인산칼슘 유도 마우스 복부 대동맥류 모델

요약

이 프로토콜은 AAA의 병리학적 특징과 분자 메커니즘을 연구하기 위해 인산칼슘 유발 복부 대동맥류(AAA) 마우스 모델을 설명합니다.

초록

복부 대동맥류(AAA)는 전 세계적으로 발생하는 생명을 위협하는 심혈관 질환으로 복부 대동맥의 돌이킬 수 없는 확장이 특징입니다. 현재, 화학적으로 유도된 여러 뮤린 AAA 모델이 사용되며, 각각은 AAA의 발병기전의 상이한 양상을 시뮬레이션한다. 인산칼슘 유도 AAA 모델은 안지오텐신 II- 및 엘라스타제 유도 AAA 모델에 비해 빠르고 비용 효율적인 모델입니다. 마우스 대동맥에_CaPO4 결정을 적용하면 탄성 섬유 분해, 평활근 세포의 손실, 염증 및 대동맥 확장과 관련된 칼슘 침착이 발생합니다. 이 기사에서는 CaPO₄ 유도 AAA 모델에 대한 표준 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜에는 재료 준비, 하부 복부 대동맥의 외래에 대한 CaPO₄의 외과 적 적용, 대동맥 동맥류를 시각화하기위한 대동맥 수확 및 마우스의 조직 학적 분석이 포함됩니다.

서문

복부 대동맥류(AAA)는 복부 대동맥의 영구적인 확장을 특징으로 하는 치명적인 심혈관 질환으로, 파열이 발생하면 사망률이 높습니다. AAA는 노화, 흡연, 남성 성별, 고혈압 및 고지혈증과 관련이^{있습니다1.} 세포외 기질 섬유 단백질 분해, 면역 세포 침윤 및 혈관 평활근 세포의 손실을 포함한 여러 병리학적 과정이 AAA 형성에 기여하는 것으로 나타났습니다. 현재 AAA의 병리학 적 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵고 AAA¹의 치료를위한 입증 된 약물은 없습니다. 인간 AAA에 대한 연구는 인간 대동맥 샘플이 거의 없기 때문에 제한적입니다. 따라서, 피하 안지오텐신 II (AngII) 주입, 혈관 주위 또는 관내 엘라스타제 배양, 및 혈관 주위 인산칼슘 적용²를 포함하는 여러 화학적 변형 유도 동물 AAA 모델이 확립되고 널리 채택되었다. 일반적으로 사용되는 마우스 모델은 인산 칼슘 (CaPO₄)을 하부 복부 대동맥의 외막에 적용하는 것인데, 이는 비용 효율적이며 유전자 변형이 필요하지 않습니다.

동맥류 변화를 유도하기 위해 토끼의 경동맥에_CaCl2를 직접 대동맥 주위 적용하는 것은 Gertz et ^al.3에 의해 처음에보고되었고 나중에 마우스의 복부 대동맥에 적용되었다. 이 모델은 마우스 4에서 CaPO⁴ 결정을 사용하여 대동맥 확장을 가속화하기 위해 Yamanouchi et al.에 의해 개발되었습니다. 마우스 대동맥으로의 CaPO₄의 침윤은 심오한 대 식세포 침윤, 세포 외 기질 분해 및 칼슘 침착을 포함하여 인간 AAA에서 관찰 된 많은 병리학 적 특징을 되풀이합니다. 고지혈증과 같은 인간 AAA의 위험 인자는 또한 마우스⁵에서 CaPO4 유도 AAA를 증가시킨다. ApoE-/- 또는 LDLR^-/- 마우스에서 AngII 관류 유도 AAA와 대조적으로, CaPO4^-유도 AAA는 인간 AAA를 모방하는 하부 대동맥 영역에서 발생한다. 현재이 방법은 유전자 변형 마우스에서 AAA 발달에 대한 감수성을 평가하고 약물 ^6,7의 항 -AAA 효과를 평가하는 데 널리 적용되었습니다.

프로토콜

동물 연구는 북경대학 보건과학센터 기관동물관리이용위원회의 지침에 따라 수행되었으며 북경대학 생명의료윤리위원회(LA2015142)의 승인을 받았습니다. 수술을 위한 모든 마우스를 이소플루란(1.5%-2%)으로 마취시키고, 마우스에 대한 통증 또는 불편함을 피하기 위해 마취를 주의 깊게 모니터링하였다.

1. 준비

1. 파우더가없는 고무 장갑과 거즈의 0.3cm 너비를 자릅니다.
2. 8-10 주 된 C57BL / 6J 수컷 마우스를 구입하십시오. 12 시간의 명암 사이클과 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있는 에어컨이 설치된 환경에 동물을 수용하십시오.
3. 수술 전에 거즈, 면봉, 가위, 집게를 오토클레이브합니다.
4. 베타 딘, 70 % 에탄올 및 방부제 손 씻기를 얻으십시오.
5. 마스크, 가운 및 멸균 장갑을 착용하십시오.

2. 수술 절차

1. 수술 2-4시간 전에 씹을 수 있는 카프로펜 정제(5mg/kg 용량)를 8-10주 된 C57BL/6J 마우스에게 먹이십시오. 그런 다음 마우스를 1.5%-2%의 유속으로 이소플루란이 포함된 유도 챔버(206mm x 210mm x 140mm)에 넣습니다.
   1. 호흡이 눈에 띄게 느려질 때까지 약 5분 동안 마우스를 모니터링합니다. 수술 전에 마우스가 통증 자극에 반응하지 않는지 확인하십시오.
2. 눈에 안과 용 연고를 바르고 가열 패드 또는 담요로 보온성을 제공하십시오. 수술 중 15 분마다 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 확인하십시오.
3. 전기 클리퍼 또는 제모 크림을 사용하여 마우스의 복부 머리카락을 면도하십시오. 면도 한 부위를 베타 딘으로 닦은 다음 70 % 에탄올을 원을 그리며 여러 번 닦습니다. 불임을 유지하기 위해 장갑을 교체하십시오.
4. 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 하복부를 ~1.5cm 절개합니다.
5. 생리 식염수를 적신 멸균 면봉을 사용하여 하부 대동맥이 보일 때까지 장을 조심스럽게 제거하십시오.
6. 하부 대동맥에서 결합 조직과 지방을 약 0.5cm 섹션으로 해부하십시오. 등 쪽의 작은 혈관을 주목하고 찢어지지 않도록하십시오. 복부 대동맥을 복부 주 정맥에서 분리 할 필요가 없습니다.
7. 식염수에 적신 고무 장갑 스트립을 복부 대동맥과 복부 주 정맥 아래에 포장하십시오. 면봉을 사용하여 과도한 액체를 닦아냅니다.
8. 하부 복부 혈관계의 외막에 0.5M CaCl₂ 담근 거즈 조각을 10 분 동안 포장하십시오. 가짜 마우스 그룹의 경우 0.5M_CaCl2 를 생리식염수로 교체하십시오.
9. 거즈를 제거하고 PBS 용액에 5 분 동안 담근 다른 거즈 조각을 포장하여 대동맥 외막에서 CaPO ₄ 결정을 생성합니다.
10. 고무 장갑 스트립과 거즈를 조심스럽게 제거하십시오. 마우스의 장을 재설정하십시오.
11. 복부 절개와 피부를 5-0 봉합사로 봉합하십시오.
12. 마우스가 의식을 회복 할 때까지 마우스를 가열 패드에 놓습니다. 지역 동물 윤리위원회에 따르면 수술 후 통증 회복 주택과 진통제를 제공합니다.
13. 마우스를 14 일 더 보관하십시오. 수술 후 마우스를 면밀히 모니터링하고 이후 매일 최소 1 회 관찰하십시오. 이 기간 동안 마우스가 죽으면 즉시 부검을 수행하십시오.

3. 대동맥 이미징을 위한 수확

1. 수술 14일 후,_CO2를 사용하여 마우스를 희생시켰다.
2. 마우스 흉강과 복강을 복부로 자르고 우심방을 잘라냅니다.
3. 마우스를 심장의 좌심실을 통해 PBS 완충액으로 관류하여 대동맥의 혈액을 제거한 다음 앞서 설명한 대로 4% 파라포름알데히드로 관류합니다⁸.
4. 입체 경으로 대동맥을 수확하십시오.
5. 수확한 대동맥을 4% 파라포름알데히드 5mL가 들어 있는 튜브에 48시간 동안 넣습니다.
6. 입체 내시경 아래에서 외래 조직과 지방을 조심스럽게 제거하고 곤충 바늘로 검은 왁스 판에 대동맥을 고정시킵니다.
7. 대동맥 이미지를 획득합니다.

4. 탄성섬유의 열화 평가

1. 대동맥 동맥류 조직을 연속 냉동 절개 (두께 7μm)로 자릅니다.
2. 탄성섬유를 제조자의 프로토콜에 따라 상용 탄성 반 기에손(EVG) 염색 키트를 사용하여 분석한다.
3. 엘라스틴 분해를 등급화합니다. 1 등급 : <25 % 분해; 2 학년 : 25 %에서 50 % 분해; 3 학년 : 50 %에서 75 % 분해; 또는 4 등급 : >75 % 저하.

결과

CaPO₄ 적용 14일 후, C57BL/6J 수컷 마우스를 안락사시키고, 그들의 대동맥을 수확하고 세척하였다. 대동맥의 형태는 AAA 형성을 시각화하기 위해 이미지화되었습니다. 도 1A-B에 도시된 바와 같이, CaPO4의 적용은 하부 복부 대동맥의 확장을 유도하였다. 조직 학적으로, CaPO₄는 엘라스틴 파괴에 의해 설명 된 바와 같이 탄성 섬유의 ?...

토론

CaPO4의 대동맥 주위 적용은 마우스에서 AAA를 유도하는 강력한 접근법이다. 여러 연구에서 CaPO₄ 모델을 사용했으며 이것이 마우스 ^7,9에서 AAA를 연구하는 빠르고 재현 가능한 방법이라고 일관되게 보고했습니다. 이 모델은 인간 대동맥류의 특징 중 일부를 요약하고 염증 및 세포외 기질 분해를 포함한 AAA 발병 기전에 대한 기계론적 통찰?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CaCl2	MECKLIN	C805225
NaCl	Biomed	SH5001-01
PBS	HARVEYBIO	MB5051
Small animal ventilator	RWD	H1550501-012