Cultures organotypiques d’explants rétiniens de singe macaque

Résumé

Des explants rétiniens obtenus à partir de macaques de type sauvage ont été cultivés in vitro. La dégénérescence rétinienne et la voie de signalisation cGMP-PKG ont été induites à l’aide de l’inhibiteur de la PDE6 zaprinast. L’accumulation de GMPc dans les explants à différentes concentrations de zaprinast a été vérifiée par immunofluorescence.

Résumé

La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices. La suractivation de la voie cyclique de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate (GMPc) dans les cellules photoréceptrices provoque la mort des cellules photoréceptrices, en particulier chez les modèles porteurs de mutations de la phosphodiestérase 6b (PDE6b). Des études antérieures sur la DR ont utilisé principalement des modèles murins tels que les souris rd1 ou rd10. Compte tenu des différences génétiques et physiologiques entre les souris et les humains, il est important de comprendre dans quelle mesure les rétines des primates et des rongeurs sont comparables. Les macaques partagent un haut niveau de similitude génétique avec les humains. Par conséquent, des macaques de type sauvage (âgés de 1 à 3 ans) ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens comprenant le complexe épithélium pigmentaire rétinien-rétinien-choroïde. Ces explants ont été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6, pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG et simuler la pathogenèse de la RD. L’accumulation de GMPc et la mort cellulaire dans les explants rétiniens de primates ont ensuite été vérifiées à l’aide de l’immunofluorescence et du test TUNEL. Le modèle rétinien des primates établi dans cette étude peut servir à des études pertinentes et efficaces sur les mécanismes de la DR dépendante des GMPc-PKG, ainsi qu’au développement d’approches thérapeutiques futures.

Introduction

La dégénérescence rétinienne héréditaire (DR) est caractérisée par la mort progressive des cellules photoréceptrices et est causée par des mutations dans une grande variété de gènes pathogènes¹. Le résultat final de la RD est la perte de vision et dans la grande majorité des cas, la maladie reste incurable à ce jour. Par conséquent, il est important d’étudier les mécanismes cellulaires conduisant à la mort des photorécepteurs en utilisant des modèles qui représentent fidèlement l’état pathologique humain. Ici, les modèles à base de primates sont particulièrement intéressants en raison de leur proximité avec les humains. Notamment, de tels modèles peuvent faire progresser le développement d’interventions thérapeutiques appropriées qui peuvent arrêter ou retarder la mort des cellules photoréceptrices.

Des recherches antérieures sur les mécanismes de la mort cellulaire dans la RD ont démontré que la diminution ou la perte de l’activité de la phosphodiestérase 6 (PDE6) causée par des mutations génétiques déclenchant la RD entraîne une hydrolyse réduite de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc)^2,3. cGMP est un agoniste spécifique des canaux ioniques cycliques dépendants des nucléotides (CNGC) dans les segments externes des bâtonnets (ROS) et est également une molécule clé responsable de la conversion des signaux lumineux en signaux électriques dans les cellules photoréceptrices des vertébrés⁴. L’hydrolyse réduite des GMPc provoque l’accumulation de GMPc dans les ROM, conduisant à l’ouverture des ^{CGNCc 5}. Par conséquent, les voies de phototransduction sont activées, ce qui entraîne une augmentation des concentrations de cations dans les cellules photoréceptrices. Ce processus impose une charge métabolique aux photorécepteurs qui, lorsqu’ils sont suractivés, par exemple par des mutations de la PDE6, peuvent provoquer la mort cellulaire.

De nombreuses études ont montré qu’une suraccumulation significative de GMPc dans les photorécepteurs de modèles murins présentant différentes mutations du gène RD peut provoquer l’activation de la protéine kinase dépendante du GMPc (PKG)^3,6. Cela conduit à une augmentation substantielle des cellules TUNEL-positives mourantes et à un amincissement progressif de la couche de cellules photoréceptrices. Des études antérieures suggèrent que la suractivation de la PKG causée par des taux élevés de BPFc est une condition nécessaire et suffisante pour l’induction de la mort cellulaire photoréceptrice ^2,5. Des études sur différents modèles murins de DR ont également montré que l’activation de la PKG induite par des niveaux élevés de GMPc dans les photorécepteurs entraîne une suractivation des effecteurs en aval tels que la poly-ADP-ribose polymérase 1 (PARP1), l’histone désacétylase (HDAC) et la^calpaïne 2,7,8,9. Cela implique des associations causales entre ces différentes protéines cibles et la mort cellulaire photoréceptrice.

Cependant, les recherches antérieures sur la pathologie, la toxicopharmacologie et la thérapie de la DR étaient principalement basées sur des modèles murins pour DR^10,11,12. Néanmoins, d’immenses difficultés subsistent dans la traduction clinique de ces résultats. Cela est dû aux différences génétiques et physiologiques considérables entre les souris et les humains, en particulier en ce qui concerne la structure rétinienne. En revanche, les primates non humains (PNH) partagent également un degré élevé de similitude avec les humains en ce qui concerne les caractéristiques génétiques, les schémas physiologiques et la régulation des facteurs environnementaux. Par exemple, la thérapie optogénétique a été étudiée comme moyen de restaurer l’activité rétinienne dans un modèle de PSN¹³. Lingam et ses collègues ont démontré que les cellules précurseurs photorétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et de qualité professionnelle peuvent sauver les dommages causés par les photorécepteurs coniques dans le NHP¹⁴. Par conséquent, les modèles de PSN sont importants pour l’exploration de la pathogenèse DR et la mise au point de méthodes de traitement efficaces. En particulier, les modèles de DR des PSN, présentant des mécanismes pathogènes semblables à ceux des humains, pourraient jouer un rôle essentiel dans les études sur le développement et l’analyse toxicopharmacologique in vivo de nouveaux médicaments.

Compte tenu du long cycle de vie, du niveau élevé de difficultés techniques et du coût élevé de l’établissement de modèles de primates in vivo, nous avons établi un modèle in vitro de primates non humains (PNH) en utilisant des cultures de rétine de macaque explanté. Tout d’abord, des macaques de type sauvage âgés de 1 à 3 ans ont été sélectionnés pour la culture in vitro d’explants rétiniens, qui comprenaient le complexe rétine-RPE-choroïde. Les explants ont ensuite été traités avec différentes concentrations de zaprinaste, inhibiteur de la PDE6 (100 μM, 200 μM et 400 μM) pour induire la voie de signalisation cGMP-PKG. La mort cellulaire des photorécepteurs a été quantifiée et analysée à l’aide du test TUNEL, et l’accumulation de BPF dans les explants a été vérifiée par immunofluorescence. Compte tenu du degré élevé de similitude en ce qui concerne la distribution cellulaire et la morphologie, l’épaisseur de la couche rétinienne et d’autres caractéristiques physiologiques de la rétine entre les singes et les humains, l’établissement de la voie de signalisation cGMP-PKG dans le modèle rétinien in vitro pourrait faciliter les recherches futures sur la pathogenèse de la DR ainsi que les études sur le développement et la toxicopharmacologie de nouveaux médicaments pour le traitement de la DR.

Protocole

L’étude sur les animaux a été examinée et approuvée par le Comité d’examen éthique de l’Institut de zoologie de l’Académie chinoise des sciences (IACUC-PE-2022-06-002), ainsi que par l’examen de l’éthique animale et le protocole animal de l’Université du Yunnan (YNU20220149).

1. Préparation des explants rétiniens

1. Obtenir des globes oculaires de primates de macaques de type sauvage, âgés de 1 à 3 ans, stocker dans une solution de stockage de tissus et les transporter sur la glace dans les 3 heures suivant l’énucléation après le sacrifice des singes ou après leur mort naturelle.
2. Pour la préparation de la solution de protéinase K, dissoudre 25 mg de protéinase K dans 250 μL d’eau distillée, puis ajouter 225 μL de la solution à 18,5 mL de milieu basal (R16).
3. Lavez les globes oculaires dans 10 mL de povidone iodée à 5 % (povidone-iode : eau = 1:19) pendant 30 s et trempez-les dans une solution saline tamponnée à 5 % de pénicilline/streptomycine (PEN/STREP):p hosphate-buffered = 1:19 pendant 1 min pour éviter la contamination bactérienne. Ensuite, incuber les globes oculaires dans 10 ml de milieu R16 pendant 5 min.
4. Préchauffer la solution de protéinase K dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, plongez les globes oculaires dans 10 ml de solution de protéinase K et incuber pendant 2 min. Plongez les globes oculaires dans 10 ml de solution de sérum fœtal bovin R16 + fœtal (1:1), incuber pendant 5 minutes, puis transférer les globes oculaires sur 10 ml de R16 frais pour un lavage final.
5. Séparez la sclérotique, la cornée, l’iris, le cristallin et le corps vitreux, et coupez la rétine de 4 côtés avec une pince à épiler et des ciseaux (Figure 1A-L).
6. Couper les explants rétiniens avec lames de tréphine en cinq sections - une lame de tréphine de 4 mm pour la face nasale / temporale / supérieure / inférieure et une lame de tréphine de 6 mm pour la face centrale (contenant un disque optique et de la macula; Figure 1M-O). Couper à la distance suivante de la tête du nerf optique: 1,5 mm pour le nasal, 4 mm pour le temporal et 2 mm pour le côté supérieur et inférieur.
7. Transférer les explants de rétine (contenant la rétine et la choroïde) avec un abaisse-paupière et les placer au milieu de l’insert, côté photorécepteur vers le haut (Figure 1P). Placer environ 1 mL de milieu complet (R16 supplémenté en BSA, transferrine, progestérone, insuline, T3, corticostérone, vitamine B1, vitamine B12, rétinol, acétate de rétinyle, DL-tocophérol, acétate de tocophéryle, acide linoléique, L-cystéine HCl, glutathion, glutamine, vitamine C) sous la membrane de la plaque pour couvrir complètement la rétine.

2. Culture d’explant rétinien de primates

1. Culture d’explants rétiniens en milieu complet et placer dans un incubateur à 37 °C aéré avec 5% de CO₂ humidifié.
2. Appliquer un traitement médicamenteux à la concentration appropriée sur le milieu de culture rétinienne (p. ex. zaprinast à des concentrations de 100 μM, 200 μM ou 400 μM). Utiliser au moins trois explants par condition de traitement et utiliser des explants sans médicament comme témoin. Traiter avec un médicament pendant 4 jours.

3. Fixation et cryo-sectionnement

1. Incuber les explants rétiniens avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) pendant 45 min, les rincer brièvement avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incuber avec 10 % de saccharose pendant 10 min, 20 % de saccharose pendant 20 min et 30 % de saccharose pendant 30 min (1 mL pour chaque explant de rétine).
2. Couper les explants rétiniens à l’aide de lames de tréphine pour assurer la cohérence de la taille des explants obtenus à partir de différents sites présentant les caractéristiques suivantes: quatre quadrants en périphérie, 6 mm au centre. Ensuite, transférer les explants rétiniens dans une boîte en fer blanc (environ 1,5 cm x 1,5 cm x 1,5 cm) avec un milieu d’enrobage O.C.T. pour couvrir le tissu. Immédiatement, congeler les sections de tissu dans de l’azote liquide et les placer dans un réfrigérateur à -20 °C pour les conserver.
3. Utilisez une lame tranchante pour couper la gélose en un petit bloc contenant l’échantillon de tissu, coupez les blocs d’échantillon en sections de 10 μm et placez-les sur des lames de microscope à adhésion à l’aide d’une brosse douce. Ensuite, sécher pendant 45 min à 40 °C et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.

4. Immunohistochimie (figure 2)

1. Coloration cGMP
   1. Sécher les lames et dessiner un anneau hydrophobe autour des sections rétiniennes avec un stylo bloqueur de liquide pour couvrir les échantillons.
   2. Plonger les lames dans 200 μL de solution saline tampon phosphate à 0,3 % et Triton X-100 par lame (PBST) pendant 10 min à température ambiante, puis dans une solution de blocage (5 % de sérum normal d’âne, 0,3 % de PBST, 1 % de BSA, 200 μL par lame) pendant 1 h à température ambiante.
   3. Incuber les échantillons pendant une nuit avec l’anticorps primaire (1:250, anti-GMPc de mouton, 200 μL par lame) préparé dans la solution de blocage à 4 °C, puis rincer avec du PBS pendant 10 min (200 μL par lame) 3x.
   4. Incuber les échantillons avec l’anticorps secondaire (1:300, âne anti mouton Alxea Fluor 488, 200 μL par lame) pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec du PBS pendant 10 min, 3x. Couvrir les échantillons d’un support de montage antidécoloration contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et conserver à 4 °C pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie.
2. Coloration TUNEL
   1. Sécher les lames à température ambiante pendant 15 minutes et dessiner un anneau barrière hydrofuge autour des échantillons de tissu rétinien avec le stylo bloqueur de liquide, puis les incuber dans 40 ml de PBS pendant 15 minutes.
   2. Incuber les lames dans 42 mL (par cinq lames) de TBS (0,05 M Tris-buffer) à 37 °C. Aspirer le TBS et incuber les échantillons avec 6 μL de protéinase K pendant 5 min. Ensuite, lavez les lames 3x avec TBS pendant 5 minutes à chaque fois.
   3. Exposer les lames à 40 mL de solution d’éthanol-acide acétique dans la chopline, couvrir d’une feuille transparente et incuber à -20 °C pendant 5 min. Lavez les lames 3x avec TBS pendant 5 min à chaque fois.
   4. Exposer les lames à une solution de blocage (1% BSA; 200-300 μL par lame selon les besoins) et incuber dans une chambre d’humidité pendant 1 h.
   5. Préparer la solution de la trousse TUNEL, TMR rouge, dans la proportion suivante : 62,50 μL de solution de blocage (1 % BSA), 56,25 μL de solution de marquage (TMR-dUTP) et 6,25 μL de l’enzyme (proportion pour chaque lame). Ajouter environ 130 μL de cette solution par lame et incuber à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, lavez les lames avec du PBS pendant 5 min (200 μL par lame), 2x.
   6. Placer des lames de couvercle contenant 1 à 2 gouttes de support de montage antidécoloration avec DAPI sur les échantillons, puis incuber les lames à 4 °C pendant au moins 30 minutes avant l’imagerie.
3. coloration cGMP combinée à la coloration TUNEL
   1. La coloration cGMP a été suivie d’une coloration TUNEL. Suivez les étapes de coloration TUNEL de l’étape 4.2.1 à l’étape 4.2.5, puis continuez les étapes de coloration cGMP de l’étape 4.1.2 à l’étape 4.1.4.
4. Effectuez la microscopie de lumière et de fluorescence avec les paramètres de la caméra comme suit: temps d’exposition = 125 ms, taille du retour sur investissement = 2752 x 2208, couleur = noir et blanc. Capturez des images à l’aide du logiciel. Imaginez quatre champs différents avec un appareil photo numérique à un grossissement de 20x de chaque section et obtenez des images représentatives des zones centrales de la rétine en utilisant DAPI (465 nm), EGFP (509 nm), TMP (578 nm), avec balayage Z-Stack ayant un intervalle = 1 μm et facultatif = 1,251 μm.

Résultats

Dans cette étude, une culture d’explant rétinienne de singe macaque a été réalisée à l’aide d’explants contenant le complexe rétine-EPR-choroïde (Figure 1, Figure supplémentaire S1). Par rapport à la culture in vitro de cellules rétiniennes utilisant la rétine sans l’EPR et la choroïde attachés, notre culture d’explantation facilite une meilleure survie cellulaire et, par conséquent, prolonge la survie des cellules photoréceptrices.

Discussion

La phototransduction visuelle fait référence au processus biologique par lequel les signaux lumineux sont convertis en signaux électriques par les cellules photoréceptrices dans la rétine de l’œil. Les cellules photoréceptrices sont des neurones polarisés capables de phototransduction, et il existe deux types différents de photorécepteurs appelés bâtonnets et cônes d’après les formes de leurs segments externes. Les bâtonnets sont responsables de la vision scotopique et les cônes sont responsables de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B2064	Blocking solution
Corticosterone	Sigma	C2505	Supplements of Complete Medium
DL-tocopherol	Sigma	T1539	Supplements of Complete Medium
Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488	Life technologies corporation	A11015	Secondary antibody of cGMP
Ethanol-acetic acid solution	Shyuanye	R20492	Fixing liquid
Fetal Bovine Serum	Gemini	900-108	Blocking solution
Fluorescence microscope	Carl Zeiss	Axio Imager.M2	Immunofluorescence imaging
Glutamine	Sigma	G8540	Supplements of Complete Medium
Glutathione	Sigma	G6013	Supplements of Complete Medium
In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Insulin	Sigma	16634	Supplements of Complete Medium
L-cysteine HCl	Sigma	C7477	Supplements of Complete Medium
Linoleic acid	Sigma	L1012	Supplements of Complete Medium
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi	130-100-008	Optimized storage of fresh organ and tissue samples
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking solution
Paraformaldehyde(PFA)	Biosharp	BL539A	Fixing agent
PEN. / STREP. 100×	Millipore	TMS-AB2-C	Penicillin / Streptomycin antibiotics
Phosphate buffer saline(PBS)	Solarbio	P1010	Buffer solution
Povidone-iodine	Shanghailikang	310411	Disinfector agent
Progesterone	Sigma	P8783	Supplements of Complete Medium
Proteinase K	Millpore	539480	Break down protein
R16 medium	Life technologies corporation	074-90743A	Basic medium
Retinol	Sigma	R7632	Supplements of Complete Medium
Retinyl acetate	Sigma	R7882	Supplements of Complete Medium
Sheep anti-cGMP	Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands		Primary antibody of cGMP
Sucrose	GHTECH	57-50-1	Dehydrating agent
T3	Sigma	T6397	Supplements of Complete Medium
Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound)	SAKURA	4583	Embedding medium
Tocopheryl acetate	Sigma	T1157	Supplements of Complete Medium
Transferrin	Sigma	T1283	Supplements of Complete Medium
Transwell	Corning Incorporated	3412	Cell / tissue culture
Tris-buffer (TBS)	Solarbio	T1080	Blocking buffer
Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	Surface active agent
VECTASHIELD Medium with DAPI	Vector	H-1200	Mounting medium
Vitamin B1	Sigma	T1270	Supplements of Complete Medium
Vitamin B12	Sigma	V6629	Supplements of Complete Medium
Vitamin C	Sigma	A4034	Supplements of Complete Medium
Zaprinast	Sigma	Z0878	PDE6 inhibitor
Zeiss Imager M2 Microscope	Zeiss, Oberkochen,Germany		upright microscope
LSM 900 Airyscan			high resolution laser scanning microscope
Zeiss Axiocam	Zeiss, Oberkochen,Germany		digital camera
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
Primate eyeballs from wildtype macaque	KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY	SYXK () K2017 -0008
Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan
TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany),