Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Riepilogo

Gli espianti retinici ottenuti da macachi selvatici sono stati coltivati in vitro. La degenerazione retinica e la via di segnalazione cGMP-PKG sono state indotte utilizzando l'inibitore della PDE6 zaprinast. L'accumulo di cGMP negli espianti a diverse concentrazioni di zaprinast è stato verificato utilizzando l'immunofluorescenza.

Abstract

La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori. L'iperattivazione della via ciclica della proteina chinasi dipendente dalla guanosina monofosfato (cGMP) (PKG) nelle cellule dei fotorecettori causa la morte delle cellule dei fotorecettori, specialmente nei modelli che ospitano mutazioni della fosfodiesterasi 6b (PDE6b). Precedenti studi sulla RD hanno utilizzato principalmente modelli murini come topi rd1 o rd10 . Date le differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, è importante capire fino a che punto le retine di primati e roditori sono comparabili. I macachi condividono un alto livello di somiglianza genetica con gli esseri umani. Pertanto, i macachi selvatici (di età compresa tra 1-3 anni) sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici che includevano il complesso epitelio pigmentato retinico-retinico (RPE)-coroide. Questi espianti sono stati trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG e simulare la patogenesi RD. L'accumulo di cGMP e la morte cellulare negli espianti retinici dei primati sono stati successivamente verificati utilizzando l'immunofluorescenza e il saggio TUNEL. Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio può servire per studi pertinenti ed efficaci sui meccanismi della RD cGMP-PKG-dipendente, nonché per lo sviluppo di futuri approcci terapeutici.

Introduzione

La degenerazione retinica ereditaria (RD) è caratterizzata dalla progressiva morte delle cellule dei fotorecettori ed è causata da mutazioni in un'ampia varietà di geni patogeni¹. Il risultato finale della RD è la perdita della vista e nella stragrande maggioranza dei casi la malattia rimane incurabile fino ad oggi. Pertanto, è importante studiare i meccanismi cellulari che portano alla morte dei fotorecettori utilizzando modelli che rappresentino fedelmente la condizione della malattia umana. Qui, i modelli basati sui primati sono di particolare interesse a causa della loro vicinanza agli esseri umani. In particolare, tali modelli possono far progredire lo sviluppo di interventi terapeutici appropriati che possono arrestare o ritardare la morte cellulare dei fotorecettori.

Precedenti ricerche sui meccanismi di morte cellulare nella RD hanno dimostrato che la diminuzione o la perdita dell'attività della fosfodiesterasi 6 (PDE6) causata da mutazioni geniche che innescano RD porta a una ridotta idrolisi del guanosina monofosfato ciclico (cGMP)^2,3. cGMP è un agonista specifico dei canali ionici ciclici nucleotide-dipendenti (CNGC) nei segmenti esterni dei bastoncelli (ROS) ed è anche una molecola chiave responsabile della conversione dei segnali luminosi in segnali elettrici nelle cellule fotorecettrici dei vertebrati⁴. La ridotta idrolisi del cGMP provoca l'accumulo di cGMP nei ROS, portando all'apertura dei CNGC ⁵. Di conseguenza, le vie di fototrasduzione vengono attivate, con conseguente aumento delle concentrazioni di cationi nelle cellule dei fotorecettori. Questo processo impone un carico metabolico sui fotorecettori, che se sovraattivato, ad esempio, da mutazioni nella PDE6, può causare la morte cellulare.

Molti studi hanno dimostrato che un significativo sovraaccumulo di cGMP nei fotorecettori di modelli murini con diverse mutazioni del gene RD può causare l'attivazione della proteina chinasi cGMP-dipendente (PKG)^3,6. Ciò porta ad un sostanziale aumento delle cellule morenti, TUNEL-positive e ad un graduale assottigliamento dello strato cellulare del fotorecettore. Studi precedenti suggeriscono che la sovraattivazione di PKG causata da elevati livelli di cGMP è una condizione necessaria e sufficiente per l'induzione della morte cellulare dei fotorecettori ^2,5. Studi su diversi modelli murini di RD hanno anche dimostrato che l'attivazione di PKG, indotta da elevati livelli di cGMP nei fotorecettori, porta a una sovraattivazione degli effettori a valle come la poli-ADP-ribosio polimerasi 1 (PARP1), l'istone deacetilasi (HDAC) e la calpain 2,7,8,9. Ciò implica associazioni causali tra queste diverse proteine bersaglio e la morte delle cellule dei fotorecettori.

Tuttavia, la ricerca precedente sulla patologia, tossicofarmacologia e terapia della RD si basava principalmente su modelli murini per RD^10,11,12. Tuttavia, permangono immense difficoltà nella traduzione clinica di questi risultati. Ciò è dovuto alle notevoli differenze genetiche e fisiologiche tra topi e umani, soprattutto per quanto riguarda la struttura retinica. Al contrario, i primati non umani (NHP) condividono anche un alto grado di somiglianza con gli esseri umani per quanto riguarda le caratteristiche genetiche, i modelli fisiologici e la regolazione dei fattori ambientali. Ad esempio, la terapia optogenetica è stata studiata come mezzo per ripristinare l'attività retinica in un modello NHP¹³. Lingam e colleghi hanno dimostrato che le cellule precursori dei fotorecettori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti derivate da cellule staminali di buona fabbricazione possono salvare il danno del fotorecettore del cono in NHP¹⁴. Pertanto, i modelli NHP sono importanti per l'esplorazione della patogenesi RD e lo sviluppo di metodi di trattamento efficaci. In particolare, i modelli NHP di RD, che presentano meccanismi patogenetici simili a quelli dell'uomo, potrebbero svolgere un ruolo critico negli studi sullo sviluppo e nell'analisi tossicofarmacologica in vivo di nuovi farmaci.

In considerazione del lungo ciclo di vita, dell'elevato livello di difficoltà tecniche e degli elevati costi necessari per stabilire modelli di primati in vivo, abbiamo stabilito un modello in vitro di primati non umani (NHP) utilizzando colture di retina di macaco espiantata. In primo luogo, i macachi selvatici di età compresa tra 1 e 3 anni sono stati selezionati per la coltura in vitro di espianti retinici, che includevano il complesso retina-RPE-coroide. Gli espianti sono stati quindi trattati con diverse concentrazioni dell'inibitore della PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) per indurre la via di segnalazione cGMP-PKG. La morte cellulare dei fotorecettori è stata quantificata e analizzata utilizzando il test TUNEL e l'accumulo di cGMP negli espianti è stato verificato tramite immunofluorescenza. Dato l'elevato grado di somiglianza rispetto alla distribuzione cellulare e alla morfologia, allo spessore dello strato retinico e ad altre caratteristiche fisiologiche della retina tra scimmie e umani, la creazione della via di segnalazione cGMP-PKG nel modello retinico in vitro può facilitare la ricerca futura sulla patogenesi della RD, nonché gli studi sullo sviluppo e la tossicofarmacologia di nuovi farmaci per il trattamento delle RD.

Protocollo

Lo studio sugli animali è stato esaminato e approvato dal Comitato di revisione etica dell'Istituto di zoologia, dall'Accademia cinese delle scienze (IACUC-PE-2022-06-002) e dalla revisione dell'etica animale e dal protocollo animale dell'Università dello Yunnan (YNU20220149).

1. Preparazione di espianti retinici

1. Ottenere bulbi oculari di primati da macachi selvatici, di età compresa tra 1 e 3 anni, conservarli in una soluzione di conservazione dei tessuti e trasportarli su ghiaccio entro 3 ore dall'enucleazione dopo che le scimmie sono state sacrificate o dopo la morte naturale.
2. Per la preparazione della soluzione di proteinasi K, sciogliere 25 mg di proteinasi K in 250 μL di acqua distillata, quindi aggiungere 225 μL della soluzione a 18,5 mL di mezzo basale (R16).
3. Lavare i bulbi oculari in 10 ml di povidone-iodio al 5% (povidone-iodio: acqua = 1:19) per 30 s e immergerli in 5% penicillina / streptomicina (PEN / STREP) :p soluzione salina tamponata con hosphate = 1:19 per 1 minuto per evitare la contaminazione batterica. Quindi, incubare i bulbi oculari in 10 ml di terreno R16 per 5 minuti.
4. Preriscaldare la soluzione di proteinasi K in un incubatore a 37 °C. Quindi, immergere i bulbi oculari in 10 ml di soluzione di proteinasi K e incubare per 2 minuti. Immergere i bulbi oculari in 10 ml di soluzione di siero bovino fetale R16 + (1:1), incubare per 5 minuti, quindi trasferire i bulbi oculari in 10 ml di R16 fresco per un lavaggio finale.
5. Separare la sclera, la cornea, l'iride, il cristallino e il corpo vitreo e tagliare la retina da 4 lati con pinzette e forbici (Figura 1A-L).
6. Tagliare gli espianti retinici con lame trephine in cinque sezioni: una lama trephine da 4 mm per il lato nasale / temporale / superiore / inferiore e una lama trephine da 6 mm per il lato centrale (contenente disco ottico e macula; Figura 1M-O). Tagliare alla seguente distanza dalla testa del nervo ottico: 1,5 mm per nasale, 4 mm per temporale e 2 mm per lato superiore e inferiore.
7. Trasferire gli espianti di retina (contenenti retina e coroide) con il depressore palpebrale e posizionarli al centro dell'inserto, con il fotorecettore rivolto verso l'alto (Figura 1P). Posizionare circa 1 mL di terreno completo (R16 integrato con BSA, transferrina, progesterone, insulina, T3, corticosterone, vitamina B1, vitamina B12, retinolo, acetato di retinile, DL-tocoferolo, tocoferolo acetato, acido linoleico, L-cisteina HCl, glutatione, glutammina, vitamina C) sotto la membrana sulla piastra per coprire completamente la retina.

2. Coltura retinica di espianti di primati

1. Coltura retinica espianta in mezzo completo e posta in un incubatore a 37 °C aerato con 5% di CO 2 umidificato_.
2. Applicare il trattamento farmacologico a concentrazione appropriata sul terreno di coltura retinica (ad esempio, zaprinast a concentrazioni di 100 μM, 200 μM o 400 μM). Utilizzare almeno tre espianti per condizione di trattamento e utilizzare espianti senza farmaco come controllo. Trattare con un farmaco per 4 giorni.

3. Fissaggio e crio-sezionamento

1. Incubare gli espianti retinici con 1 mL di paraformaldeide (PFA) per 45 minuti, sciacquarli brevemente con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi incubare con il 10% di saccarosio per 10 minuti, il 20% di saccarosio per 20 minuti e il 30% di saccarosio per 30 minuti (1 mL per ogni espianto di retina).
2. Tagliare gli espianti retinici utilizzando lame di trefina per garantire coerenza nelle dimensioni degli espianti ottenuti da siti diversi con le seguenti caratteristiche: quattro quadranti in periferia, 6 mm al centro. Quindi, trasferire gli espianti retinici in una scatola di latta (circa 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) con mezzo incorporante O.C.T. per coprire il tessuto. Congelare immediatamente le sezioni di tessuto in azoto liquido e metterle in frigorifero a -20 °C per la conservazione.
3. Utilizzare una lama affilata per tagliare l'agar in un piccolo blocco contenente il campione di tessuto, tagliare i blocchi del campione in sezioni da 10 μm e posizionarli su vetrini da microscopio ad adesione usando una spazzola morbida. Quindi, asciugare per 45 minuti a 40 °C e conservare a -20 °C fino all'uso.

4. Immunoistochimica (Figura 2)

1. Colorazione cGMP
   1. Asciugare i vetrini e disegnare un anello idrofobo attorno alle sezioni retiniche con una penna bloccante liquido per coprire i campioni.
   2. Immergere i vetrini in 200 μL di soluzione salina tampone fosfato allo 0,3% e Triton X-100 per vetrino (PBST) per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi in soluzione bloccante (siero normale d'asino al 5%, PBST allo 0,3%, BSA all'1%, 200 μL per vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
   3. Incubare i campioni per una notte con l'anticorpo primario (1:250, pecora anti-cGMP, 200 μL per vetrino) preparato nella soluzione bloccante a 4 °C, quindi risciacquare con PBS per 10 minuti (200 μL per vetrino) 3x.
   4. Incubare i campioni con anticorpi secondari (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL per vetrino) per 1 h a temperatura ambiente, quindi risciacquare con PBS per 10 min, 3x. Coprire i campioni con un mezzo di montaggio antisbiadimento contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e conservare a 4 °C per almeno 30 minuti prima dell'imaging.
2. Colorazione TUNEL
   1. Asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 15 minuti e disegnare un anello barriera idrorepellente attorno ai campioni di tessuto retinico con la penna bloccante liquida, quindi incubarli in 40 ml di PBS per 15 minuti.
   2. Incubare vetrini in 42 ml (per cinque vetrini) di TBS (0,05 M Tris-buffer) a 37 °C. Aspirare il TBS e incubare i campioni con 6 μL di proteinasi K per 5 minuti. Quindi, lavare i vetrini 3 volte con TBS per 5 minuti ogni volta.
   3. Esporre i vetrini a 40 ml di soluzione di acido aceticolo nel choplin, coprire con un foglio trasparente e incubare a -20 °C per 5 minuti. Lavare i vetrini 3 volte con TBS per 5 minuti ogni volta.
   4. Esporre i vetrini a soluzione bloccante (1% BSA; 200-300 μL per vetrino secondo necessità) e incubare in una camera di umidità per 1 ora.
   5. Preparare la soluzione del kit TUNEL, TMR rosso, nella seguente proporzione: 62,50 μL di soluzione bloccante (1% BSA), 56,25 μL di soluzione di etichettatura (TMR-dUTP) e 6,25 μL dell'enzima (proporzione per ciascun vetrino). Aggiungere circa 130 μL di questa soluzione per vetrino e incubare a 37 °C per 1 ora. Quindi, lavare i vetrini con PBS per 5 minuti (200 μL per vetrino), 2x.
   6. Posizionare i vetrini di copertura contenenti 1-2 gocce di mezzo di montaggio antifade con DAPI sui campioni, quindi incubare i vetrini a 4 °C per almeno 30 minuti prima dell'imaging.
3. Colorazione cGMP combinata con colorazione TUNEL
   1. La colorazione cGMP è stata seguita dalla colorazione TUNEL. Seguire i passaggi della colorazione TUNEL dal punto 4.2.1 al passaggio 4.2.5, quindi continuare i passaggi della colorazione cGMP dal punto 4.1.2 al passaggio 4.1.4.
4. Eseguire la microscopia a luce e fluorescenza con i parametri della fotocamera come segue: tempo di esposizione = 125 ms, dimensione ROI = 2752 x 2208, colore = B / M. Cattura immagini utilizzando il software. Immagina quattro diversi campi con una fotocamera digitale con ingrandimento 20x da ciascuna sezione e ottieni immagini rappresentative dalle aree centrali della retina utilizzando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), con scansione Z-Stack con intervallo = 1 μm e opzionale = 1,251 μm.

Risultati

In questo studio, la coltura retinica di espianti di scimmia macaco è stata eseguita utilizzando espianti contenenti il complesso retina-RPE-coroide (Figura 1, Figura supplementare S1). Rispetto alla coltura in vitro di cellule retiniche che utilizzano la retina senza RPE e coroide collegati, la nostra coltura di espianti facilita una migliore sopravvivenza cellulare e, di conseguenza, prolunga la sopravvivenza delle cellule dei fotorecettori.

Discussione

La fototrasduzione visiva si riferisce al processo biologico mediante il quale i segnali luminosi vengono convertiti in segnali elettrici dalle cellule dei fotorecettori all'interno della retina dell'occhio. Le cellule dei fotorecettori sono neuroni polarizzati capaci di fototrasduzione, e ci sono due diversi tipi di fotorecettori chiamati coni e bastoncelli dopo le forme dei loro segmenti esterni. I bastoncelli sono responsabili della visione scotopica e i coni sono responsabili della visione fotopica e ad alta acuità....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),