klimatisierten Umgebung mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser.
3. Autoklavieren Sie die Gaze, Wattestäbchen, Schere und Pinzette vor der Operation.
4. Erhalten Sie Betadin, 70% Ethanol und antiseptische Handwäsche.
5. Ziehen Sie eine Maske, ein Kleid und sterile Handschuhe an.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Füttern Sie kaubare Carprofen-Tabletten (5 mg/kg Dosis) 2-4 Stunden vor der Operation an eine 8-10 Wochen alte C57BL/6J-Maus. Dann legen Sie die Maus in eine Induktionskammer (206 mm x 210 mm x 140 mm) mit Isofluran bei einer Flussrate von 1,5% -2%.
   1. Überwachen Sie die Maus für ca. 5 Minuten, bis die Atmung sichtbar verlangsamt ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor der Operation nicht auf Schmerzstimulation reagiert.
2. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf und unterstützen Sie die Wärme mit einem Heizkissen oder einer Decke. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehenklemme alle 15 Minuten während des chirurgischen Eingriffs.
3. Rasieren Sie die Bauchhaare der Maus mit einem elektrischen Haarschneider oder einer Haarentfernungscreme. Tupfen und wischen Sie den rasierten Bereich mit Betadin, gefolgt von 70% Ethanol, mehrmals in kreisenden Bewegungen ab. Wechseln Sie die Handschuhe, um die Sterilität zu erhalten.
4. Verwenden Sie eine Schere, um einen ~ 1,5 cm langen Schnitt am Unterbauch entlang der Mittellinie des Bauches zu machen.
5. Verwenden Sie ein steriles, mit normaler Kochsalzlösung angefeuchtetes Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig zu entfernen, bis die infrarenale Aorta sichtbar ist.
6. Sezieren Sie das Bindegewebe und das Fett aus der infrarenalen Aorta für einen etwa 0,5 cm langen Abschnitt. Beachten Sie die kleinen Gefäße auf der Rückenseite und vermeiden Sie es, sie zu reißen. Es besteht keine Notwendigkeit, die Bauchaorta von der Bauchhauptvene zu trennen.
7. Packen Sie ein Stück des mit Kochsalzlösung getränkten Gummihandschuhstreifens unter die Bauchaorta und die Bauchhauptvene. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit abzuwischen.
8. Packen Sie ein mit 0,5 M CaCl₂ getränktes Stück Gaze auf die Adventitia des infrarenalen Bauchgefäßsystems für 10 min. Für die Scheinmausgruppe ersetzen Sie die 0,5 M CaCl₂ durch normale Kochsalzlösung.
9. Entfernen Sie die Gaze und packen Sie ein weiteres mit PBS-Lösung getränktes Stück Gaze für 5 min ein, um CaPO_4-Kristalle in situ in der Adventitia der Aorta zu erzeugen.
10. Entfernen Sie vorsichtig den Gummihandschuhstreifen und die Gaze. Setzen Sie den Darmtrakt der Maus zurück.
11. Nähen Sie den Bauchschnitt und die Haut mit einer 5-0-Naht.
12. Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis die Maus wieder zu Bewusstsein kommt. Bereitstellung von postoperativen Schmerzerholungsunterkünften und Analgesie, so die lokale Tierethikkommission.
13. Beherbergen Sie die Maus für weitere 14 Tage. Überwachen Sie die Maus nach der Operation genau und beobachten Sie danach mindestens 1x täglich. Führen Sie sofort eine Nekropsie durch, wenn während dieser Zeit Mäuse sterben.

3. Harvesting für die Bildgebung von Aorten

1. 14 Tage nach der Operation opfern Sie die Mäuse mit CO₂.
2. Schneiden Sie die Brust- und Bauchhöhlen der Maus ventral auf und schneiden Sie den rechten Vorhof auf.
3. Perfusion der Mäuse mit PBS-Puffer durch den linken Ventrikel des Herzens, um Blut in der Aorta zu entfernen, und dann Perfusion mit 4% Paraformaldehyd, wie zuvor beschrieben⁸.
4. Ernten Sie die Aorta unter dem Stereoskop.
5. Die geernteten Aorten für 48 h in Röhrchen mit 5 ml 4% Paraformaldehyd geben.
6. Entfernen Sie Adventivgewebe und Fett vorsichtig unter dem Stereoskop und stecken Sie die Aorta mit Insektennadeln auf eine schwarze Wachsplatte.
7. Erfassen Sie Aortenbilder.

4. Bewertung des Abbaus der elastischen Fasern

1. Schneiden Sie das Aortenaneurysmagewebe in serielle Kryosektionen (7 μm dick).
2. Analysieren Sie die elastischen Fasern mit einem handelsüblichen elastischen van Gieson (EVG) Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
3. Gradieren Sie den Elastinabbau. Grad 1: <25% Abbau; Grad 2: 25% bis 50% Abbau; Grad 3: 50% bis 75% Abbau; oder Grad 4: >75% Abbau.

Ergebnisse

14 Tage nach der Anwendung von CaPO₄ wurden die männlichen C57BL/6J-Mäuse eingeschläfert und ihre Aorten geerntet und gereinigt. Die Morphologie der Aorten wurde abgebildet, um die AAA-Bildung zu visualisieren. Wie in Abbildung 1A-B gezeigt, führte die Anwendung von CaPO₄ zu einer Erweiterung der infrarenalen Bauchaorta. Histologisch führte CaPO₄ zu einem dramatischen Abbau elastischer Fasern, wie Elastinbrüche zeigen (...

Diskussion

Die periaortische Anwendung von CaPO₄ ist ein robuster Ansatz zur Induktion von AAA bei Mäusen. Mehrere Studien haben das CaPO_4-Modell verwendet und übereinstimmend berichtet, dass dies eine schnelle und reproduzierbare Methode ist, um AAA bei Mäusen ^7,9 zu untersuchen. Dieses Modell rekapituliert einen Teil der Merkmale des menschlichen Aortenaneurysmas und liefert mechanistische Einblicke in die AAA-Pathogenese, einschließlich Entzünd...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012