مزارع زراعة الشبكية ذات النمط العضوي من المكاك

Summary

تم استزراع نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من المكاك البرية في المختبر. تم تحفيز تنكس الشبكية ومسار إشارات cGMP-PKG باستخدام مثبط PDE6 zaprinast. تم التحقق من تراكم cGMP في النباتات بتركيزات مختلفة من zaprinast باستخدام التألق المناعي.

Abstract

يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي. يؤدي الإفراط في تنشيط مسار بروتين كيناز (PKG) المعتمد على الغوانوزين الدوري (cGMP) في الخلايا المستقبلة للضوء إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء ، خاصة في النماذج التي تؤوي طفرات فوسفوديستراز 6b (PDE6b). استخدمت الدراسات السابقة على RD بشكل أساسي نماذج الفئران مثل الفئران rd1 أو rd10 . بالنظر إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية بين الفئران والبشر ، من المهم أن نفهم إلى أي مدى يمكن مقارنة شبكية العين من الرئيسيات والقوارض. تشترك المكاك في مستوى عال من التشابه الجيني مع البشر. لذلك ، تم اختيار المكاك من النوع البري (الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات) للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية التي تضمنت مركب ظهارة الشبكية والشبكية (RPE) - المشيمية. تمت معالجة هذه النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG ومحاكاة التسبب في RD. تم التحقق لاحقا من تراكم cGMP وموت الخلايا في نباتات شبكية الرئيسيات باستخدام التألق المناعي ومقايسة TUNEL. قد يعمل نموذج شبكية العين الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على الدراسات ذات الصلة والفعالة في آليات RD المعتمدة على cGMP-PKG ، وكذلك لتطوير مناهج العلاج المستقبلية.

Introduction

يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي وينتج عن طفرات في مجموعة واسعة من الجينات المسببة للأمراض¹. النتيجة النهائية ل RD هي فقدان البصر وفي الغالبية العظمى من الحالات لا يزال المرض غير قابل للعلاج حتى يومنا هذا. لذلك ، من المهم دراسة الآليات الخلوية التي تؤدي إلى موت المستقبلات الضوئية باستخدام نماذج تمثل بأمانة حالة المرض البشري. هنا ، تعتبر النماذج القائمة على الرئيسيات ذات أهمية خاصة بسبب قربها من البشر. والجدير بالذكر أن مثل هذه النماذج قد تعزز تطوير التدخلات العلاجية المناسبة التي يمكن أن توقف أو تؤخر موت الخلايا المستقبلة للضوء.

أظهرت الأبحاث السابقة حول آليات موت الخلايا في RD أن انخفاض أو فقدان نشاط فسفوديستراز 6 (PDE6) الناجم عن طفرات الجينات المسببة ل RD يؤدي إلى انخفاض التحلل المائي لأحادي فوسفات الغوانوزين الدوري (cGMP) ^2,3. cGMP هو ناهض محدد للقنوات الأيونية ذات البوابات النوكليوتيدات الدورية (CNGCs) في الأجزاء الخارجية للقضيب (ROSs) وهو أيضا جزيء رئيسي مسؤول عن تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية في خلايا مستقبلات الضوء^{الفقارية 4}. يؤدي التحلل المائي المنخفض cGMP إلى تراكم cGMP في ROSs ، مما يؤدي إلى فتح CNGCs ⁵. وبالتالي ، يتم تنشيط مسارات النقل الضوئي ، مما يؤدي إلى زيادة تركيزات الكاتيون في الخلايا المستقبلة للضوء. تفرض هذه العملية عبئا أيضيا على المستقبلات الضوئية ، والتي عند الإفراط في تنشيطها ، على سبيل المثال ، بسبب الطفرات في PDE6 ، قد تسبب موت الخلايا.

أظهرت العديد من الدراسات أن التراكم المفرط الكبير ل cGMP في المستقبلات الضوئية لنماذج الفئران ذات الطفرات الجينية RD المختلفة قد يتسبب في تنشيط بروتين كيناز المعتمد على cGMP (PKG) ^3,6. هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلايا الميتة الإيجابية TUNEL وترقق تدريجي لطبقة الخلايا المستقبلة للضوء. تشير الدراسات السابقة إلى أن فرط نشاط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP هو شرط ضروري وكاف لتحريض موت الخلايا المستقبلة للضوء ^2,5. أظهرت الدراسات التي أجريت على نماذج مختلفة من الفئران من RD أيضا أن تنشيط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP في المستقبلات الضوئية ، يؤدي إلى الإفراط في تنشيط المستجيبات النهائية مثل بوليميراز بوليميراز بولي ADP - ريبوز 1 (PARP1) ، هيستون ديسيتيلاز (HDAC) ، وكالبين²،⁷،^8،9. وهذا يعني وجود ارتباطات سببية بين هذه البروتينات المستهدفة المختلفة وموت الخلايا المستقبلة للضوء.

ومع ذلك ، استندت الأبحاث السابقة حول علم الأمراض وعلم السموم والعلاج من RD بشكل أساسي على نماذج الفئران ل RD¹⁰،^11،12. ومع ذلك ، لا تزال هناك صعوبات هائلة في الترجمة السريرية لهذه النتائج. ويرجع ذلك إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية الكبيرة بين الفئران والبشر ، خاصة فيما يتعلق ببنية الشبكية. في المقابل ، تشترك الرئيسيات غير البشرية (NHPs) أيضا في درجة عالية من التشابه مع البشر فيما يتعلق بالخصائص الوراثية والأنماط الفسيولوجية وتنظيم العوامل البيئية. على سبيل المثال ، تم التحقيق في العلاج البصري الوراثي كوسيلة لاستعادة نشاط الشبكية في نموذج NHP¹³. أظهر لينغام وزملاؤه أن خلايا سلائف مستقبلات الشبكية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات على مستوى ممارسات التصنيع الجيدة قد تنقذ تلف مستقبلات الضوء المخروطية في NHP¹⁴. لذلك ، تعد نماذج NHP مهمة لاستكشاف التسبب في RD وتطوير طرق علاج فعالة. على وجه الخصوص ، يمكن أن تلعب نماذج NHP من RD ، التي تظهر آليات مسببة للأمراض مماثلة لتلك الموجودة في البشر ، دورا حاسما في الدراسات المتعلقة بتطوير وتحليل علم الأدوية السمية في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.

نظرا لدورة الحياة الطويلة ، والمستوى العالي من الصعوبات التقنية ، والتكلفة العالية التي ينطوي عليها إنشاء نماذج الرئيسيات في الجسم الحي ، أنشأنا نموذجا للرئيسيات غير البشرية في المختبر (NHP) باستخدام مزارع شبكية المكاك المزروعة. أولا ، تم اختيار المكاك من النوع البري الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية ، والتي تضمنت مجمع شبكية العين RPE-choroid. ثم تمت معالجة النباتات الخارجية بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، و 400 ميكرومتر) للحث على مسار إشارات cGMP-PKG. تم تحديد موت الخلايا المستقبلة للضوء وتحليلها باستخدام مقايسة TUNEL ، وتم التحقق من تراكم cGMP في النباتات الخارجية عن طريق التألق المناعي. نظرا لدرجة التشابه العالية فيما يتعلق بتوزيع الخلايا ومورفولوجيتها ، وسمك طبقة الشبكية ، والخصائص الفسيولوجية الأخرى لشبكية العين بين القرود والبشر ، فإن إنشاء مسار إشارات cGMP-PKG في نموذج الشبكية في المختبر قد يسهل البحث المستقبلي حول التسبب في RD وكذلك الدراسات في تطوير وعلم الأدوية السمية للعقاقير الجديدة لعلاج RD.

Protocol

تمت مراجعة الدراسة على الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات التابعة لمعهد علم الحيوان ، والأكاديمية الصينية للعلوم (IACUC-PE-2022-06-002) ، ومراجعة أخلاقيات الحيوان وبروتوكول الحيوان بجامعة يونان (YNU20220149).

1. تحضير نباتات الشبكية

1. احصل على مقل عيون الرئيسيات من المكاك البرية ، التي تتراوح أعمارها بين 1 و 3 سنوات ، وتخزينها في محلول تخزين الأنسجة ، ونقلها على الجليد في غضون 3 ساعات من الاستئصال بعد التضحية بالقرود أو بعد الموت الطبيعي.
2. لإعداد محلول البروتيناز K ، قم بإذابة 25 ملغ من البروتيناز K في 250 ميكرولتر من الماء المقطر ، ثم أضف 225 ميكرولتر من المحلول إلى 18.5 مل من الوسط القاعدي (R16).
3. اغسل مقل العيون في 10 مل من 5٪ بوفيدون اليود (بوفيدون اليود: الماء = 1:19) لمدة 30 ثانية واغمسها في 5٪ بنسلين / ستربتومايسين (PEN/STREP):p محلول ملحي مخزن في المستشفيات = 1:19 لمدة دقيقة واحدة لتجنب التلوث البكتيري. ثم احتضان مقل العيون في 10 مل من R16 المتوسطة لمدة 5 دقائق.
4. سخني محلول البروتيناز K مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية. ثم ، اغمر مقل العيون في 10 مل من محلول البروتيناز K واحتضانها لمدة 2 دقيقة. اغمر مقل العيون في 10 مل من محلول R16 + مصل بقري جنيني (1: 1) ، واحتضنها لمدة 5 دقائق ، ثم انقل مقل العيون إلى 10 مل من R16 الطازج للغسيل النهائي.
5. افصل الصلبة والقرنية والقزحية والعدسة والجسم الزجاجي ، واقطع شبكية العين من 4 جوانب بملاقط ومقص (الشكل 1A-L).
6. قطع نباتات الشبكية بشفرات التريفين إلى خمسة أقسام - شفرة تريفين 4 مم للجانب الأنفي / الصدغي / العلوي / السفلي وشفرة تريفين 6 مم للجانب المركزي (تحتوي على قرص بصري وبقعة. الشكل 1M-O). قطع على المسافة التالية من رأس العصب البصري: 1.5 مم للأنف ، 4 مم للوقت ، و 2 مم لكل من الجانب العلوي والسفلي.
7. انقل نباتات الشبكية (التي تحتوي على شبكية العين والمشيمية) باستخدام خافض الجفن وضعها في منتصف الإدخال ، وجانب مستقبلات الضوء لأعلى (الشكل 1P). ضع ما يقرب من 1 مل من الوسط الكامل (R16 المكمل ب BSA ، الترانسفيرين ، البروجسترون ، الأنسولين ، T3 ، الكورتيكوستيرون ، فيتامين ب 1 ، فيتامين ب 12 ، الريتينول ، أسيتات الريتينيل ، DL-tocopherol ، أسيتات التوكوفيرل ، حمض اللينوليك ، L- سيستين حمض الهيدروكلوريك ، الجلوتاثيون ، الجلوتامين ، فيتامين C) تحت الغشاء الموجود على اللوحة لتغطية شبكية العين بالكامل.

2. ثقافة زرع الشبكية الرئيسيات

1. تزرع الشبكية المزروعة في وسط كامل وتوضع في حاضنة 37 درجة مئوية مهواة ب 5٪ CO₂ مرطب.
2. تطبيق العلاج الدوائي بتركيز مناسب على وسط زراعة الشبكية (على سبيل المثال ، zaprinast بتركيزات 100 ميكرومتر أو 200 ميكرومتر أو 400 ميكرومتر). استخدم ما لا يقل عن ثلاثة نباتات لكل حالة علاجية واستخدم النباتات بدون دواء كسيطرة. علاج مع المخدرات لمدة 4 أيام.

3. التثبيت والتقسيم بالتبريد

1. احتضان نباتات الشبكية مع 1 مل من بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 45 دقيقة ، واشطفها لفترة وجيزة ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم احتضانها مع 10٪ سكروز لمدة 10 دقائق ، وسكروز 20٪ لمدة 20 دقيقة ، و 30٪ سكروز لمدة 30 دقيقة (1 مل لكل عملية زرع شبكية).
2. قطع نباتات الشبكية باستخدام شفرات التريفين لضمان الاتساق في حجم النباتات التي تم الحصول عليها من مواقع مختلفة بالخصائص التالية: أربعة أرباع في المحيط ، 6 مم في المركز. بعد ذلك ، انقل نباتات الشبكية إلى صندوق من الصفيح (حوالي 1.5 سم × 1.5 سم × 1.5 سم) باستخدام وسيط تضمين O.C.T. لتغطية الأنسجة. على الفور ، قم بتجميد أقسام الأنسجة في النيتروجين السائل وضعها في ثلاجة -20 درجة مئوية للتخزين.
3. استخدم شفرة حادة لتقليم الآجار إلى كتلة صغيرة تحتوي على عينة الأنسجة ، وقم بتقطيع كتل العينة إلى أقسام 10 ميكرومتر ، وضعها على شرائح مجهر الالتصاق باستخدام فرشاة ناعمة. ثم جففيها لمدة 45 دقيقة على حرارة 40 درجة مئوية واحفظيها في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. الكيمياء الهيستولوجية المناعية (الشكل 2)

1. تلطيخ cGMP
   1. جفف الشرائح وارسم حلقة كارهة للماء حول أقسام الشبكية باستخدام قلم مانع للسوائل لتغطية العينات.
   2. اغمر الشرائح في 200 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات 0.3٪ و Triton X-100 لكل شريحة (PBST) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم في محلول مانع (5٪ مصل حمار عادي ، 0.3٪ PBST ، 1٪ BSA ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   3. احتضان العينات طوال الليل بالجسم المضاد الأساسي (1: 250 ، الأغنام المضادة ل cGMP ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) المحضرة في محلول الحجب عند 4 درجات مئوية ، ثم اشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق (200 ميكرولتر لكل شريحة) 3x.
   4. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي (1: 300 ، حمار مضاد للأغنام Alxea Fluor 488 ، 200 ميكرولتر لكل شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اشطفها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق ، 3x. قم بتغطية العينات بوسط تركيب مضاد للتلاشي يحتوي على 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
2. تلطيخ TUNEL
   1. جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة وارسم حلقة حاجز طاردة للماء حول عينات أنسجة الشبكية باستخدام قلم مانع السائل ، ثم احتضانها في 40 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
   2. احتضان الشرائح في 42 مل (لكل خمس شرائح) من TBS (0.05 م Tris-buffer) عند 37 درجة مئوية. نضح TBS ، واحتضان العينات مع 6 ميكرولتر من البروتيناز K لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح 3x باستخدام TBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
   3. قم بتعريض الشرائح إلى 40 مل من محلول حمض الخليك والإيثانول في الشوبلين ، وقم بتغطيتها بورقة شفافة ، واحتضانها عند -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. اغسل الشرائح 3 مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
   4. قم بتعريض الشرائح لمحلول الحجب (1٪ BSA ؛ 200-300 ميكرولتر لكل شريحة حسب المتطلبات) واحتضانها في غرفة الرطوبة لمدة 1 ساعة.
   5. تحضير محلول مجموعة TUNEL ، TMR الأحمر ، بالنسب التالية: 62.50 ميكرولتر من محلول الحجب (1٪ BSA) ، 56.25 ميكرولتر من محلول الوسم (TMR-dUTP) ، و 6.25 ميكرولتر من الإنزيم (نسبة لكل شريحة). أضف حوالي 130 ميكرولتر من هذا المحلول لكل شريحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام PBS لمدة 5 دقائق (200 ميكرولتر لكل شريحة) ، 2x.
   6. ضع شرائح الغطاء التي تحتوي على 1-2 قطرات من وسط التثبيت المضاد للتلاشي مع DAPI فوق العينات ، ثم احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التصوير.
3. cGMP تلطيخ جنبا إلى جنب مع تلطيخ TUNEL
   1. تبع تلطيخ cGMP تلطيخ TUNEL. اتبع خطوات تلطيخ TUNEL من الخطوة 4.2.1 إلى الخطوة 4.2.5 ، ثم تابع خطوات تلطيخ cGMP من الخطوة 4.1.2 إلى الخطوة 4.1.4.
4. قم بإجراء الفحص المجهري للضوء والتألق باستخدام معلمات الكاميرا على النحو التالي: وقت التعرض = 125 مللي ثانية ، حجم عائد الاستثمار = 2752 × 2208 ، اللون = B / M. التقط الصور باستخدام البرنامج. تخيل أربعة حقول مختلفة بكاميرا رقمية بتكبير 20x من كل قسم واحصل على صور تمثيلية من المناطق المركزية لشبكية العين باستخدام DAPI (465 نانومتر) و EGFP (509 نانومتر) و TMP (578 نانومتر) ، مع مسح Z-Stack بفاصل زمني = 1 ميكرومتر واختياري = 1.251 ميكرومتر.

النتائج

في هذه الدراسة ، تم إجراء زراعة شبكية المكاك باستخدام نباتات تحتوي على مركب شبكية العين RPE-choroid (الشكل 1 ، الشكل التكميلي S1). بالمقارنة مع الثقافة المختبرية لخلايا الشبكية التي تستخدم شبكية العين بدون RPE المرفقة والمشيمية ، فإن ثقافتنا المزروعة تسهل بقاء الخلا?...

Discussion

يشير النقل الضوئي البصري إلى العملية البيولوجية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية بواسطة خلايا مستقبلات ضوئية داخل شبكية العين. الخلايا المستقبلة للضوء هي خلايا عصبية مستقطبة قادرة على الانتقال الضوئي، وهناك نوعان مختلفان من المستقبلات الضوئية تسمى القضبان ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),