Cultivos organotípicos de explante retiniano de mono macaco

Resumen

Los explantes retinianos obtenidos de macacos de tipo silvestre se cultivaron in vitro. La degeneración retiniana y la vía de señalización cGMP-PKG se indujeron utilizando el inhibidor de la PDE6 zaprinast. La acumulación de cGMP en los explantes a diferentes concentraciones de zaprinast se verificó mediante inmunofluorescencia.

Resumen

La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva. La sobreactivación de la vía de la proteína quinasa (PKG) dependiente de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) en las células fotorreceptoras causa la muerte celular fotorreceptora, especialmente en modelos que albergan mutaciones en la fosfodiesterasa 6b (PDE6b). Estudios previos sobre RD han utilizado principalmente modelos murinos como ratones rd1 o rd10 . Dadas las diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, es importante entender hasta qué punto las retinas de primates y roedores son comparables. Los macacos comparten un alto nivel de similitud genética con los humanos. Por lo tanto, se seleccionaron macacos de tipo silvestre (de 1 a 3 años) para el cultivo in vitro de explantes de retina que incluyeron el complejo retina-epitelio pigmentario retiniano (EPR)-coroides. Estos explantes fueron tratados con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast para inducir la vía de señalización cGMP-PKG y simular la patogénesis de la DR. La acumulación de cGMP y la muerte celular en explantes retinianos de primates se verificaron posteriormente mediante inmunofluorescencia y el ensayo TUNEL. El modelo retiniano de primates establecido en este estudio puede servir para estudios relevantes y efectivos sobre los mecanismos de DR dependientes de cGMP-PKG, así como para el desarrollo de futuros enfoques de tratamiento.

Introducción

La degeneración retiniana hereditaria (DR) se caracteriza por la muerte celular fotorreceptora progresiva y es causada por mutaciones en una amplia variedad de genes patógenos¹. El resultado final de la RD es la pérdida de visión y en la gran mayoría de los casos la enfermedad sigue siendo intratable hasta el día de hoy. Por lo tanto, es importante estudiar los mecanismos celulares que conducen a la muerte de los fotorreceptores utilizando modelos que representen fielmente la condición de la enfermedad humana. Aquí, los modelos basados en primates son de particular interés debido a su cercanía con los humanos. En particular, tales modelos pueden avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas apropiadas que pueden detener o retrasar la muerte de las células fotorreceptoras.

Investigaciones previas sobre los mecanismos de muerte celular en la DR han demostrado que la disminución o pérdida de la actividad de la fosfodiesterasa 6 (PDE6) causada por mutaciones del gen desencadenante de la DR conduce a una hidrólisis reducida del monofosfato de guanosina cíclico (^GMPc)2,3. El GMPc es un agonista específico de los canales iónicos dependientes de nucleótidos cíclicos (CNGC) en los segmentos externos de bastones (ROS) y también es una molécula clave responsable de la conversión de señales luminosas en señales eléctricas en células fotorreceptoras de vertebrados⁴. La hidrólisis reducida de cGMP provoca la acumulación de cGMP en ROS, lo que lleva a la apertura de CNGC ⁵. En consecuencia, las vías de fototransducción se activan, lo que resulta en un aumento de las concentraciones de cationes en las células fotorreceptoras. Este proceso impone una carga metabólica a los fotorreceptores, que cuando se sobreactivan, por ejemplo, por mutaciones en la PDE6, pueden causar la muerte celular.

Muchos estudios han demostrado que una sobreacumulación significativa de GMPc en fotorreceptores de modelos de ratón con diferentes mutaciones del gen RD puede causar la activación de la proteína quinasa dependiente de cGMP (PKG)^3,6. Esto conduce a un aumento sustancial de las células moribundas positivas para TUNEL y un adelgazamiento gradual de la capa celular fotorreceptora. Estudios previos sugieren que la sobreactivación del PKG causada por niveles elevados de GMPc es una condición necesaria y suficiente para la inducción de la muerte celular fotorreceptora ^2,5. Los estudios en diferentes modelos de ratón de RD también han demostrado que la activación de PKG inducida por niveles elevados de cGMP en fotorreceptores, conduce a la sobreactivación de efectores aguas abajo como la poli-ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), histona deacetilasa (HDAC) y calpaína 2,7,8,9. Esto implica asociaciones causales entre estas diferentes proteínas diana y la muerte celular fotorreceptora.

Sin embargo, la investigación previa sobre la patología, toxicofarmacología y terapia de la DR se basó principalmente en modelos de ratón para la DR^10,11,12. Sin embargo, siguen existiendo inmensas dificultades en la traducción clínica de estos resultados. Esto se debe a las considerables diferencias genéticas y fisiológicas entre ratones y humanos, especialmente con respecto a la estructura retiniana. En contraste, los primates no humanos (NHP) también comparten un alto grado de similitud con los humanos con respecto a las características genéticas, los patrones fisiológicos y la regulación de los factores ambientales. Por ejemplo, la terapia optogenética fue investigada como un medio para restaurar la actividad retiniana en un modelo NHP¹³. Lingam y sus colegas demostraron que las células precursoras de fotorreceptores de retina derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos de buena fabricación pueden rescatar el daño de los fotorreceptores de cono en NHP¹⁴. Por lo tanto, los modelos de NHP son importantes para la exploración de la patogénesis de la DR y el desarrollo de métodos de tratamiento efectivos. En particular, los modelos NHP de DR, que exhiben mecanismos patogénicos similares a los de los humanos, podrían desempeñar un papel crítico en los estudios sobre el desarrollo y el análisis toxicofarmacológico in vivo de nuevos fármacos.

En vista del largo ciclo de vida, el alto nivel de dificultades técnicas y el alto costo involucrado en el establecimiento de modelos de primates in vivo , establecimos un modelo de primates no humanos in vitro (NHP) utilizando cultivos de retina de macaco explantada. En primer lugar, se seleccionaron macacos de tipo silvestre de 1 a 3 años para el cultivo in vitro de explantes de retina, que incluía el complejo retina-RPE-coroides. Los explantes se trataron con diferentes concentraciones del inhibidor de la PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM y 400 μM) para inducir la vía de señalización cGMP-PKG. La muerte celular fotorreceptora se cuantificó y analizó mediante el ensayo TUNEL, y la acumulación de cGMP en explantes se verificó mediante inmunofluorescencia. Dado el alto grado de similitud con respecto a la distribución celular y la morfología, el grosor de la capa retiniana y otras características fisiológicas de la retina entre monos y humanos, el establecimiento de la vía de señalización cGMP-PKG en el modelo retiniano in vitro puede facilitar futuras investigaciones sobre la patogénesis de la DR, así como estudios sobre el desarrollo y la toxicofarmacología de nuevos fármacos para el tratamiento de la DR.

Protocolo

El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Revisión Ética del Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias (IACUC-PE-2022-06-002), y la revisión de ética animal y protocolo animal de la Universidad de Yunnan (YNU20220149).

1. Preparación de explantes retinianos

1. Obtener globos oculares de primates de macacos de tipo salvaje, de 1 a 3 años de edad, almacenar en solución de almacenamiento de tejidos y transportar en hielo dentro de las 3 h de la enucleación después de que los monos fueron sacrificados o después de la muerte natural.
2. Para la preparación de la solución de proteinasa K, disolver 25 mg de proteinasa K en 250 μL de agua destilada, y luego añadir 225 μL de la solución a 18,5 ml de medio basal (R16).
3. Lave los globos oculares en 10 ml de povidona yodada al 5% (povidona yodada: agua = 1:19) durante 30 s y sumérjalos en penicilina/estreptomicina al 5% (PEN/STREP):p solución salina tamponada con hosfato = 1:19 durante 1 minuto para evitar la contaminación bacteriana. Luego, incubar los globos oculares en 10 ml de R16 medio durante 5 min.
4. Precaliente la solución de proteinasa K en una incubadora a 37 °C. Luego, sumerja los globos oculares en 10 ml de solución de proteinasa K e incube durante 2 minutos. Sumerja los globos oculares en 10 ml de R16 + solución de suero bovino fetal (1:1), incubar durante 5 minutos y luego transfiera los globos oculares a 10 ml de R16 fresco para un lavado final.
5. Separe la esclerótica, la córnea, el iris, el cristalino y el cuerpo vítreo, y corte la retina de 4 lados con pinzas y tijeras (Figura 1A-L).
6. Cortar los explantes retinianos con láminas de trefina en cinco secciones: una hoja de trefina de 4 mm para el lado nasal/temporal/superior/inferior y una hoja de trefina de 6 mm para el lado central (que contiene disco óptico y mácula; Figura 1M-O). Corte a la siguiente distancia de la cabeza del nervio óptico: 1,5 mm para nasal, 4 mm para temporal y 2 mm para el lado superior e inferior.
7. Transfiera los explantes de retina (que contienen retina y coroides) con depresor palpebral y colóquelos en el centro del inserto, con el lado del fotorreceptor hacia arriba (Figura 1P). Coloque aproximadamente 1 ml de medio completo (R16 suplementado con BSA, transferrina, progesterona, insulina, T3, corticosterona, vitamina B1, vitamina B12, retinol, acetato de retinilo, DL-tocoferol, acetato de tocoferilo, ácido linoleico, L-cisteína HCl, glutatión, glutamina, vitamina C) debajo de la membrana en la placa para cubrir completamente la retina.

2. Cultivo de explante retiniano de primates

1. Cultivar explantes retinianos en medio completo y colocar en una incubadora a 37 °C aireada con_CO2 humidificado al 5%.
2. Aplique el tratamiento farmacológico a la concentración adecuada en el medio de cultivo de retina (p. ej., zaprinast a concentraciones de 100 μM, 200 μM o 400 μM). Use al menos tres explantes por condición de tratamiento y use explantes sin medicamento como control. Tratar con medicamento durante 4 días.

3. Fijación y crioseccionamiento

1. Incubar los explantes retinianos con 1 ml de paraformaldehído (PFA) durante 45 min, enjuagarlos brevemente con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego incubar con sacarosa al 10% durante 10 min, sacarosa al 20% durante 20 min y sacarosa al 30% durante 30 min (1 ml por cada explante de retina).
2. Cortar los explantes retinianos utilizando láminas de trefina para asegurar la consistencia en el tamaño de los explantes obtenidos de diferentes sitios con las siguientes características: cuatro cuadrantes en la periferia, 6 mm en el centro. Luego, transfiera los explantes de retina a una caja de hojalata (aproximadamente 1.5 cm x 1.5 cm x 1.5 cm) con medio de incrustación O.C.T. para cubrir el tejido. Inmediatamente, congele las secciones de tejido en nitrógeno líquido y colóquelas en un refrigerador a -20 °C para su almacenamiento.
3. Use una cuchilla afilada para recortar el agar en un bloque pequeño que contenga la muestra de tejido, corte los bloques de muestra en secciones de 10 μm y colóquelos en portaobjetos de microscopio de adhesión con un cepillo suave. A continuación, secar durante 45 min a 40 °C y conservar a -20 °C hasta su uso.

4. Inmunohistoquímica (Figura 2)

1. Tinción cGMP
   1. Seque los portaobjetos y dibuje un anillo hidrófobo alrededor de las secciones de la retina con un bolígrafo bloqueador de líquidos para cubrir las muestras.
   2. Sumerja los portaobjetos en 200 μL de solución salina tampón fosfato al 0,3% y Triton X-100 por portaobjetos (PBST) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego en solución de bloqueo (suero de burro normal al 5%, PBST al 0,3%, BSA al 1%, 200 μL por portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   3. Incubar las muestras durante la noche con el anticuerpo primario (1:250, anti-GMP de oveja, 200 μL por portaobjetos) preparado en la solución de bloqueo a 4 °C, y luego enjuagar con PBS durante 10 min (200 μL por portaobjetos) 3x.
   4. Incubar las muestras con anticuerpo secundario (1:300, Burro anti oveja Alxea Fluor 488, 200 μL por portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente, y luego enjuagar con PBS durante 10 min, 3x. Cubrir las muestras con un medio de montaje antidecoloración que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y conservar a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes.
2. Tinción TUNEL
   1. Seque los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos y dibuje un anillo de barrera repelente al agua alrededor de las muestras de tejido retiniano con la pluma bloqueadora de líquidos, y luego incubarlos en 40 ml de PBS durante 15 minutos.
   2. Incubar portaobjetos en 42 ml (por cinco portaobjetos) de TBS (tampón Tris de 0,05 M) a 37 °C. Aspirar el TBS e incubar las muestras con 6 μL de proteinasa K durante 5 min. Luego, lave las diapositivas 3 veces con TBS durante 5 minutos cada vez.
   3. Exponga los portaobjetos a 40 ml de solución de etanol-ácido acético en la colina, cubra con una lámina transparente e incube a -20 °C durante 5 min. Lave las diapositivas 3 veces con TBS durante 5 minutos cada vez.
   4. Exponer los portaobjetos a una solución de bloqueo (BSA al 1%; 200-300 μL por portaobjetos según el requisito) e incubar en una cámara de humedad durante 1 h.
   5. Prepare la solución del kit TUNEL, TMR rojo, en la siguiente proporción: 62,50 μL de solución bloqueante (BSA al 1%), 56,25 μL de solución de marcado (TMR-dUTP) y 6,25 μL de la enzima (proporción para cada portaobjetos). Añadir aproximadamente 130 μL de esta solución por portaobjetos e incubar a 37 °C durante 1 h. Luego, lave los portaobjetos con PBS durante 5 minutos (200 μL por portaobjetos), 2x.
   6. Coloque portaobjetos que contengan 1-2 gotas de medio de montaje antidecoloración con DAPI sobre las muestras y, a continuación, incube los portaobjetos a 4 °C durante al menos 30 minutos antes de la obtención de imágenes.
3. Tinción cGMP combinada con tinción TUNEL
   1. La tinción cGMP fue seguida por la tinción TUNEL. Siga los pasos de tinción TUNEL del paso 4.2.1 al paso 4.2.5, y luego continúe los pasos de tinción cGMP del paso 4.1.2 al paso 4.1.4.
4. Realice microscopía de luz y fluorescencia con los parámetros de la cámara de la siguiente manera: tiempo de exposición = 125 ms, tamaño de ROI = 2752 x 2208, color = B / M. Capture imágenes utilizando el software. Imagine cuatro campos diferentes con una cámara digital con un aumento de 20x desde cada sección y obtenga imágenes representativas de las áreas centrales de la retina utilizando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), con escaneo Z-Stack que tiene un intervalo = 1 μm y opcional = 1.251 μm.

Resultados

En este estudio, se realizó un cultivo de explante retiniano de mono macaco utilizando explantes que contenían el complejo retina-EPR-coroides (Figura 1, Figura Suplementaria S1). En comparación con el cultivo in vitro de células retinianas que utilizan la retina sin el EPR y la coroides adjuntos, nuestro cultivo de explante facilita una mejor supervivencia celular y, en consecuencia, prolonga la supervivencia de las células fotorreceptoras.

Discusión

La fototransducción visual se refiere al proceso biológico por el cual las señales de luz se convierten en señales eléctricas por las células fotorreceptoras dentro de la retina del ojo. Las células fotorreceptoras son neuronas polarizadas capaces de fototransducción, y hay dos tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastones y conos después de las formas de sus segmentos externos. Los bastones son responsables de la visión escotópica y los conos son responsables de la visión fotópica y de alta agude...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),