Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

Resumo

Explantes retinianos obtidos de macacos selvagens foram cultivados in vitro. A degeneração retiniana e a via de sinalização GMPc-PKG foram induzidas com o uso do inibidor de PDE6 zaprinast. O acúmulo de GMPc nos explantes em diferentes concentrações de zaprinast foi verificado por imunofluorescência.

Resumo

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras. A superativação da via da proteína quinase dependente de guanosina monofosfato (GMPc) cíclica (PKG) em células fotorreceptoras causa morte celular fotorreceptora, especialmente em modelos que abrigam mutações na fosfodiesterase 6b (PDE6b). Estudos prévios sobre DR utilizaram principalmente modelos murinos, como camundongos rd1 ou rd10 . Dadas as diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, é importante entender até que ponto as retinas de primatas e roedores são comparáveis. Os macacos compartilham um alto nível de semelhança genética com os seres humanos. Portanto, macacos selvagens (com idade entre 1-3 anos) foram selecionados para o cultivo in vitro de explantes da retina que incluíram o complexo retina-epitélio pigmentar da retina (EPR)-coroide. Esses explantes foram tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast para induzir a via de sinalização GMPc-PKG e simular a patogênese da DR. O acúmulo de GMPc e a morte celular em explantes de retina de primatas foram posteriormente verificados usando imunofluorescência e o ensaio TUNEL. O modelo de retina de primatas estabelecido neste estudo pode servir para estudos relevantes e efetivos sobre os mecanismos da DR dependente de GMPc-PKG, bem como para o desenvolvimento de futuras abordagens de tratamento.

Introdução

A degeneração hereditária da retina (DR) é caracterizada pela morte progressiva das células fotorreceptoras e causada por mutações em uma grande variedade de genes patogênicos1. O resultado final da DR é a perda da visão e, na grande maioria dos casos, a doença permanece intratável até hoje. Portanto, é importante estudar os mecanismos celulares que levam à morte dos fotorreceptores usando modelos que representem fielmente a condição da doença humana. Aqui, os modelos baseados em primatas são de particular interesse devido à sua proximidade com os humanos. Notadamente, tais modelos podem avançar no desenvolvimento de intervenções terapêuticas apropriadas que possam deter ou retardar a morte celular dos fotorreceptores.

Pesquisas prévias sobre os mecanismos de morte celular na DR demonstraram que a diminuição ou perda da atividade da fosfodiesterase 6 (PDE6) causada por mutações no gene desencadeante da DR leva à redução da hidrólise do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc)^2,3. O GMPc é um agonista específico dos canais iônicos dependentes de nucleotídeo cíclico (CNGCs) nos segmentos externos dos bastonetes (ROSs) e também é uma molécula-chave responsável pela conversão de sinais luminosos em sinais elétricos em células fotorreceptoras de^vertebrados4. A hidrólise reduzida do GMPc causa o acúmulo de GMPc em ROSs, levando à abertura de CNGCs ⁵. Consequentemente, as vias de fototransdução são ativadas, resultando em um aumento nas concentrações de cátions nas células fotorreceptoras. Esse processo impõe uma carga metabólica aos fotorreceptores, que quando superativados, por exemplo, por mutações na PDE6, podem causar morte celular.

Muitos estudos têm demonstrado que um acúmulo significativo de GMPc em fotorreceptores de modelos de camundongos com diferentes mutações no gene da DR pode causar a ativação da proteína quinase dependente de GMPc (PKG)^3,6. Isso leva a um aumento substancial de células TUNEL-positivas e a um afinamento gradual da camada de células fotorreceptoras. Estudos prévios sugerem que a superativação de PKG causada por níveis elevados de GMPc é uma condição necessária e suficiente para a indução de morte de células fotorreceptoras ^2,5. Estudos em diferentes modelos murinos de DR também mostraram que a ativação de PKG induzida por níveis elevados de GMPc em fotorreceptores leva à superativação de efetores a jusante, como poli-ADP-ribose polimerase 1 (PARP1), histona desacetilase (HDAC) e calpaína 2,7,8,9. Isso implica associações causais entre essas diferentes proteínas-alvo e a morte de células fotorreceptoras.

No entanto, pesquisas anteriores sobre a patologia, toxicofarmacologia e terapia da DR foram baseadas principalmente em modelos murinos para DR^10,11,12. No entanto, ainda persistem imensas dificuldades na tradução clínica desses resultados. Isso se deve às consideráveis diferenças genéticas e fisiológicas entre camundongos e humanos, especialmente no que diz respeito à estrutura da retina. Em contraste, primatas não humanos (NHPs) também compartilham um alto grau de similaridade com humanos no que diz respeito a características genéticas, padrões fisiológicos e regulação de fatores ambientais. Por exemplo, a terapia optogenética foi investigada como um meio de restaurar a atividade retiniana em um modelo de PNH¹³. Lingam e seus colegas demonstraram que as células precursoras de fotorreceptores da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos de boa prática de fabricação podem resgatar danos ao fotorreceptor do cone no NHP¹⁴. Portanto, modelos de PNH são importantes para a exploração da patogênese da DR e o desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Em particular, modelos de PNH de DR, exibindo mecanismos patogênicos semelhantes aos de humanos, poderiam desempenhar um papel crítico em estudos sobre o desenvolvimento e análise toxicofarmacológica in vivo de novos fármacos.

Tendo em vista o longo ciclo de vida, o alto nível de dificuldades técnicas e o alto custo envolvido no estabelecimento de modelos in vivo de primatas, estabelecemos um modelo in vitro de primata não humano (NHP) usando culturas de retina de macaco explantado. Primeiramente, macacos selvagens com idade entre 1 e 3 anos foram selecionados para cultivo in vitro de explantes da retina, que incluíram o complexo retina-EPR-coróide. Os explantes foram então tratados com diferentes concentrações do inibidor de PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM e 400 μM) para induzir a via de sinalização GMP-PKG. A morte de células fotorreceptoras foi quantificada e analisada pelo ensaio TUNEL e o acúmulo de GMPc nos explantes foi verificado por imunofluorescência. Dado o alto grau de similaridade com relação à distribuição e morfologia celular, espessura da camada retiniana e outras características fisiológicas da retina entre macacos e humanos, o estabelecimento da via de sinalização GMPc-PKG no modelo retiniano in vitro pode facilitar futuras pesquisas sobre a patogênese da DR, bem como estudos sobre o desenvolvimento e toxicofarmacologia de novas drogas para o tratamento da DR.

Protocolo

O estudo animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Revisão de Ética do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências (IACUC-PE-2022-06-002), e revisão de ética animal e protocolo animal da Universidade de Yunnan (YNU20220149).

1. Preparação de explantes de retina

1. Obter globos oculares de primatas de macacos selvagens, com idades entre 1 e 3 anos de idade, armazenar em solução de armazenamento de tecidos e transportá-los no gelo dentro de 3 h após a enucleação após o sacrifício dos macacos ou após a morte natural.
2. Para a preparação da solução de proteinase K, dissolver 25 mg de proteinase K em 250 μL de água destilada e, em seguida, adicionar 225 μL da solução a 18,5 ml de meio basal (R16).
3. Lavar os globos oculares em 10 mL de iodopovidona a 5% (iodopovidona: água = 1:19) por 30 s e mergulhá-los em penicilina/estreptomicina a 5% (PEN/STREP):p solução salina tamponada com hosfato = 1:19 por 1 min para evitar contaminação bacteriana. Em seguida, incubar os globos oculares em 10 mL de meio R16 por 5 min.
4. Pré-aqueça a solução de proteinase K em incubadora a 37 °C. Em seguida, imergir os globos oculares em 10 mL de solução de proteinase K e incubar por 2 min. Imergir os globos oculares em 10 mL de solução de R16 + soro fetal bovino (1:1), incubar por 5 min e, em seguida, transferir os globos oculares para 10 mL de R16 fresco para uma lavagem final.
5. Separe a esclera, córnea, íris, cristalino e corpo vítreo e corte a retina de 4 lados com pinça e tesoura (Figura 1A-L).
6. Cortar explantes de retina com lâminas de trefina em cinco seções - uma lâmina de trefina de 4 mm para o lado nasal/temporal/superior/inferior e uma lâmina de trefina de 6 mm para o lado central (contendo disco óptico e mácula; Figura 1M-O). Corte à seguinte distância da cabeça do nervo óptico: 1,5 mm para o lado nasal, 4 mm para o temporal e 2 mm para o lado superior e inferior.
7. Transferir os explantes de retina (contendo retina e coroide) com depressor palpebral e colocá-los no meio da inserção, fotorreceptor de lado para cima (Figura 1P). Coloque aproximadamente 1 mL de meio completo (R16 suplementado com BSA, transferrina, progesterona, insulina, T3, corticosterona, vitamina B1, vitamina B12, retinol, acetato de retinila, DL-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido linoleico, L-cisteína HCl, glutationa, glutamina, vitamina C) abaixo da membrana na placa para cobrir totalmente a retina.

2. Cultura de explantes retinianos de primatas

1. Cultivar explantes de retina em meio completo e colocar em estufa a 37 °C aerada com 5% de CO₂ umedificada.
2. Aplicar o tratamento medicamentoso em concentração apropriada no meio de cultura da retina (por exemplo, zaprinast em concentrações de 100 μM, 200 μM ou 400 μM). Utilizar pelo menos três explantes por condição de tratamento e utilizar explantes sem fármaco como controle. Tratar com droga por 4 dias.

3. Fixação e criosseccionamento

1. Incubar explantes da retina com 1 mL de paraformaldeído (PFA) por 45 min, lavá-los brevemente com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, incubar com sacarose a 10% por 10 min, sacarose a 20% por 20 min e sacarose a 30% por 30 min (1 mL para cada explante de retina).
2. Cortar explantes de retina utilizando lâminas de trefina para garantir consistência no tamanho dos explantes obtidos de diferentes locais com as seguintes características: quatro quadrantes na periferia, 6 mm no centro. Em seguida, transfira os explantes da retina para uma caixa de flandres (cerca de 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) com meio de incorporação O.C.T. para cobrir o tecido. Congele imediatamente as secções de tecido em azoto líquido e coloque num frigorífico a -20 °C para armazenamento.
3. Use uma lâmina afiada para aparar o ágar em um pequeno bloco contendo a amostra de tecido, corte os blocos de amostra em seções de 10 μm e coloque-os em lâminas de microscópio de adesão usando uma escova macia. Em seguida, secar por 45 min a 40 °C e armazenar a -20 °C até o uso.

4. Imuno-histoquímica (Figura 2)

1. Coloração GMPc
   1. Seque as lâminas e desenhe um anel hidrofóbico ao redor das seções da retina com uma caneta bloqueadora de líquido para cobrir as amostras.
   2. Imergir as lâminas em 200 μL de solução salina tampão fosfato a 0,3% e Triton X-100 por lâmina (PBST) por 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, em solução de bloqueio (5% de soro de burro normal, 0,3% PBST, 1% BSA, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente.
   3. Incubar as amostras durante a noite com o anticorpo primário (1:250, anti-GMPc de ovelha, 200 μL por lâmina) preparado na solução de bloqueio a 4 °C e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min (200 μL por lâmina) 3x.
   4. Incubar as amostras com anticorpo secundário (1:300, Burro anti ovino Alxea Fluor 488, 200 μL por lâmina) por 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, enxaguar com PBS por 10 min, 3x. Cobrir as amostras com um meio de montagem antifade contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e conservar a 4 °C durante, pelo menos, 30 minutos antes da obtenção de imagens.
2. Coloração TUNEL
   1. Secar as lâminas à temperatura ambiente por 15 min e desenhar um anel de barreira hidrorrepelente ao redor de amostras de tecido da retina com a caneta bloqueadora de líquido e, em seguida, incubá-las em 40 mL de PBS por 15 min.
   2. Incubar as lâminas em 42 mL (por cinco lâminas) de TBS (0,05 M Tris-buffer) a 37 °C. Aspirar a TBS e incubar as amostras com 6 μL de proteinase K por 5 min. Em seguida, lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
   3. Expor as lâminas a 40 mL de solução de etanol-ácido acético na choplin, cobrir com uma folha transparente e incubar a -20 °C por 5 min. Lave as lâminas 3x com TBS por 5 min de cada vez.
   4. Expor as lâminas à solução de bloqueio (BSA a 1%; 200-300 μL por lâmina conforme a necessidade) e incubar em uma câmara de umidade por 1 h.
   5. Preparar a solução do kit TUNEL, vermelho TMR, na seguinte proporção: 62,50 μL de solução de bloqueio (BSA a 1%), 56,25 μL de solução de marcação (TMR-dUTP) e 6,25 μL de enzima (proporção para cada lâmina). Adicionar cerca de 130 μL desta solução por lâmina e incubar a 37 °C durante 1 h. Em seguida, lave as lâminas com PBS por 5 min (200 μL por lâmina), 2x.
   6. Coloque as lâminas de cobertura contendo 1-2 gotas de meio de montagem antifade com DAPI sobre as amostras e, em seguida, incube as lâminas a 4 °C por pelo menos 30 minutos antes da obtenção de imagens.
3. Coloração cGMP combinada com coloração TUNEL
   1. A coloração GMPc foi seguida pela coloração TUNEL. Siga os passos da coloração TUNEL do passo 4.2.1 ao passo 4.2.5 e, em seguida, continue os passos da coloração cGMP do passo 4.1.2 ao passo 4.1.4.
4. Realizar microscopia de luz e fluorescência com os parâmetros da câmera da seguinte forma: tempo de exposição = 125 ms, tamanho da ROI = 2752 x 2208, Cor = B/M. Capture imagens usando o software. Fotografar quatro campos diferentes com uma câmera digital com aumento de 20x de cada corte e obter fotos representativas das áreas centrais da retina usando DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), com varredura Z-Stack com intervalo = 1 μm e opcional = 1,251 μm.

Resultados

Neste estudo, a cultura de explantes de retina de macacos macacos foi realizada utilizando explantes contendo o complexo retina-EPR-coróide (Figura 1, Figura Suplementar S1). Em comparação com a cultura in vitro de células da retina usando a retina sem o EPR e a coroide anexados, nossa cultura de explantes facilita uma melhor sobrevivência celular e, consequentemente, prolonga a sobrevivência das células fotorreceptoras.

Foram util...

Discussão

A fototransdução visual refere-se ao processo biológico pelo qual os sinais luminosos são convertidos em sinais elétricos por células fotorreceptoras dentro da retina do olho. As células fotorreceptoras são neurônios polarizados capazes de fototransdução, e existem dois tipos diferentes de fotorreceptores denominados bastonetes e cones após as formas de seus segmentos externos. Os bastões são responsáveis pela visão escotópica e os cones são responsáveis pela visão fotópica e de alta acuidade. A DR h...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),