猕猴的器官型视网膜外植体培养物

摘要

从野生型猕猴获得的视网膜外植体在 体外培养。视网膜变性和cGMP-PKG信号通路使用PDE6抑制剂扎匹司特诱导。使用免疫荧光法验证不同浓度的扎普瑞斯特外植体中的cGMP积累。

摘要

遗传性视网膜变性（RD）的特征是进行性感光细胞死亡。光感受器细胞中环鸟苷单磷酸（cGMP）依赖性蛋白激酶（PKG）途径的过度激活会导致感光细胞死亡，特别是在携带磷酸二酯酶6b（PDE6b）突变的模型中。以前对RD的研究主要使用小鼠模型，如 rd1 或 rd10 小鼠。鉴于小鼠和人类之间的遗传和生理差异，重要的是要了解灵长类动物和啮齿动物的视网膜在多大程度上具有可比性。猕猴与人类具有高度的遗传相似性。因此，选择野生型猕猴（年龄1-3岁）进行视网膜外植体的 体外 培养，其中包括视网膜-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合物。用不同浓度的PDE6抑制剂扎普利纳斯特处理这些外植体，诱导cGMP-PKG信号通路并模拟RD发病机制。随后使用免疫荧光和TUNEL测定法验证灵长类动物视网膜外植体中的cGMP积累和细胞死亡。本研究建立的灵长类动物视网膜模型可用于cGMP-PKG依赖性RD机制的相关有效研究，以及未来治疗方法的开发。

引言

遗传性视网膜变性（RD）的特征是进行性感光细胞死亡，由多种致病基因突变引起¹。RD的最终结果是视力丧失，在绝大多数情况下，这种疾病至今仍无法治愈。因此，使用忠实代表人类疾病状况的模型研究导致光感受器死亡的细胞机制非常重要。在这里，基于灵长类动物的模型因其与人类的接近而特别令人感兴趣。值得注意的是，这些模型可能会促进适当的治疗干预措施的开发，这些干预措施可以阻止或延缓感光细胞死亡。

先前对RD中细胞死亡机制的研究表明，由RD触发基因突变引起的磷酸二酯酶6（PDE6）活性的降低或丧失导致环鸟苷单磷酸（cGMP^）的水解减少2^，3。cGMP是杆外段（ROS）中环核苷酸门控离子通道（CNGCs）的特异性激动剂，也是负责脊椎动物感光细胞中光信号转化为电信号的关键分子⁴。cGMP水解减少导致cGMP在ROS中积累，导致^CNGCs的开放5。因此，光转导途径被激活，导致感光细胞中阳离子浓度的增加。这个过程给光感受器带来了代谢负担，当光感受器过度激活时，例如，通过PDE6的突变，可能导致细胞死亡。

许多研究表明，具有不同RD基因突变的小鼠模型的光感受器中cGMP的显着过度积累可能导致cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的活化^3，6。这导致垂死的TUNEL阳性细胞的显着增加和感光细胞层的逐渐变薄。先前的研究表明，由cGMP水平升高引起的PKG过度激活是诱导感光细胞死亡的必要和充分条件^2，5。对不同小鼠RD模型的研究还表明，光感受器中cGMP水平升高诱导的PKG活化导致下游效应物的过度激活，例如聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1），组蛋白脱乙酰酶（HDAC）和钙蛋白酶²，⁷，^8，9。这意味着这些不同的靶蛋白与感光细胞死亡之间存在因果关系。

然而，先前关于RD的病理学，毒理学和治疗的研究主要基于RD¹⁰，^11，12的小鼠模型。然而，这些结果的临床转化仍然存在巨大的困难。这是由于小鼠和人类之间存在相当大的遗传和生理差异，特别是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHP）在遗传特征，生理模式和环境因素调节方面也与人类高度相似。例如，在NHP模型中，光遗传学疗法被研究为恢复视网膜活动的手段¹³。Lingam及其同事证明，良好生产规范级人诱导的多能干细胞衍生的视网膜感光器前体细胞可以挽救NHP¹⁴中的视锥光感受器损伤。因此，非人灵长类模型对于探索RD发病机制和开发有效的治疗方法具有重要意义。特别是，RD的非人灵长类模型表现出与人类相似的致病机制，可以在新药开发和体内毒理学分析研究中发挥关键作用。

鉴于建立 体内 灵长类动物模型生命周期长、技术难度高、成本高等问题，我们利用体外猕猴视网膜培养物建立了 体外 非人灵长类动物（NHP）模型。首先，选择1-3岁的野生型猕猴进行视网膜外植体体 外培养， 其中包括视网膜-RPE-脉络膜复合体。然后用不同浓度的PDE6抑制剂zaprinast （100 μM、200 μM 和 400 μM）处理外植体以诱导cGMP-PKG信号通路。使用TUNEL测定法定量和分析感光细胞死亡，并通过免疫荧光 验证 外植体中的cGMP积累。鉴于猴与人类在细胞分布和形态、视网膜层厚度等视网膜生理特征方面高度相似，在 体外 视网膜模型中建立cGMP-PKG信号通路可能有助于未来RD发病机制的研究以及RD治疗新药的开发和毒理学研究。

研究方案

该动物研究通过了中国科学院动物研究所伦理评审委员会（IACUC-PE-2022-06-002）和云南大学动物伦理评审与动物方案（YNU20220149）的审评和批准。

1.视网膜外植体的制备

1. 从1至3岁的野生型猕猴身上获得灵长类动物的眼球，储存在组织储存溶液中，并在猴子被处死或自然死亡后3小时内在剜除后3小时内在冰上运输。
2. 为了制备蛋白酶 K 溶液，将 25 mg 蛋白酶 K 溶解在 250 μL 蒸馏水中，然后将 225 μL 溶液加入 18.5 mL 基础培养基 （R16） 中。
3. 在 10 mL 的 5% 聚维酮碘（聚维酮碘:水 = 1:19）中洗涤眼球 30 秒，然后将它们浸入 5% 青霉素/链霉素 （PEN/STREP）:p己二甲酸盐缓冲盐水 = 1:19 中 1 分钟以避免细菌污染。然后，将眼球在 10 mL 的 R16 培养基中孵育 5 分钟。
4. 在37°C培养箱中预热蛋白酶K溶液。然后，将眼球浸入 10 mL 蛋白酶 K 溶液中并孵育 2 分钟。将眼球浸入 10 mL R16 + 胎牛血清 （1:1） 溶液中，孵育 5 分钟，然后将眼球转移到 10 mL 新鲜 R16 中进行最后一次洗涤。
5. 分离巩膜，角膜，虹膜，晶状体和玻璃体，然后用镊子和剪刀从4个侧面切割视网膜（图1A-L）。
6. 用环钻刀片将视网膜外植体切成五个部分 - 4 毫米环钻刀片用于鼻/颞/上/下侧，6 毫米环钻刀片用于中央侧（包含视盘和黄斑;图 1M-O）。在距视神经头以下距离处切开:鼻部 1.5 毫米，颞部 4 毫米，上侧和下侧 2 毫米。
7. 用眼睑抑制器转移视网膜外植体（包含视网膜和脉络膜），并将它们放置在插入物的中间，感光器面朝上（图1P）。将大约 1 mL 的完全培养基（补充有 BSA、转铁蛋白、孕酮、胰岛素、T3、皮质酮、维生素 B1、维生素 B12、视黄醇、乙酸视黄酯、DL-生育酚、生育酚乙酸酯、亚油酸、L-半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽、谷氨酰胺、维生素 C）放在平板下方以完全覆盖视网膜。

2.灵长类视网膜外植体培养

1. 在完全培养基中培养视网膜外植体，并置于用加湿的5%CO₂曝气的37°C培养箱中。
2. 将适当浓度的药物治疗应用于视网膜培养基（例如，浓度为 100 μM、200 μM 或 400 μM 的扎普瑞斯特）。每个治疗条件至少使用三个外植体，并使用没有药物的外植体作为对照。用药物治疗4天。

3. 固定和冷冻切片

1. 用 1 mL 多聚甲醛 （PFA） 孵育视网膜外植体 45 分钟，用 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 短暂冲洗，然后用 10% 蔗糖孵育 10 分钟，20% 蔗糖孵育 20 分钟，30% 蔗糖孵育 30 分钟（每个视网膜外植体 1 mL）。
2. 使用环钻刀片切割视网膜外植体，以确保从不同部位获得的外植体大小的一致性，具有以下特征:外围有四个象限，中心有6毫米。然后，将视网膜外植体转移到带有O.C.T.包埋培养基的马口铁盒（约1.5厘米x 1.5厘米x 1.5厘米）中以覆盖组织。立即将组织切片冷冻在液氮中，并置于-20°C冰箱中储存。
3. 使用锋利的刀片将琼脂切成包含组织样品的小块，将样品块切成10μm部分，并使用软刷将它们放在粘附显微镜载玻片上。然后，在40°C干燥45分钟，并在-20°C下储存直至使用。

4. 免疫组织化学（图2）

1. cGMP 染色
   1. 干燥载玻片，并用液体阻滞笔在视网膜切片周围画一个疏水环以覆盖样品。
   2. 在室温下将载玻片浸入每张载玻片 （PBST） 的 200 μL 0.3% 磷酸盐缓冲盐水和 Triton X-100 中 10 分钟，然后在封闭溶液（5% 普通驴血清、0.3% PBST、1% BSA、每张载玻片 200 μL）中浸入 1 小时。
   3. 将样品与封闭溶液中制备的一抗（1:250，绵羊抗cGMP，每张载玻片200μL）在4°C孵育过夜，然后用PBS冲洗10分钟（每张载玻片200μL）3x。
   4. 将样品与二抗（1:300，驴抗羊Alxea Fluor 488，每张载玻片200μL）在室温下孵育1小时，然后用PBS冲洗10分钟，3x。用含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗淬灭封片剂覆盖样品，并在成像前在4°C下储存至少30分钟。
2. 图内尔染色
   1. 在室温下将载玻片干燥15分钟，并用液体阻滞剂笔在视网膜组织标本周围绘制防水屏障环，然后将它们在40mL的PBS中孵育15分钟。
   2. 在 37 °C 下在 42 mL（每五张载玻片）的 TBS（0.05 M Tris 缓冲液）中孵育载玻片。 吸出TBS，并将样品与6μL蛋白酶K孵育5分钟。然后，用TBS洗涤载玻片3次，每次5分钟。
   3. 将载玻片暴露在筷子林中的40mL乙醇 - 乙酸溶液中，用透明片覆盖，并在-20°C下孵育5分钟。用TBS清洗载玻片3次，每次5分钟。
   4. 将载玻片暴露在封闭溶液（1%BSA;根据需要每张载玻片200-300μL）中，并在湿度室中孵育1小时。
   5. 按以下比例制备 TUNEL 试剂盒溶液，TMR 红色:62.50 μL 封闭溶液 （1% BSA）、56.25 μL 标记溶液 （TMR-dUTP） 和 6.25 μL 酶（每张载玻片的比例）。每张载玻片加入约130μL该溶液，并在37°C下孵育1小时。然后，用PBS清洗载玻片5分钟（每张载玻片200μL），2次。
   6. 将含有1-2滴带有DAPI的抗淬灭封片剂的盖玻片放在样品上，然后在成像前将载玻片在4°C孵育至少30分钟。
3. cGMP 染色与 TUNEL 染色相结合
   1. cGMP染色后进行TUNEL染色。按照步骤4.2.1到步骤4.2.5的TUNEL染色步骤进行操作，然后继续步骤4.1.2至步骤4.1.4的cGMP染色步骤。
4. 使用相机参数进行光学和荧光显微镜检查，如下所示:曝光时间= 125 ms，ROI大小= 2752 x 2208，颜色= B / M。 使用软件捕获图像。用数码相机以 20 倍放大率从每个部分拍摄四个不同的区域，并使用 DAPI （465 nm）、EGFP（509 nm）、TMP （578 nm） 从视网膜中央区域获得代表性图片，Z-Stack 扫描的间隔 = 1 μm，可选 = 1.251 μm。

结果

在这项研究中，猕猴视网膜外植体培养是使用含有视网膜-RPE-脉络膜复合物的外植体进行的（图1， 补充图S1）。与使用没有附着RPE和脉络膜的视网膜细胞体 外 培养相比，我们的外植体培养有助于更好的细胞存活，从而延长感光细胞的存活期。

我们使用不同浓度的PDE6抑制剂扎普瑞斯特（100μM、200μM和400μM; 补充图S2）诱导...

讨论

视觉光转导是指光信号被眼睛视网膜内的感光细胞转换为电信号的生物过程。感光细胞是能够进行光转导的极化神经元，并且有两种不同类型的感光器在其外段的形状之后称为杆状和视锥。视杆细胞负责暗视觉，视锥细胞负责明视和高敏视力。遗传性RD涉及以进行性视网膜感光细胞死亡为特征的神经退行性疾病¹⁵。

目前对RD的研究主要基于RD的小鼠模型，包括...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),