Органотипические культуры экплантатов сетчатки макаки

Резюме

Эксплантаты сетчатки, полученные от макак дикого типа, культивировали in vitro. Дегенерацию сетчатки и сигнальный путь цГМФ-ФКГ индуцировали с помощью ингибитора ФДЭ6 запринаста. Накопление цГМФ в эксплантах при различных концентрациях запринаста верифицировали с помощью иммунофлюоресценции.

Аннотация

Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток. Чрезмерная активация пути циклической гуанозинмонофосфата (цГМФ)-зависимой протеинкиназы (PKG) в фоторецепторных клетках вызывает гибель фоторецепторных клеток, особенно в моделях, содержащих мутации фосфодиэстеразы 6b (PDE6b). В предыдущих исследованиях RD использовались в основном мышиные модели, такие как мыши rd1 или rd10 . Учитывая генетические и физиологические различия между мышами и людьми, важно понять, в какой степени сетчатка приматов и грызунов сопоставима. Макаки имеют высокий уровень генетического сходства с людьми. Таким образом, для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro были отобраны макаки дикого типа (в возрасте 1-3 лет), включающие комплекс сетчато-ретинальный пигментный эпителий (RPE)-сосудистая оболочка. Эти эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 для индукции сигнального пути цГМФ-ПКГ и моделирования патогенеза РД. Накопление цГМФ и гибель клеток в эксплантах сетчатки приматов были впоследствии проверены с помощью иммунофлюоресценции и анализа TUNEL. Модель сетчатки приматов, созданная в этом исследовании, может служить для актуальных и эффективных исследований механизмов цГМФ-PKG-зависимой РД, а также для разработки будущих подходов к лечению.

Введение

Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток и обусловлена мутациями в широком спектре патогенных генов¹. Конечным результатом РД является потеря зрения, и в подавляющем большинстве случаев болезнь остается неизлечимой по сей день. Поэтому важно изучать клеточные механизмы, приводящие к гибели фоторецепторов, используя модели, которые точно представляют состояние болезни человека. Здесь особый интерес представляют модели, основанные на приматах, из-за их близости к человеку. Примечательно, что такие модели могут способствовать разработке соответствующих терапевтических вмешательств, которые могут остановить или отсрочить гибель фоторецепторных клеток.

Предыдущие исследования механизмов гибели клеток при РД показали, что снижение или потеря активности фосфодиэстеразы 6 (ФДЭ6), вызванная мутациями генов, запускающих РД, приводит к снижению гидролиза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)^2,3. цГМФ является специфическим агонистом циклических нуклеотид-управляемых ионных каналов (CNGC) во внешних сегментах стержней (АФК), а также ключевой молекулой, ответственной за преобразование световых сигналов в электрические сигналы в фоторецепторных клетках^{позвоночных 4}. Восстановленный гидролиз цГМФ вызывает накопление цГМФ в АФК, что приводит к открытию КНГК ⁵. Следовательно, пути фототрансдукции активируются, что приводит к увеличению концентрации катионов в фоторецепторных клетках. Этот процесс налагает метаболическую нагрузку на фоторецепторы, которая при чрезмерной активации, например, мутациями в ФДЭ6, может вызвать гибель клеток.

Многие исследования показали, что значительное перенакопление цГМФ в фоторецепторах мышиных моделей с различными мутациями гена RD может вызывать активацию цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG)^3,6. Это приводит к значительному увеличению умирающих, TUNEL-положительных клеток и постепенному истончению клеточного слоя фоторецепторов. Предыдущие исследования показывают, что гиперактивация ФКГ, вызванная повышенным уровнем цГМФ, является необходимым и достаточным условием для индукции гибели фоторецепторных клеток ^2,5. Исследования на различных мышиных моделях РД также показали, что активация ПКГ, вызванная повышенными уровнями цГМФ в фоторецепторах, приводит к чрезмерной активации нижестоящих эффекторов, таких как поли-АДФ-рибоза-полимераза 1 (PARP1), гистондеацетилазы (HDAC) и кальпаин 2,7,8,9. Это подразумевает причинно-следственные связи между этими различными белками-мишенями и гибелью фоторецепторных клеток.

Однако предыдущие исследования патологии, токсикофармакологии и терапии РД были в основном основаны на мышиных моделях РД^10,11,12. Тем не менее, остаются огромные трудности в клиническом переводе этих результатов. Это связано со значительными генетическими и физиологическими различиями между мышами и людьми, особенно в отношении структуры сетчатки. Напротив, нечеловекообразные приматы (NHP) также имеют высокую степень сходства с людьми в отношении генетических характеристик, физиологических моделей и регуляции факторов окружающей среды. Например, оптогенетическая терапия была исследована как средство восстановления активности сетчатки в модели^{NHP 13}. Лингам и его коллеги продемонстрировали, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки-предшественники сетчатки могут спасти повреждение колбочковых фоторецепторов в NHP¹⁴. Поэтому модели NHP важны для изучения патогенеза РД и разработки эффективных методов лечения. В частности, NHP-модели РД, демонстрирующие патогенные механизмы, сходные с таковыми у людей, могут сыграть решающую роль в исследованиях по разработке и токсикофармакологическому анализу in vivo новых лекарств.

Ввиду длительного жизненного цикла, высокого уровня технических трудностей и высоких затрат, связанных с созданием моделей приматов in vivo , мы создали модель инопланетных приматов (NHP) in vitro с использованием культур эксплантированной сетчатки макак. Во-первых, были отобраны макаки дикого типа в возрасте 1-3 лет для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro , которые включали комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка. Затем эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ), чтобы индуцировать сигнальный путь цГМФ-ПКГ. Гибель фоторецепторных клеток была количественно определена и проанализирована с помощью анализа TUNEL, а накопление цГМФ в эксплантах было проверено с помощью иммунофлуоресценции. Учитывая высокую степень сходства в отношении распределения и морфологии клеток, толщины слоя сетчатки и других физиологических характеристик сетчатки у обезьян и человека, установление сигнального пути цГМФ-ПКГ в модели сетчатки in vitro может способствовать будущим исследованиям патогенеза РД, а также исследованиям в области разработки и токсикофармакологии новых препаратов для лечения РД.

протокол

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Комитетом по этике Института зоологии Китайской академии наук (IACUC-PE-2022-06-002), а также обзором этики животных и протоколом животных Юньнаньского университета (YNU20220149).

1. Приготовление эксплантатов сетчатки

1. Получают глазные яблоки приматов от макак дикого типа в возрасте от 1 до 3 лет, хранят в растворе для хранения тканей и транспортируют на льду в течение 3 часов после энуклеации после принесения обезьян в жертву или после естественной смерти.
2. Для приготовления раствора протеиназы К растворяют 25 мг протеиназы К в 250 мкл дистиллированной воды, а затем добавляют 225 мкл раствора к 18,5 мл базальной среды (R16).
3. Промойте глазные яблоки в 10 мл 5% повидон-йода (повидон-йод: вода = 1:19) в течение 30 с и окуните их в 5% пенициллин/стрептомицин (PEN/STREP):p хосфат-буферный физиологический раствор = 1:19 на 1 мин, чтобы избежать бактериального загрязнения. Затем инкубируйте глазные яблоки в 10 мл среды R16 в течение 5 минут.
4. Предварительно нагрейте раствор протеиназы К в инкубаторе с температурой 37 °C. Затем погрузите глазные яблоки в 10 мл раствора протеиназы К и инкубируйте в течение 2 мин. Погрузите глазные яблоки в 10 мл раствора R16 + фетальной бычьей сыворотки (1:1), инкубируйте в течение 5 минут, а затем перенесите глазные яблоки в 10 мл свежего R16 для окончательного промывания.
5. Отделите склеру, роговицу, радужную оболочку, хрусталик и стекловидное тело и разрежьте сетчатку с 4 сторон пинцетом и ножницами (рис. 1A-L).
6. Разрежьте эксплантаты сетчатки с лезвиями трепана, разделенные на пять частей: лезвие трепанта диаметром 4 мм для носовой/височной/верхней/нижней стороны и лезвие трепана, диаметром 6 мм для центральной стороны (содержащее диск зрительного нерва и макулу; Рисунок 1М-О). Разрез на следующем расстоянии от головки зрительного нерва: 1,5 мм для носа, 4 мм для височной и 2 мм для верхней и нижней стороны.
7. Перенесите эксплантаты сетчатки (содержащие сетчатку и сосудистую оболочку) с депрессором век и поместите их в середину вставки фоторецепторной стороной вверх (рис. 1P). Поместите примерно 1 мл полной среды (R16 с добавлением BSA, трансферрина, прогестерона, инсулина, Т3, кортикостерона, витамина B1, витамина B12, ретинола, ретинилацетата, DL-токоферола, токоферилацетата, линолевой кислоты, L-цистеина HCl, глутатиона, глутамина, витамина С) под мембрану на пластине, чтобы полностью покрыть сетчатку.

2. Культура эксплантата сетчатки приматов

1. Культуру сетчатки эксплантируют в полной среде и помещают в инкубатор с температурой 37 °C, аэрируемый увлажненным 5%_CO2.
2. Применяют препарат в соответствующей концентрации к питательной среде сетчатки (например, запринаст в концентрациях 100 мкМ, 200 мкМ или 400 мкМ). Используйте не менее трех эксплантатов в каждом состоянии лечения и используйте эксплантаты без лекарства в качестве контроля. Лечат препаратом в течение 4 дней.

3. Фиксация и криосекционирование

1. Инкубируют эксплантаты сетчатки с 1 мл параформальдегида (ПФА) в течение 45 мин, кратковременно промывают их 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), а затем инкубируют с 10% сахарозой в течение 10 мин, 20% сахарозой в течение 20 мин и 30% сахарозой в течение 30 мин (1 мл для каждого эксплантата сетчатки).
2. Разрежьте эксплантаты сетчатки с помощью лезвий трепана, чтобы обеспечить постоянство размеров эксплантатов, полученных из разных участков со следующими характеристиками: четыре квадранта на периферии, 6 мм в центре. Затем перенесите эксплантаты сетчатки в жестяную коробку (примерно 1,5 см x 1,5 см x 1,5 см) со средой для встраивания O.C.T., чтобы покрыть ткань. Немедленно заморозьте срезы тканей в жидком азоте и поместите в холодильник с температурой -20 °C для хранения.
3. Используйте острое лезвие, чтобы разрезать агар на небольшой блок, содержащий образец ткани, разрежьте блоки образца на участки размером 10 мкм и поместите их на предметные стекла адгезионного микроскопа с помощью мягкой щетки. Затем высушите в течение 45 минут при 40 ° C и храните при -20 ° C до использования.

4. Иммуногистохимия (рис. 2)

1. Окрашивание cGMP
   1. Высушите предметные стекла и нарисуйте гидрофобное кольцо вокруг участков сетчатки с помощью жидкостной блокирующей ручки, чтобы покрыть образцы.
   2. Погрузите предметные стекла в 200 мкл 0,3% фосфатного буферного физиологического раствора и Triton X-100 на предметное стекло (PBST) на 10 мин при комнатной температуре, а затем в блокирующий раствор (5% обычная ослиная сыворотка, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 мкл на предметное стекло) в течение 1 ч при комнатной температуре.
   3. Инкубируйте образцы в течение ночи с первичным антителом (1:250, овец против цГМФ, 200 мкл на предметное стекло), приготовленным в блокирующем растворе при 4 ° C, а затем промывайте PBS в течение 10 мин (200 мкл на предметное стекло) 3 раза.
   4. Инкубируйте образцы с вторичными антителами (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 мкл на предметное стекло) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промойте PBS в течение 10 мин, 3 раза. Накройте образцы антибактериальной монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и храните при температуре 4 °C не менее 30 минут перед визуализацией.
2. Окрашивание TUNEL
   1. Высушите предметные стекла при комнатной температуре в течение 15 минут и нарисуйте водоотталкивающее барьерное кольцо вокруг образцов тканей сетчатки с помощью ручки-блокатора жидкости, а затем инкубируйте их в 40 мл PBS в течение 15 минут.
   2. Инкубируют предметные стекла в 42 мл (на пять предметных стекол) TBS (0,05 М трис-буфера) при 37 °C. Аспирируйте TBS и инкубируйте образцы с 6 мкл протеиназы K в течение 5 мин. Затем промывайте предметные стекла 3 раза с помощью TBS в течение 5 минут каждый раз.
   3. Подвергните предметные стекла воздействию 40 мл раствора этанол-уксусной кислоты в чоплине, накройте прозрачным листом и выдерживайте при -20 °C в течение 5 мин. Промывайте предметные стекла 3 раза с помощью TBS в течение 5 минут каждый раз.
   4. Подвергните предметные стекла воздействию блокирующего раствора (1% BSA; 200-300 мкл на предметное стекло в соответствии с требованиями) и инкубируйте во влажной камере в течение 1 часа.
   5. Приготовьте раствор набора TUNEL, красный TMR, в следующей пропорции: 62,50 мкл блокирующего раствора (1% BSA), 56,25 мкл этикетирующего раствора (TMR-dUTP) и 6,25 мкл фермента (пропорция для каждого предметного стекла). Добавляют приблизительно 130 мкл этого раствора на предметное стекло и выдерживают при 37 °C в течение 1 ч. Затем промойте предметные стекла PBS в течение 5 минут (200 мкл на предметное стекло), 2 раза.
   6. Наложите на образцы предметные стекла, содержащие 1-2 капли антифавальной монтажной среды, с DAPI, а затем инкубируйте предметные стекла при 4 °C в течение не менее 30 минут перед визуализацией.
3. Окрашивание cGMP в сочетании с окрашиванием TUNEL
   1. Окрашивание cGMP сопровождалось окрашиванием TUNEL. Следуйте шагам окрашивания TUNEL от шага 4.2.1 до шага 4.2.5, а затем продолжите шаги окрашивания cGMP от шага 4.1.2 до шага 4.1.4.
4. Выполняйте световую и флуоресцентную микроскопию с параметрами камеры следующим образом: время экспозиции = 125 мс, размер ROI = 2752 x 2208, цвет = B/M. Делайте снимки с помощью программного обеспечения. Сфотографируйте четыре различных поля с помощью цифровой камеры с 20-кратным увеличением каждого участка и получите репрезентативные изображения из центральных областей сетчатки с помощью DAPI (465 нм), EGFP (509 нм), TMP (578 нм), при этом сканирование Z-Stack имеет интервал = 1 мкм и опционально = 1,251 мкм.

Результаты

В этом исследовании культуру эксплантата сетчатки макаки проводили с использованием эксплантов, содержащих комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка (рис. 1, дополнительный рисунок S1). По сравнению с культивированием клеток сетчатки in vitro с использованием ?...

Обсуждение

Визуальная фототрансдукция относится к биологическому процессу, посредством которого световые сигналы преобразуются в электрические сигналы фоторецепторными клетками в сетчатке глаза. Фоторецепторные клетки представляют собой поляризованные нейроны, способные к фототрансдукции, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),