マカクザルの有機型網膜外植片培養

要約

野生型マカクから得られた網膜外植体を インビトロで培養した。網膜変性およびcGMP−PKGシグナル伝達経路は、PDE6阻害剤ザプリナストを用いて誘導した。異なるザプリナスト濃度の外植体におけるcGMP蓄積は、免疫蛍光法を用いて検証された。

要約

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とする。光受容体細胞における環状グアノシン一リン酸(cGMP)依存性プロテインキナーゼ(PKG)経路の過剰活性化は、特にホスホジエステラーゼ6b(PDE6b)変異を有するモデルにおいて、光受容体細胞死を引き起こす。RDに関する以前の研究では、主に rd1 または rd10 マウスなどのマウスモデルが使用されてきました。マウスとヒトの遺伝的および生理学的な違いを考えると、霊長類とげっ歯類の網膜がどの程度同等であるかを理解することが重要です。マカクザルは人間と高いレベルの遺伝的類似性を共有しています。したがって、野生型マカク(1〜3歳)を、網膜-網膜色素上皮(RPE)-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養に選択しました。これらの外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナストで処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導し、RD病因をシミュレートしました。その後、霊長類網膜外植片におけるcGMP蓄積および細胞死を、免疫蛍光法およびTUNELアッセイを用いて検証した。本研究で確立された霊長類網膜モデルは、cGMP-PKG依存性RDのメカニズムに関する関連性のある効果的な研究、および将来の治療アプローチの開発に役立つ可能性があります。

概要

遺伝性網膜変性症(RD)は、進行性の視細胞死を特徴とし、多種多様な病原性遺伝子の変異によって引き起こされます¹。RDの最終結果は視力喪失であり、ほとんどの場合、この病気は今日まで治療できないままです。したがって、光受容体死に至る細胞機構を、ヒトの病態を忠実に表現したモデルを用いて研究することが重要です。ここでは、霊長類ベースのモデルは、人間に近いため、特に興味深いものです。特に、このようなモデルは、視細胞死を停止または遅延させることができる適切な治療的介入の開発を進める可能性がある。

RDの細胞死メカニズムに関するこれまでの研究では、RDを誘発する遺伝子変異によって引き起こされるホスホジエステラーゼ6(PDE6)活性の低下または喪失が、環状グアノシン一リン酸(cGMP)の加水分解の減少につながることが示されています^2,3。cGMPは、桿体外側セグメント(ROS)の環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル(CNGC)の特異的アゴニストであり、脊椎動物の視細胞における光信号の電気信号への変換に関与する重要な分子でもあります⁴。cGMP加水分解の減少は、ROS中のcGMPの蓄積を引き起こし、CNGC^の開放をもたらす5。その結果、光伝達経路が活性化され、その結果、光受容体細胞における陽イオン濃度が増加する。このプロセスは光受容体に代謝負荷を課し、例えばPDE6の突然変異によって過剰に活性化されると、細胞死を引き起こす可能性があります。

多くの研究により、RD遺伝子変異の異なるマウスモデルの光受容体におけるcGMPの有意な過剰蓄積が、cGMP依存性プロテインキナーゼ(PKG)の活性化を引き起こす可能性があることが示されています^3,6。これは、死にかけているTUNEL陽性細胞の大幅な増加および視細胞層の漸進的な薄化をもたらす。以前の研究では、cGMPレベルの上昇によって引き起こされるPKGの過剰活性化が、視細胞死の誘導に必要かつ十分な条件であることが示唆されています^2,5。RDのさまざまなマウスモデルに関する研究では、光受容体のcGMPレベルの上昇によって誘導されるPKG活性化が、ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ1(PARP1)、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、およびカルパイン2,7,8,9などの下流エフェクターの過剰活性化につながることも示されています。これは、これらの異なる標的タンパク質と視細胞死との因果関係を示唆しています。

しかし、RDの病理学、毒物薬理学、および治療に関する以前の研究は、主にRD 10^、11、12のマウスモデルに基づいていました。それにもかかわらず、これらの結果の臨床翻訳には計り知れない困難が残っています。これは、特に網膜構造に関して、マウスとヒトの間にかなりの遺伝的および生理学的違いがあるためです。対照的に、非ヒト霊長類(NHP)は、遺伝的特徴、生理学的パターン、および環境要因調節に関してもヒトと高度な類似性を共有しています。例えば、NHPモデル¹³における網膜活性を回復させる手段として、光遺伝学的治療が検討された。今回、Lingamたちの研究グループは、優れた製造基準級のヒト誘導多能性幹細胞由来網膜視細胞前駆細胞が、NHP¹⁴の錐体光受容体損傷を救済できることを実証した。したがって、NHPモデルは、RDの病因の探索と効果的な治療法の開発に重要です。特に、ヒトと同様の病原性メカニズムを示すRDのNHPモデルは、新薬の開発やin vivo毒性薬理学的解析の研究に重要な役割を果たす可能性があります。

in vivo 霊長類モデルの確立には、ライフサイクルの長期化、技術的困難度の高さ、コストの高さを考慮すると、外植したマカク網膜の培養を用いた in vitro 非ヒト霊長類(NHP)モデルを確立しました。まず、1〜3歳の野生型マカクを、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む網膜外植片の in vitro 培養用に選択した。次に、外植片を異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM)で処理して、cGMP-PKGシグナル伝達経路を誘導しました。TUNELアッセイを用いて視細胞死を定量・解析し、外植体におけるcGMP蓄積を免疫蛍光法 で 検証した。サルとヒトの網膜の細胞分布や形態、網膜層厚などの生理的特徴の類似性が高いことから、 in vitro 網膜モデルにおけるcGMP-PKGシグナル伝達経路の確立は、RDの病態解明やRD治療薬の開発・毒性薬理学の研究の進展につながることが期待されます。

プロトコル

動物実験は、中国科学院動物学研究所の倫理審査委員会(IACUC-PE-2022-06-002)、および雲南大学の動物倫理審査および動物プロトコル(YNU20220149)によってレビューおよび承認されました。

1.網膜外植片の調製

1. 1〜3歳の野生型マカクから霊長類の眼球を入手し、組織保存液に保存し、サルを屠殺した後または自然死後、除核から3時間以内に氷上で輸送します。
2. プロテイナーゼK溶液の調製には、25 mgのプロテイナーゼKを250 μLの蒸留水に溶解し、次に225 μLの溶液を18.5 mLの基礎培地(R16)に加えます。
3. 眼球を10 mLの5%ポビドンヨード(ポビドンヨード:水= 1:19)で30秒間洗浄し、細菌汚染を避けるために5%ペニシリン/ストレプトマイシン(PEN/STREP):pホスフェート緩衝生理食塩水= 1:19に1分間浸します。.次に、眼球を10 mLのR16培地で5分間インキュベートします。
4. プロテイナーゼK溶液を37°Cのインキュベーター内で予熱する。次に、眼球を10 mLのプロテイナーゼK溶液に浸し、2分間インキュベートします。眼球を10 mLのR16 +ウシ胎児血清(1:1)溶液に浸し、5分間インキュベートしてから、眼球を10 mLの新鮮なR16に移して最終洗浄します。
5. 強膜、角膜、虹彩、水晶体、硝子体を分離し、ピンセットとハサミで網膜を4つの側面から切断します(図1A-L)。
6. トレフィンブレードを備えた網膜外植片を、鼻/側頭/上/下側の4 mmトレフィンブレードと中央側(視神経乳頭と黄斑を含む)の6 mmトレフィンブレードの5つのセクションに切断します。図1M-O)。視神経乳頭から次の距離で切断します:鼻の場合は1.5 mm、側頭の場合は4 mm、上側と下側の両方で2 mm。
7. 網膜外植片(網膜と脈絡膜を含む)を眼瞼圧子で移し、視細胞側を上にしてインサートの中央に置きます(図1P)。約1mLの完全培地(BSA、トランスフェリン、プロゲステロン、インスリン、T3、コルチコステロン、ビタミンB1、ビタミンB12、レチノール、酢酸レチノール、DL-トコフェロール、酢酸トコフェロール、リノール酸、L-システインHCl、グルタチオン、グルタミン、ビタミンCを添加したR16)をプレートのメンブレンの下に置いて、網膜を完全に覆います。

2.霊長類網膜外植片培養

1. 網膜外植片を完全培地で培養し、加湿した5%_CO2で通気した37°Cのインキュベーターに入れる。
2. 網膜培養培地に適切な濃度の薬物処理を適用します(例:.、100 μM、200 μM、または400 μMの濃度のザプリナスト)。処理条件ごとに少なくとも3つの外植片を使用し、対照として薬剤を含まない外植片を使用します。4日間薬で治療します。

3. 固定とクライオセクショニング

1. 網膜外植片を1 mLのパラホルムアルデヒド(PFA)で45分間インキュベートし、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で簡単にすすぎ、次に10%スクロースで10分間、20%スクロースで20分間、30%スクロースで30分間インキュベートします(網膜外植片ごとに1 mL)。
2. トレフィンブレードを使用して網膜外植片を切断し、次の特性を持つ異なる部位から得られた外植片のサイズの一貫性を確保します:周辺に4つの象限、中央に6 mm。次に、網膜外植片をブリキ箱(約1.5 cm x 1.5 cm x 1.5 cm)に移し、O.C.T.包埋培地を使用して組織を覆います。直ちに、組織切片を液体窒素で凍結し、-20°Cの冷蔵庫に入れて保管します。
3. 鋭利な刃を使用して、寒天を組織サンプルを含む小さなブロックにトリミングし、サンプルブロックを10 μmの切片に切断し、柔らかいブラシを使用して接着顕微鏡スライドに置きます。その後、40°Cで45分間乾燥し、使用するまで-20°Cで保存する。

4. 免疫組織化学(図2)

1. cGMP染色
   1. スライドを乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜切片の周りに疎水性リングを描き、サンプルを覆います。
   2. スライドを200 μLの0.3%リン酸緩衝生理食塩水とTriton X-100 per slide(PBST)に室温で10分間浸した後、ブロッキング溶液(5%正常ロバ血清、0.3%PBST、1%BSA、スライドあたり200 μL)に室温で1時間浸します。
   3. ブロッキング溶液中で調製した一次抗体(1:250、ヒツジ抗cGMP、スライドあたり200 μL)でサンプルを4°Cで一晩インキュベートした後、PBSで10分間(スライドあたり200 μL)3回リンスします。
   4. サンプルを二次抗体(1:300、ロバ抗羊Alxea Fluor 488、スライドあたり200 μL)で室温で1時間インキュベートした後、PBSで10分間、3回すすぎます。サンプルを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止封入剤で覆い、イメージング前に4°Cで少なくとも30分間保存します。
2. チューネル染色
   1. スライドを室温で15分間乾燥させ、液体ブロッカーペンで網膜組織標本の周りに撥水性バリアリングを描き、40 mLのPBSで15分間インキュベートします。
   2. 42 mL (5 枚のスライドあたり) の TBS (0.05 M トリスバッファー) 中でスライドを 37 °C でインキュベートします。 TBSを吸引し、サンプルを6 μLのプロテイナーゼKとともに5分間インキュベートします。次に、スライドをTBSで3回毎回5分間洗浄します。
   3. スライドをチョップリン中の40 mLのエタノール-酢酸溶液にさらし、透明なシートで覆い、-20°Cで5分間インキュベートします。スライドをTBSで3回毎回5分間洗浄します。
   4. スライドをブロッキング溶液(1%BSA、必要に応じてスライドあたり200〜300 μL)にさらし、湿度チャンバーで1時間インキュベートします。
   5. TUNELキット溶液TMR redを、62.50 μLのブロッキング溶液(1%BSA)、56.25 μLの標識溶液(TMR-dUTP)、および6.25 μLの酵素(各スライドの割合)の割合で調製します。スライドごとに約130 μLのこの溶液を加え、37°Cで1時間インキュベートします。次に、スライドをPBSで5分間(スライドあたり200μL)、2回洗浄します。
   6. 1〜2滴の退色防止封入剤を含むカバースライドをDAPIとともにサンプルの上に置き、イメージングの前にスライドを4°Cで少なくとも30分間インキュベートします。
3. cGMP染色とTUNEL染色の併用
   1. cGMP染色に続いてTUNEL染色を行った。ステップ4.2.1からステップ4.2.5までのTUNEL染色のステップに従い、ステップ4.1.2からステップ4.1.4までのcGMP染色の手順を続行します。
4. カメラパラメータを使用して、露光時間= 125ミリ秒、ROIサイズ= 2752 x 2208、カラー= B / Mのように光学顕微鏡および蛍光顕微鏡を実行します。 ソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。デジタルカメラで各切片から20倍の倍率で4つの異なるフィールドを撮影し、DAPI(465 nm)、EGFP(509 nm)、TMP(578 nm)を使用して網膜の中央領域から代表的な画像を取得し、間隔= 1 μm、オプションのZ-Stackスキャン= 1.251 μmを使用します。

結果

本研究では、網膜-RPE-脈絡膜複合体を含む外植片を用いてマカクザル網膜外植片培養を行った(図1、 補足図S1)。RPEや脈絡膜を付着させない網膜を用いた網膜細胞の in vitro 培養と比較して、当社の外植片培養は細胞の生存率を高め、視細胞の寿命を延ばします。

異なる濃度のPDE6阻害剤ザプリナスト(100 μM、200 μM、および400 μM;

ディスカッション

視覚光伝達とは、光信号が眼の網膜内の光受容体細胞によって電気信号に変換される生物学的プロセスを指します。視細胞は光伝達が可能な偏光ニューロンであり、光受容体には、その外側のセグメントの形状にちなんで桿体と錐体と呼ばれる2つの異なるタイプがあります。桿体は暗所視に責任があり、錐体は明所視と高視力に責任があります。遺伝性RDは、進行性の網膜視細胞死を特徴と?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),