Un modello di aneurisma dell'aorta addominale del topo indotto da fosfato di calcio

Riepilogo

Questo protocollo descrive un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da fosfato di calcio (AAA) per studiare le caratteristiche patologiche e i meccanismi molecolari delle AAA.

Abstract

Un aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è una malattia cardiovascolare pericolosa per la vita che si verifica in tutto il mondo ed è caratterizzata da una dilatazione irreversibile dell'aorta addominale. Attualmente, vengono utilizzati diversi modelli murini AAA indotti chimicamente, ognuno dei quali simula un diverso aspetto della patogenesi dell'AAA. Il modello AAA indotto da fosfato di calcio è un modello rapido ed economico rispetto ai modelli AAA indotti da angiotensina II ed elastasi. L'applicazione di cristalli di CaPO₄ all'aorta del topo provoca degradazione delle fibre elastiche, perdita di cellule muscolari lisce, infiammazione e deposizione di calcio associata alla dilatazione aortica. In questo articolo viene introdotto un protocollo standard per il modello AAA indotto da CaPO₄. Il protocollo comprende la preparazione del materiale, l'applicazione chirurgica del CaPO₄ all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale, la raccolta delle aorte per visualizzare gli aneurismi dell'aorta e le analisi istologiche nei topi.

Introduzione

Un aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è una malattia cardiovascolare letale caratterizzata da dilatazione permanente dell'aorta addominale, con alti tassi di mortalità una volta che si verifica la rottura. L'AAA è associata all'invecchiamento, al fumo, al genere maschile, all'ipertensione e all'iperlipidemia¹. Diversi processi patologici hanno dimostrato di contribuire alla formazione di AAA, tra cui la proteolisi delle fibre della matrice extracellulare, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la perdita di cellule muscolari lisce vascolari. Attualmente, i meccanismi patologici dell'AAA rimangono elusivi e non ci sono farmaci provati per il trattamento di AAA¹. La ricerca sull'AAA umana è limitata a causa dell'esistenza di pochi campioni aortici umani; pertanto, sono stati stabiliti e ampiamente adottati diversi modelli di AAA animali indotti da modificazioni chimiche, tra cui l'infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII), l'incubazione perivascolare o intraluminale dell'elastasi e l'applicazione perivascolare del fosfato di calcio². Un modello murino comunemente usato è l'applicazione di fosfato di calcio (CaPO₄) all'avventizia dell'aorta addominale infrarenale, che è economica e non richiede modificazioni genetiche.

L'applicazione periaortica diretta di CaCl₂ all'arteria carotide dei conigli per indurre un cambiamento aneurismatico è stata inizialmente riportata da Gertz et ^al.3 ed è stata successivamente applicata alle aorte addominali dei topi. Il modello è stato sviluppato da Yamanouchi et al. per accelerare la dilatazione aortica utilizzando cristalli di CaPO 4 nei topi₄. L'infiltrazione di CaPO₄ nelle aorte dei topi riassume molte caratteristiche patologiche osservate nelle AAA umane, tra cui l'infiltrazione profonda dei macrofagi, la degradazione della matrice extracellulare e la deposizione di calcio. I fattori di rischio dell'AAA umana, come l'iperlipidemia, aumentano anche l'AAA indotta da CaPO₄ nei topi⁵. In contrasto con l'AAA indotta da perfusione AngII nei topi ApoE-/- o LDLR-^/-, l'AAA indotta da CaPO₄ si verifica nella regione aortica infrarenale, che imita l'AAA umana. Attualmente, questo metodo è stato ampiamente applicato per valutare la suscettibilità allo sviluppo di AAA in topi geneticamente modificati e valutare gli effetti anti-AAA dei farmaci ^6,7.

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Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Centro di scienze della salute dell'Università di Pechino e sono stati approvati dal Comitato etico biomedico dell'Università di Pechino (LA2015142). Tutti i topi per la chirurgia sono stati anestetizzati con isoflurano (1,5% -2%) e l'anestesia è stata attentamente monitorata per evitare dolore o disagio per i topi.

1. Preparazione

1. Tagliare strisce larghe 0,3 cm di guanti di gomma senza polvere e garza.
2. Acquista topi maschi C57BL / 6J di 8-10 settimane. Ospita gli animali in un ambiente climatizzato con un ciclo luce-buio di 12 ore e libero accesso a cibo e acqua.
3. Autoclavare la garza, tamponi di cotone, forbici e pinze prima dell'intervento chirurgico.
4. Ottenere betadine, etanolo al 70% e lavaggio delle mani antisettico.
5. Indossa una maschera, un camice e guanti sterili.

2. Procedura chirurgica

1. Somministrare compresse masticabili di carprofen (dose da 5 mg/kg) a un topo C57BL/6J di 8-10 settimane 2-4 ore prima dell'intervento. Quindi, posizionare il mouse in una camera di induzione (206 mm x 210 mm x 140 mm) con isoflurano ad una portata dell'1,5%-2%.
   1. Monitorare il mouse per circa 5 minuti fino a quando la respirazione è visibilmente rallentata. Assicurarsi che il topo non abbia alcuna risposta alla stimolazione del dolore prima dell'intervento chirurgico.
2. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi e fornire supporto termico con una piastra riscaldante o una coperta. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico della punta ogni 15 minuti durante la procedura chirurgica.
3. Rasare i peli addominali del mouse usando un tagliacapelli elettrico o una crema depilatoria. Tamponare e pulire l'area rasata con betadine, seguito da etanolo al 70%, più volte con un movimento circolare. Cambiare i guanti per mantenere la sterilità.
4. Utilizzare le forbici per fare un'incisione ~ 1,5 cm nell'addome inferiore lungo la linea mediana dell'addome.
5. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile inumidito con soluzione salina normale per rimuovere con cura l'intestino fino a quando l'aorta infrarenale è visibile.
6. Sezionare il tessuto connettivo e il grasso dall'aorta infrarenale per una sezione di circa 0,5 cm. Notare i piccoli vasi sul lato dorsale ed evitare di strapparli. Non è necessario separare l'aorta addominale dalla vena principale addominale.
7. Imballare un pezzo della striscia di guanti di gomma imbevuta di soluzione salina sotto l'aorta addominale e la vena principale addominale. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere il liquido in eccesso.
8. Imballare un pezzo di garza imbevuto di 0,5 M CaCl₂ sull'avventizia della vascolarizzazione addominale infrarenale per 10 minuti. Per il gruppo di topi fittizi, sostituire lo 0,5 M CaCl₂ con soluzione salina normale.
9. Rimuovere la garza e imballare un altro pezzo di garza imbevuto di soluzione PBS per 5 minuti per generare cristalli di CaPO₄ in situ nell'avventizia dell'aorta.
10. Rimuovere con attenzione la striscia di guanti di gomma e la garza. Ripristina il tratto intestinale del mouse.
11. Sutura l'incisione addominale e la pelle con una sutura 5-0.
12. Posizionare il mouse su una piastra elettrica fino a quando il mouse non riprende conoscenza. Fornire alloggi post-chirurgici per il recupero del dolore e analgesia, secondo il comitato etico locale per gli animali.
13. Ospita il topo per altri 14 giorni. Monitorare attentamente il mouse dopo l'intervento chirurgico e osservare almeno 1 volta ogni giorno successivamente. Eseguire immediatamente una necroscopia se qualche topo muore durante questo periodo.

3. Raccolta per l'imaging delle aorte

1. 14 giorni dopo l'intervento, sacrificare i topi usando CO₂.
2. Tagliare le cavità toraciche e addominali del topo ventralmente e tagliare l'atrio destro.
3. Perfondere i topi con tampone PBS attraverso il ventricolo sinistro del cuore per rimuovere il sangue nell'aorta, quindi perfondere con paraformaldeide al 4% come descritto in precedenza⁸.
4. Raccogli l'aorta sotto lo stereoscopio.
5. Mettere le aorte raccolte in provette contenenti 5 ml di paraformaldeide al 4% per 48 ore.
6. Rimuovere con cura il tessuto avventiziale e il grasso sotto lo stereoscopio e appuntare l'aorta su una piastra di cera nera con aghi di insetti.
7. Acquisire immagini aortiche.

4. Valutazione della degradazione delle fibre elastiche

1. Tagliare i tessuti dell'aneurisma aortico in criosezioni seriali (7 μm di spessore).
2. Analizzare le fibre elastiche utilizzando un kit di colorazione elastico commerciale van Gieson (EVG) secondo il protocollo del produttore.
3. Classificare la degradazione dell'elastina. Grado 1: degradazione <25%; grado 2: degradazione dal 25% al 50%; grado 3: degradazione dal 50% al 75%; o grado 4: degradazione >75%.

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Risultati

14 giorni dopo l'applicazione di CaPO₄, i topi maschi C57BL / 6J sono stati eutanizzati e le loro aorte sono state raccolte e pulite. La morfologia delle aorte è stata ripresa per visualizzare la formazione di AAA. Come mostrato nella Figura 1A-B, l'applicazione di CaPO₄ ha portato alla dilatazione dell'aorta addominale infrarenale. Istologicamente, CaPO₄ ha provocato una drammatica degradazione delle fibre elastiche, come i...

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Discussione

L'applicazione periaortica di CaPO₄ è un approccio robusto per indurre AAA nei topi. Diversi studi hanno utilizzato il modello CaPO₄ e hanno costantemente riportato che questo è un metodo rapido e riproducibile per studiare AAA nei topi ^7,9. Si ritiene che questo modello riassuma parte delle caratteristiche dell'aneurisma dell'aorta umana e fornisca approfondimenti meccanicistici sulla patogenesi AAA, compresa l'infiammazione e la degradaz...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012