Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Zusammenfassung

Netzhautexplantate von Wildtyp-Makaken wurden in vitro kultiviert. Die Netzhautdegeneration und der cGMP-PKG-Signalweg wurden mit dem PDE6-Inhibitor Zaprinast induziert. Die cGMP-Akkumulation in den Explantaten bei unterschiedlichen Zapinast-Konzentrationen wurde mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen.

Zusammenfassung

Die erbliche Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet. Eine Überaktivierung des zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-abhängigen Proteinkinase-Signalwegs (PKG) in Photorezeptorzellen führt zum Tod von Photorezeptorzellen, insbesondere in Modellen mit Phosphodiesterase 6b (PDE6b)-Mutationen. Frühere Studien zu RD haben hauptsächlich Mausmodelle wie rd1 - oder rd10-Mäuse verwendet. Angesichts der genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ist es wichtig zu verstehen, inwieweit die Netzhaut von Primaten und Nagetieren vergleichbar ist. Makaken haben eine hohe genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen. Daher wurden Wildtyp-Makaken (im Alter von 1-3 Jahren) für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-Retinal-Pigmentepithel (RPE)-Aderhaut-Komplex enthielten. Diese Explantaten wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren und die RD-Pathogenese zu simulieren. Die cGMP-Akkumulation und der Zelltod in Netzhautexplantaten von Primaten wurden anschließend mit Hilfe von Immunfluoreszenz und dem TUNEL-Assay verifiziert. Das in dieser Studie etablierte Primaten-Netzhautmodell kann für relevante und effektive Studien zu den Mechanismen der cGMP-PKG-abhängigen RD sowie für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsansätze dienen.

Einleitung

Die hereditäre Netzhautdegeneration (RD) ist durch einen fortschreitenden Zelltod der Photorezeptoren gekennzeichnet und wird durch Mutationen in einer Vielzahl von pathogenen Genen verursacht¹. Das Endergebnis von RD ist der Verlust des Sehvermögens, und in den allermeisten Fällen ist die Krankheit bis heute nicht behandelbar. Daher ist es wichtig, die zellulären Mechanismen, die zum Absterben von Photorezeptoren führen, mit Modellen zu untersuchen, die den menschlichen Krankheitszustand originalgetreu abbilden. Hier sind primatenbasierte Modelle aufgrund ihrer Nähe zum Menschen von besonderem Interesse. Insbesondere können solche Modelle die Entwicklung geeigneter therapeutischer Interventionen vorantreiben, die den Zelltod der Photorezeptoren stoppen oder verzögern können.

Frühere Forschungen zu den Mechanismen des Zelltods bei RD haben gezeigt, dass die Abnahme oder der Verlust der Phosphodiesterase 6 (PDE6)-Aktivität, die durch RD-auslösende Genmutationen verursacht wird, zu einer verminderten Hydrolyse von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP)^2,3 führt. cGMP ist ein spezifischer Agonist der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle (CNGCs) in den äußeren Stäbchensegmenten (ROS) und ist auch ein Schlüsselmolekül, das für die Umwandlung von Lichtsignalen in elektrische Signale in Photorezeptorzellen von Wirbeltieren verantwortlich ist⁴. Eine reduzierte cGMP-Hydrolyse führt zu einer Akkumulation von cGMP in ROS, was zur Öffnung von CNGCs führt ⁵. Folglich werden die Phototransduktionswege aktiviert, was zu einem Anstieg der Kationenkonzentrationen in den Photorezeptorzellen führt. Dieser Prozess belastet die Photorezeptoren metabolisch, was bei Überaktivierung z.B. durch Mutationen in PDE6 zum Zelltod führen kann.

Viele Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Überakkumulation von cGMP in Photorezeptoren von Mausmodellen mit verschiedenen RD-Genmutationen die Aktivierung der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) verursachen ^kann3,6. Dies führt zu einer deutlichen Zunahme absterbender, TUNEL-positiver Zellen und zu einer allmählichen Ausdünnung der Photorezeptorzellschicht. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die durch erhöhte cGMP-Spiegel verursachte PKG-Überaktivierung eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Induktion des Photorezeptorzelltods ist ^2,5. Studien an verschiedenen Mausmodellen von RD haben auch gezeigt, dass die PKG-Aktivierung, die durch erhöhte cGMP-Spiegel in Photorezeptoren induziert wird, zu einer Überaktivierung von nachgeschalteten Effektoren wie Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1 (PARP1), Histon-Deacetylase (HDAC) und Calpain 2,7,8,9 führt. Dies impliziert kausale Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zielproteinen und dem Tod von Photorezeptorzellen.

Bisherige Forschungen zur Pathologie, Toxikopharmakologie und Therapie von RD basierten jedoch hauptsächlich auf Mausmodellen für RD^10,11,12. Dennoch gibt es nach wie vor immense Schwierigkeiten bei der klinischen Translation dieser Ergebnisse. Dies ist auf die erheblichen genetischen und physiologischen Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen zurückzuführen, insbesondere in Bezug auf die Netzhautstruktur. Im Gegensatz dazu weisen nicht-menschliche Primaten (NHPs) auch ein hohes Maß an Ähnlichkeit mit dem Menschen in Bezug auf genetische Merkmale, physiologische Muster und die Regulation von Umweltfaktoren auf. So wurde beispielsweise die optogenetische Therapie als Mittel zur Wiederherstellung der Netzhautaktivität in einem NHP-Modell untersucht¹³. Lingam und seine Kollegen zeigten, dass vom Menschen induzierte pluripotente Stammzellen, die aus retinalen Photorezeptor-Vorläuferzellen gewonnen werden, in der guten Herstellungspraxis eine Schädigung des Zapfen-Photorezeptors in NHP¹⁴ retten können. Daher sind NHP-Modelle wichtig für die Erforschung der RD-Pathogenese und die Entwicklung effektiver Behandlungsmethoden. Insbesondere NHP-Modelle von RD, die ähnliche pathogene Mechanismen wie beim Menschen aufweisen, könnten eine entscheidende Rolle bei Studien zur Entwicklung und In-vivo-toxikopharmakologischen Analyse neuer Medikamente spielen.

Angesichts des langen Lebenszyklus, der hohen technischen Schwierigkeiten und der hohen Kosten, die mit der Etablierung von In-vivo-Primatenmodellen verbunden sind, haben wir ein in vitro nicht-humanes Primatenmodell (NHP) unter Verwendung von Kulturen explantierter Makaken-Netzhaut etabliert. Zunächst wurden Wildtyp-Makaken im Alter von 1-3 Jahren für die In-vitro-Kultur von Netzhautexplantaten ausgewählt, die den Retina-RPE-Aderhaut-Komplex enthielten. Explantate wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen des PDE6-Inhibitors Zapinast (100 μM, 200 μM und 400 μM) behandelt, um den cGMP-PKG-Signalweg zu induzieren. Der Zelltod der Photorezeptoren wurde mit dem TUNEL-Assay quantifiziert und analysiert, und die cGMP-Akkumulation in Explantaten wurde mittels Immunfluoreszenz verifiziert. Angesichts der hohen Ähnlichkeit in Bezug auf Zellverteilung und -morphologie, Netzhautschichtdicke und andere physiologische Eigenschaften der Netzhaut zwischen Affen und Menschen könnte die Etablierung des cGMP-PKG-Signalwegs im In-vitro-Netzhautmodell zukünftige Forschungen zur Pathogenese der RD sowie Studien zur Entwicklung und Toxikopharmakologie neuer Medikamente zur RD-Behandlung erleichtern.

Protokoll

Die Tierstudie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Zoologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (IACUC-PE-2022-06-002) und der Tierethikprüfung und dem Tierprotokoll der Universität Yunnan (YNU20220149) geprüft und genehmigt.

1. Herstellung von Netzhautexplantaten

1. Die Augäpfel von Primaten werden von Wildtyp-Makaken im Alter von 1 bis 3 Jahren gewonnen, in einer Gewebeaufbewahrungslösung gelagert und innerhalb von 3 Stunden nach der Enukleation nach der Tötung der Affen oder nach dem natürlichen Tod auf Eis transportiert.
2. Für die Herstellung der Proteinase-K-Lösung werden 25 mg Proteinase K in 250 μl destilliertem Wasser gelöst und dann 225 μl der Lösung zu 18,5 ml Basalmedium (R16) gegeben.
3. Waschen Sie die Augäpfel 30 s lang in 10 ml 5%igem Povidon-Jod (Povidon-Jod: Wasser = 1:19) und tauchen Sie sie 1 Minute lang in 5%iges Penicillin/Streptomycin (PEN/STREPTOK):p Hosphat-gepufferte Kochsalzlösung = 1:19, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie dann die Augäpfel 5 Minuten lang in 10 ml R16-Medium.
4. Die Proteinase-K-Lösung in einem 37 °C heißen Inkubator vorwärmen. Tauchen Sie dann die Augäpfel in 10 ml Proteinase-K-Lösung und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang. Tauchen Sie die Augäpfel in 10 ml R16 + fötales Kälberserum (1:1) Lösung, inkubieren Sie sie 5 Minuten lang und übertragen Sie dann die Augäpfel für eine letzte Wäsche in 10 ml frisches R16.
5. Trennen Sie die Lederhaut, die Hornhaut, die Iris, die Linse und den Glaskörper ab und schneiden Sie die Netzhaut von 4 Seiten mit einer Pinzette und einer Schere ab (Abbildung 1A-L).
6. Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen in fünf Abschnitte - eine 4-mm-Trepanklinge für die nasale/temporale/obere/untere Seite und eine 6-mm-Trepanklinge für die zentrale Seite (enthält Papille und Makula; Abbildung 1M-O). Schnitt in folgendem Abstand vom Sehnervenkopf: 1,5 mm für die Nasalseite, 4 mm für die Schläfenseite und 2 mm für die obere und untere Seite.
7. Übertragen Sie die Netzhautexplantaten (die Netzhaut und Aderhaut enthalten) mit einem Augenlidspatel und legen Sie sie mit der Photorezeptorseite nach oben in die Mitte des Einsatzes (Abbildung 1P). Geben Sie ca. 1 ml des vollständigen Mediums (R16 ergänzt mit BSA, Transferrin, Progesteron, Insulin, T3, Corticosteron, Vitamin B1, Vitamin B12, Retinol, Retinylacetat, DL-Tocopherol, Tocopherylacetat, Linolsäure, L-Cystein HCl, Glutathion, Glutamin, Vitamin C) unter die Membran auf der Platte, um die Netzhaut vollständig zu bedecken.

2. Retinale Explantatkultur von Primaten

1. Kultivieren Sie Netzhautexplanta in vollständigem Medium und stellen Sie sie in einen 37 °C heißen Inkubator, der mit befeuchteten 5 % CO₂ belüftet ist.
2. Wenden Sie die medikamentöse Behandlung in geeigneter Konzentration auf das Netzhautkulturmedium an (z. B. Zapinast in Konzentrationen von 100 μM, 200 μM oder 400 μM). Verwenden Sie mindestens drei Explantaten pro Behandlungsbedingung und verwenden Sie Explantate ohne Medikament als Kontrolle. Behandeln Sie mit dem Medikament für 4 Tage.

3. Fixierung und Kryo-Sektion

1. Netzhautexplanta werden 45 min lang mit 1 ml Paraformaldehyd (PFA) inkubiert, kurz mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann 10 min lang mit 10 % Saccharose, 20 min mit 20 % Saccharose und 30 min mit 30 % Saccharose inkubiert (1 ml für jedes Netzhautexplantat).
2. Schneiden Sie Netzhautexplantaten mit Trepanklingen, um die Konsistenz der Größe der Explantate zu gewährleisten, die an verschiedenen Stellen mit den folgenden Merkmalen gewonnen werden: vier Quadranten in der Peripherie, 6 mm in der Mitte. Anschließend werden die Netzhautexplantaten in eine Blechdose (ca. 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) mit O.C.T.-Einbettmedium überführt, um das Gewebe zu bedecken. Die Gewebeschnitte sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren und zur Lagerung in einen -20 °C warmen Kühlschrank stellen.
3. Schneiden Sie den Agar mit einer scharfen Klinge in einen kleinen Block mit der Gewebeprobe, schneiden Sie die Probenblöcke in 10-μm-Abschnitte und legen Sie sie mit einem weichen Pinsel auf Objektträger des Haftmikroskops. Anschließend 45 min bei 40 °C trocknen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.

4. Immunhistochemie (Abbildung 2)

1. cGMP-Färbung
   1. Trocknen Sie die Objektträger und zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker-Stift einen hydrophoben Ring um die Netzhautabschnitte, um die Proben zu bedecken.
   2. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 200 μl 0,3 % Phosphatpuffer-Kochsalzlösung und Triton X-100 pro Objektträger (PBST) und dann 1 h lang bei Raumtemperatur in Blockierlösung (5 % normales Eselsserum, 0,3 % PBST, 1 % BSA, 200 μl pro Objektträger).
   3. Inkubieren Sie die Proben über Nacht mit dem Primärantikörper (1:250, Schaf-Anti-cGMP, 200 μL pro Objektträger), der in der Blockierungslösung bei 4 °C vorbereitet wurde, und spülen Sie sie dann 3x 10 min (200 μl pro Objektträger) mit PBS ab.
   4. Inkubieren Sie die Proben mit einem Sekundärantikörper (1:300, Donkey anti sheep Alxea Fluor 488, 200 μL pro Objektträger) für 1 h bei Raumtemperatur und spülen Sie sie dann 3x 10 min lang mit PBS ab. Decken Sie die Proben mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium ab, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lagern Sie sie vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
2. TUNEL-Färbung
   1. Trocknen Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und ziehen Sie mit dem Liquid Blocker Pen einen wasserabweisenden Barrierering um Netzhautgewebeproben und inkubieren Sie sie dann 15 Minuten lang in 40 ml PBS.
   2. Inkubation der Objektträger in 42 ml (pro fünf Objektträger) TBS (0,05 M Tris-Puffer) bei 37 °C. Aspirieren Sie das TBS und inkubieren Sie die Proben mit 6 μl Proteinase K für 5 Minuten. Waschen Sie dann die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
   3. Setzen Sie die Objektträger 40 ml Ethanol-Essigsäure-Lösung im Collin aus, decken Sie sie mit einer transparenten Folie ab und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei -20 °C. Waschen Sie die Objektträger 3x mit TBS für jeweils 5 Minuten.
   4. Setzen Sie die Objektträger einer Blockierlösung (1 % BSA; 200-300 μl pro Objektträger, je nach Bedarf) aus und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer.
   5. Bereiten Sie die TUNEL-Kit-Lösung, TMR rot, im folgenden Verhältnis vor: 62,50 μl Blockierlösung (1 % BSA), 56,25 μl Markierungslösung (TMR-dUTP) und 6,25 μl des Enzyms (Anteil für jeden Objektträger). Geben Sie ca. 130 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C. Waschen Sie dann die Objektträger 5 Minuten lang (200 μl pro Objektträger) 2x mit PBS.
   6. Legen Sie Abdeckobjektträger mit 1-2 Tropfen Antifade-Einbettmedium mit DAPI über die Proben und inkubieren Sie die Objektträger vor der Bildgebung mindestens 30 Minuten lang bei 4 °C.
3. cGMP-Färbung kombiniert mit TUNEL-Färbung
   1. Auf die cGMP-Färbung folgte die TUNEL-Färbung. Befolgen Sie die Schritte der TUNEL-Färbung von Schritt 4.2.1 bis Schritt 4.2.5 und fahren Sie dann mit den Schritten der cGMP-Färbung von Schritt 4.1.2 bis Schritt 4.1.4 fort.
4. Führen Sie die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie mit den folgenden Kameraparametern durch: Belichtungszeit = 125 ms, ROI-Größe = 2752 x 2208, Farbe = S/M. Nehmen Sie Bilder mit der Software auf. Nehmen Sie mit einer Digitalkamera vier verschiedene Felder mit 20-facher Vergrößerung aus jedem Schnitt auf und erhalten Sie repräsentative Bilder aus den zentralen Bereichen der Netzhaut mit DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), wobei Z-Stack-Scans ein Intervall = 1 μm und optional = 1,251 μm haben.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Netzhautexplantatkultur von Makakenaffen mit Explantaten durchgeführt, die den Retina-RPE-Aderhautkomplex enthielten (Abbildung 1, ergänzende Abbildung S1). Im Vergleich zur In-vitro-Kultur von Netzhautzellen unter Verwendung der Netzhaut ohne das angehängte RPE und die Aderhaut ermöglicht unsere Explantatkultur ein besseres Überleben der Zellen und verlängert dementsprechend das Überleben der Photorezeptorzellen.

Diskussion

Visuelle Phototransduktion bezieht sich auf den biologischen Prozess, bei dem Lichtsignale von Photorezeptorzellen in der Netzhaut des Auges in elektrische Signale umgewandelt werden. Photorezeptorzellen sind polarisierte Neuronen, die zur Phototransduktion fähig sind, und es gibt zwei verschiedene Arten von Photorezeptoren, die nach der Form ihrer äußeren Segmente als Stäbchen und Zapfen bezeichnet werden. Stäbchen sind für das skotopische Sehen verantwortlich und Zapfen sind für das photopische und hochscharfe S...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),