Makak Maymunundan Organotipik Retinal Eksplant Kültürleri

Özet

Vahşi tip makaklardan elde edilen retinal eksplantlar in vitro olarak kültürlendi. Retinal dejenerasyon ve cGMP-PKG sinyal yolu PDE6 inhibitörü zaprinast kullanılarak indüklendi. Farklı zaprinast konsantrasyonlarındaki eksplantlarda cGMP birikimi, immünofloresan kullanılarak doğrulandı.

Özet

Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir. Fotoreseptör hücrelerde siklik guanozin monofosfat (cGMP)-bağımlı protein kinaz (PKG) yolunun aşırı aktivasyonu, özellikle fosfodiesteraz 6b (PDE6b) mutasyonlarını barındıran modellerde fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. RD ile ilgili önceki çalışmalarda esas olarak rd1 veya rd10 fareleri gibi murin modelleri kullanılmıştır. Fareler ve insanlar arasındaki genetik ve fizyolojik farklılıklar göz önüne alındığında, primat ve kemirgenlerin retinalarının ne ölçüde karşılaştırılabilir olduğunu anlamak önemlidir. Makaklar, insanlarla yüksek düzeyde genetik benzerlik paylaşır. Bu nedenle, retina-retinal pigment epiteli (RPE)-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için vahşi tip makaklar (1-3 yaş arası) seçildi. Bu eksplantlar, cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek ve RD patogenezini simüle etmek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast ile tedavi edildi. primat retinal eksplantlarda cGMP birikimi ve hücre ölümü daha sonra immünofloresan ve TUNEL testi kullanılarak doğrulandı. Bu çalışmada oluşturulan primat retinal modeli, cGMP-PKG'ye bağımlı RD mekanizmalarına ilişkin ilgili ve etkili çalışmaların yanı sıra gelecekteki tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine de hizmet edebilir.

Giriş

Kalıtsal retinal dejenerasyon (RD), ilerleyici fotoreseptör hücre ölümü ile karakterizedir ve çok çeşitli patojenik genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanır¹. RD'nin nihai sonucu görme kaybıdır ve vakaların büyük çoğunluğunda hastalık bu güne kadar tedavi edilemez olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, fotoreseptör ölümüne yol açan hücresel mekanizmaları, insan hastalık durumunu sadık bir şekilde temsil eden modelleri kullanarak incelemek önemlidir. Burada, primat bazlı modeller, insanlara olan yakınlıkları nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Özellikle, bu tür modeller fotoreseptör hücre ölümünü durdurabilecek veya geciktirebilecek uygun terapötik müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir.

RD'de hücre ölümü mekanizmaları üzerine yapılan önceki araştırmalar, RD'yi tetikleyen gen mutasyonlarının neden olduğu fosfodiesteraz 6 (PDE6) aktivitesinin azalmasının veya kaybının, siklik guanozin monofosfatın (cGMP) hidrolizinin azalmasına yol açtığını ^{göstermiştir2,3}. cGMP, çubuk dış segmentlerindeki (ROS'lar) siklik nükleotid kapılı iyon kanallarının (CNGC'ler) spesifik bir agonistidir ve aynı zamanda omurgalı fotoreseptör hücrelerinde ışık sinyallerinin elektrik sinyallerine dönüştürülmesinden sorumlu anahtar bir moleküldür⁴. Azaltılmış cGMP hidrolizi, ROS'larda cGMP birikimine neden olur ve CNGC'lerin ^{açılmasına} neden olur 5. Sonuç olarak, fototransdüksiyon yolları aktive edilir ve fotoreseptör hücrelerde katyon konsantrasyonlarında bir artışa neden olur. Bu süreç, fotoreseptörlere, örneğin PDE6'daki mutasyonlar tarafından aşırı aktive edildiğinde hücre ölümüne neden olabilecek metabolik bir yük getirir.

Birçok çalışma, farklı RD gen mutasyonlarına sahip fare modellerinin fotoreseptörlerinde önemli miktarda cGMP aşırı birikiminin, cGMP'ye bağımlı protein kinazının (PKG⁾ aktivasyonuna neden olabileceğini ^{göstermiştir3,6}. Bu, ölme, TUNEL-pozitif hücrelerde önemli bir artışa ve fotoreseptör hücre tabakasının kademeli olarak incelmesine yol açar. Önceki çalışmalar, yüksek cGMP seviyelerinin neden olduğu PKG aşırı aktivasyonunun, fotoreseptör hücre ölümünün indüksiyonu için gerekli ve yeterli bir koşul olduğunu göstermektedir ^2,5. RD'nin farklı fare modelleri üzerinde yapılan çalışmalar, fotoreseptörlerde yüksek cGMP seviyeleri tarafından indüklenen PKG aktivasyonunun, poli-ADP-riboz polimeraz 1 (PARP1), histon deasetilaz (HDAC) ve calpain 2,7,8,9 gibi aşağı akış efektörlerinin aşırı aktivasyonuna yol açtığını göstermiştir. Bu, bu farklı hedef proteinler ile fotoreseptör hücre ölümü arasındaki nedensel ilişkileri ima eder.

Bununla birlikte, RD'nin patolojisi, toksikofarmakolojisi ve tedavisi ile ilgili önceki araştırmalar esas olarak RD^10,11,12 için fare modellerine dayanıyordu. Bununla birlikte, bu sonuçların klinik çevirisinde büyük zorluklar devam etmektedir. Bu, fareler ve insanlar arasındaki, özellikle retinal yapı ile ilgili önemli genetik ve fizyolojik farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, insan olmayan primatlar (NHP'ler) ayrıca genetik özellikler, fizyolojik kalıplar ve çevresel faktör düzenlemesi açısından insanlarla yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Örneğin, optogenetik tedavi, bir NHP model^13'te retinal aktiviteyi geri kazanmanın bir yolu olarak araştırılmıştır. Lingam ve meslektaşları, iyi üretim uygulaması sınıfı insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı retinal fotoreseptör öncü hücrelerinin NHP^14'te koni fotoreseptör hasarını kurtarabileceğini göstermiştir. Bu nedenle NHP modelleri, RD patogenezinin araştırılması ve etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Özellikle, insanlardakine benzer patojenik mekanizmalar sergileyen RD'nin NHP modelleri, yeni ilaçların geliştirilmesi ve in vivo toksikofarmakoloji analizi ile ilgili çalışmalarda kritik bir rol oynayabilir.

Uzun yaşam döngüsü, yüksek düzeyde teknik zorluklar ve in vivo primat modellerinin oluşturulmasında yer alan yüksek maliyet göz önüne alındığında, ekzode makak retina kültürlerini kullanarak in vitro insan dışı primat (NHP) modeli oluşturduk. İlk olarak, retina-RPE-koroid kompleksini içeren retinal eksplantların in vitro kültürü için 1-3 yaş arası vahşi tip makaklar seçildi. Eksplantlar daha sonra cGMP-PKG sinyal yolunu indüklemek için farklı konsantrasyonlarda PDE6 inhibitörü zaprinast (100 μM, 200 μM ve 400 μM) ile muamele edildi. Fotoreseptör hücre ölümü TUNEL testi kullanılarak ölçüldü ve analiz edildi ve eksplantlarda cGMP birikimi immünofloresan yoluyla doğrulandı. Maymunlar ve insanlar arasındaki hücre dağılımı ve morfolojisi, retina tabakası kalınlığı ve retinanın diğer fizyolojik özellikleri açısından yüksek derecede benzerlik göz önüne alındığında, in vitro retinal modelde cGMP-PKG sinyal yolunun kurulması, RD'nin patogenezi üzerine gelecekteki araştırmaları ve RD tedavisi için yeni ilaçların geliştirilmesi ve toksikofarmakolojisine yönelik çalışmaları kolaylaştırabilir.

Protokol

Hayvan çalışması, Zooloji Enstitüsü Etik İnceleme Komitesi, Çin Bilimler Akademisi (IACUC-PE-2022-06-002) ve Yunnan Üniversitesi hayvan etiği incelemesi ve hayvan protokolü (YNU20220149) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Retinal eksplantların hazırlanması

1. 1 ila 3 yaşları arasındaki vahşi tip makaklardan primat gözbebekleri elde edin, doku depolama çözeltisinde saklayın ve maymunlar kurban edildikten sonra veya doğal ölümden sonra enükleasyondan sonraki 3 saat içinde buz üzerinde taşıyın.
2. Proteinaz K çözeltisinin hazırlanması için, 25 mg proteinaz K'yı 250 μL damıtılmış suda çözün ve daha sonra çözeltinin 225 μL'sini 18.5 mL bazal ortama (R16) ekleyin.
3. Göz kürelerini 10 mL'de% 5 povidon-iyot (povidon-iyot: su = 1:19) içinde 30 saniye boyunca yıkayın ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için% 5 penisilin / streptomisin (PEN / STREP) :p hosphate tamponlu salin = 1:19 dakika boyunca 1:19'a batırın. Daha sonra, göz kürelerini 5 dakika boyunca 10 mL R16 ortamında inkübe edin.
4. Proteinaz K çözeltisini 37 ° C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın. Daha sonra, göz kürelerini 10 mL proteinaz K çözeltisine daldırın ve 2 dakika boyunca inkübe edin. Göz kürelerini 10 mL R16 + fetal sığır serumu (1: 1) çözeltisine batırın, 5 dakika inkübe edin ve ardından son bir yıkama için göz kürelerini 10 mL taze R16'ya aktarın.
5. Sklera, kornea, iris, lens ve vitreus gövdesini ayırın ve retinayı cımbız ve makasla 4 taraftan kesin (Şekil 1A-L).
6. Trefin bıçaklı retinal eksplantları beş bölüme ayırın - nazal / zamansal / üstün / alt taraf için 4 mm'lik bir trefin bıçağı ve orta taraf için 6 mm'lik bir trefin bıçağı (optik disk ve makula içeren; Şekil 1M-O). Optik sinir kafasından aşağıdaki mesafede kesin: nazal için 1,5 mm, geçici için 4 mm ve hem üst hem de alt taraf için 2 mm.
7. Retina eksplantlarını (retina ve koroid içeren) göz kapağı depresörü ile aktarın ve bunları ekin ortasına, fotoreseptör tarafı yukarı doğru yerleştirin (Şekil 1P). Retinayı tamamen örtmek için plakadaki zarın altına yaklaşık 1 mL komple ortam (BSA, transferrin, progesteron, insülin, T3, kortikosteron, B1 vitamini, B12 vitamini, retinol, retinil asetat, DL-tokoferol, tokoferil asetat, linoleik asit, L-sistein HCl, glutatyon, glutamin, C vitamini ile desteklenmiş R16) yerleştirin.

2. Primat retinal eksplant kültürü

1. Kültür retinal eksplantları tam ortamda ve nemlendirilmiş% 5 CO₂ ile havalandırılmış 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirilir.
2. Retinal kültür ortamına uygun konsantrasyonda ilaç tedavisi uygulayın (örneğin, 100 μM, 200 μM veya 400 μM konsantrasyonlarında zaprinest). Tedavi koşulu başına en az üç eksplant kullanın ve kontrol olarak ilaçsız eksplantlar kullanın. 4 gün boyunca ilaçla tedavi edin.

3. Sabitleme ve kriyo-kesitleme

1. Retinal eksplantları 45 dakika boyunca 1 mL paraformaldehit (PFA) ile inkübe edin, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile kısaca durulayın ve daha sonra 10 dakika boyunca% 10 sakaroz, 20 dakika boyunca% 20 sakkaroz ve% 30 sakkaroz ile 30 dakika boyunca inkübe edin (her retina eksplantı için 1 mL).
2. Aşağıdaki özelliklere sahip farklı bölgelerden elde edilen eksplantların boyutunda tutarlılık sağlamak için trefin bıçakları kullanarak retinal eksplantları kesin: çevrede dört kadran, merkezde 6 mm. Daha sonra, retinal eksplantları dokuyu örtmek için O.C.T. gömme ortamı ile bir teneke kutuya (yaklaşık 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) aktarın. Hemen, doku bölümlerini sıvı azot içinde dondurun ve saklamak için -20 ° C'lik bir buzdolabına koyun.
3. Agar'ı doku örneğini içeren küçük bir bloğa kırpmak için keskin bir bıçak kullanın, numune bloklarını 10 μm bölümlere ayırın ve yumuşak bir fırça kullanarak yapışma mikroskobu slaytlarına yerleştirin. Daha sonra, 40 ° C'de 45 dakika kurutun ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.

4. İmmünohistokimya (Şekil 2)

1. cGMP boyama
   1. Slaytları kurutun ve örnekleri örtmek için retina bölümlerinin etrafına sıvı bloker kalemle hidrofobik bir halka çizin.
   2. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 μL% 0.3 fosfat tampon salin ve slayt başına Triton X-100 (PBST) içine daldırın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici çözeltiye (% 5 normal eşek serumu,% 0.3 PBST,% 1 BSA,% 1 BSA,% 200 μL) daldırın.
   3. Numuneleri, 4 °C'de bloke edici çözeltide hazırlanan birincil antikor (1:250, koyun anti-cGMP, slayt başına 200 μL) ile gece boyunca inkübe edin ve daha sonra PBS ile 10 dakika (slayt başına 200 μL) 3x durulayın.
   4. Numuneleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikor (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, slayt başına 200 μL) ile inkübe edin ve ardından PBS ile 10 dakika, 3x durulayın. Numuneleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir antifade montaj ortamı ile örtün ve görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca 4 °C'de saklayın.
2. TÜNEL boyama
   1. Slaytları oda sıcaklığında 15 dakika kurutun ve sıvı bloker kalemle retina dokusu örneklerinin etrafına su itici bir bariyer halkası çizin ve ardından 15 dakika boyunca 40 mL PBS'de inkübe edin.
   2. Slaytları 37 °C'de 42 mL (beş slayt başına) TBS (0,05 M Tris-tampon) içinde inkübe edin. TBS'yi aspire edin ve numuneleri 5 dakika boyunca 6 μL proteinaz K ile inkübe edin. Ardından, slaytları her seferinde 5 dakika boyunca TBS ile 3 kez yıkayın.
   3. Slaytları choplin içinde 40 mL etanol-asetik asit çözeltisine maruz bırakın, şeffaf bir tabaka ile örtün ve 5 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin. Slaytları her seferinde 5 dakika boyunca TBS ile 3 kez yıkayın.
   4. Slaytları bloke edici çözeltiye maruz bırakın (% 1 BSA; ihtiyaca göre slayt başına 200-300 μL) ve 1 saat boyunca bir nem odasında inkübe edin.
   5. TUNEL kiti çözeltisi TMR kırmızısını aşağıdaki oranda hazırlayın: 62.50 μL bloke edici çözelti (% 1 BSA), 56.25 μL etiketleme çözeltisi (TMR-dUTP) ve 6.25 μL enzim (her slayt için oran). Slayt başına yaklaşık 130 μL bu çözeltiyi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ardından, slaytları PBS ile 5 dakika (slayt başına 200 μL), 2x yıkayın.
   6. 1-2 damla antifade montaj ortamı içeren kapak slaytlarını DAPI ile numunelerin üzerine yerleştirin ve ardından slaytları görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. cGMP boyama TÜNEL boyama ile kombine
   1. cGMP boyama işlemini TÜNEL boyama izledi. Adım 4.2.1'den adım 4.2.5'e kadar TÜNEL boyama adımlarını izleyin ve ardından adım 4.1.2'den adım 4.1.4'e kadar cGMP boyama adımlarına devam edin.
4. Kamera parametreleriyle ışık ve floresan mikroskobunu aşağıdaki gibi gerçekleştirin: pozlama süresi = 125 ms, ROI boyutu = 2752 x 2208, Renk = B / M. Yazılımı kullanarak görüntüleri yakalayın. Her bölümden 20x büyütmede bir dijital kamera ile dört farklı alanı resmedin ve DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), Z-Stack taramasının aralık = 1 μm ve isteğe bağlı = 1.251 μm olduğu retinanın merkezi alanlarından temsili resimler elde edin.

Sonuçlar

Bu çalışmada Makak maymunu retinal eksplant kültürü, retina-RPE-koroid kompleksini içeren eksplantlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 1, Ek Şekil S1). Ekli RPE ve koroid olmadan retinayı kullanan retina hücrelerinin in vitro kültürü ile karşılaştırıldığında, eksplant kültürümüz daha iyi hücre sağkalımını kolaylaştırır ve buna bağlı olarak fotoreseptör hücrelerin hayatta kalmasını uzatır.

Tartışmalar

Görsel fototransdüksiyon, ışık sinyallerinin gözün retinasındaki fotoreseptör hücreler tarafından elektrik sinyallerine dönüştürüldüğü biyolojik süreci ifade eder. Fotoreseptör hücreler, fototransdüksiyon yapabilen polarize nöronlardır ve dış segmentlerinin şekillerinden sonra çubuklar ve koniler olarak adlandırılan iki farklı fotoreseptör türü vardır. Çubuklar skotopik görmeden sorumludur ve koniler fotopik ve yüksek keskinlikte görmeden sorumludur. Kalıtsal RD, ilerleyici retina...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),