نقل الميتوكوندريا من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في الفئران إلى بويضات الفئران المسنة

Summary

هنا ، نصف عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من الفئران ، ثم ننقل الميتوكوندريا إلى بويضات الفئران القديمة لتحسين جودة البويضات.

Abstract

بسبب انخفاض كمية ونوعية البويضات المرتبطة بالعمر ، انخفضت خصوبة النساء فوق سن 35 عاما بشكل حاد. لا تزال الآليات الجزيئية التي تحافظ على جودة البويضات غير واضحة ، وبالتالي يصعب زيادة معدل المواليد للنساء فوق سن 35 عاما في الوقت الحالي. تحتوي البويضات على ميتوكوندريا أكثر من أي نوع من الخلايا في الجسم ، ويمكن أن يؤدي أي خلل وظيفي في الميتوكوندريا إلى انخفاض جودة البويضات. في التسعينيات ، أدى نقل سيتوبلازمي البويضات إلى نجاح كبير في التكاثر البشري ولكنه كان مصحوبا بخلافات أخلاقية. من المتوقع أن تكون زراعة الميتوكوندريا الذاتية تقنية مفيدة لزيادة جودة البويضات التي انخفضت بسبب العمر. في الدراسة الحالية ، استخدمنا الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من الفئران المسنة كمتبرع بالميتوكوندريا لزيادة جودة بويضات الفئران المسنة. سيوفر التطوير الإضافي لتكنولوجيا نقل الميتوكوندريا الذاتية علاجا جديدا وفعالا للعقم لدى النساء المسنات.

Introduction

أحد العوامل المهمة التي تؤثر على خصوبة الإناث هو شيخوخة البويضات. انخفاض جودة البويضات هو السبب الرئيسي للعقم عند النساء المسنات. ومع ذلك ، فإن السبب الرئيسي لشيخوخة البويضات والآلية الجزيئية التي تنظم جودة البويضات لا يزالان غير واضحين. أشارت الدراسات السابقة إلى أن كلا من عدد ونوعية الميتوكوندريا يشاركان في مراقبة جودة البويضات والتطور الجنيني^1،2،3. يرتبط الانخفاض في كمية ونوعية الميتوكوندريا ارتباطا وثيقا بالشيخوخة³.

بذلت العديد من المحاولات لتحسين وظيفة الميتوكوندريا في البويضات المسنة ، بما في ذلك المكملات الغذائية للميتوكوندريا ونقل الميتوكوندريا. تشمل المكملات الغذائية المعروفة والفعالة للميتوكوندريا الإنزيم المساعد Q10 (CoQ10) وحمض ألفا ليبويك (α-LA) والريسفيراترول (RSV)⁴. أظهرت الدراسات أن مكملات CoQ10 لا يمكن أن تحسن فقط الانخفاض المرتبط بالعمر في كمية ونوعية البويضات ، ولكن أيضا تعزز التطور الطبيعي والإباضة للبويضات⁵. يبطئ α-LA تدهور جودة البويضات المرتبط بالشيخوخة والنمط الظاهري الأيضي للمرضى الذين يعانون من متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) ^6،7. يمكن أن يقلل الريسفيراترول من عدد البويضات ذات المغازل غير الطبيعية وزيادة محاذاة الكروموسومات غير الصحيحة في الفئران المتقدمة في السن ، مع التأثير على التطور الجنيني بطريقة تعتمد على^{الجرعة 8}. ومع ذلك ، نظرا لأن التأثير السريري للمكملات الغذائية للميتوكوندريا لم يصل إلى المستويات المتوقعة ، يجب استكشاف علاجات فعالة أخرى.

تم تنفيذ المحاولة الأولى لنقل الميتوكوندريا في عام 1997. أدى نقل سيتوبلازم البويضات المانحة الصغيرة إلى البويضات المتلقية المسنة إلى تحسين جودة البويضة للمرضى المسنين ، الذين أنجبوا أطفالا أصحاء بنجاح⁹ ، وهو الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق نقل السيتوبلازم للبويضات الخيفية على الممارسة السريرية لسببين رئيسيين - مشكلة عدم التجانس الجيني والقضايا التنظيمية الناجمة عن زرع الميتوكوندريا من المتبرع. أظهرت دراسة سابقة أن زرع الميتوكوندريا ذاتية الخلايا يمكن أن يحسن جودة البويضات وتطور الأجنة وخصوبة الفئران المسنة¹⁰ ، والتي لم يكن لديها مشاكل أخلاقية أو مشكلات عدم تجانس وراثي وحل بعض المشكلات الناجمة عن نقل سيتوبلازم البويضة المانحة إلى البويضات المتلقية^10،11.

وفي الوقت نفسه ، كان نقل الميتوكوندريا ذاتية المنشأ متفوقا على تأثير المكملات الغذائية السابقة للميتوكوندريا على تحسين جودة البويضات¹¹. لذلك ، فإن زرع الميتوكوندريا ذاتية المنشأ هو الخيار المناسب للتطبيق السريري لهذه التقنية¹². يمكن الحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) عن طريق تقنية طفيفة التوغل ، وهي سهلة العزل والزرع ، ويمكن أن تكون خلية "بذور" مثالية للطب التجديدي. الميتوكوندريا غنية ب ADSCs ، ولا تنخفض وظيفة الميتوكوندريا مع تقدم العمر ، مما يشير إلى أن ADSCs هي مصدر ممتاز للميتوكوندريا^13،14. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة لنقل الميتوكوندريا للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من الفئران إلى بويضات الفئران القديمة لتحسين جودة البويضة. هذا نموذج مفيد لتقنية نقل الميتوكوندريا الذاتية ADSC البشرية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الموصوفة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية في المستشفى الثالث التابع ، جامعة سوشو. تتبع جميع العمليات الوكالة المناسبة لرعاية واستخدامها والإرشادات الوطنية. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في الفئران (ADSCs)

1. التضحية بالفئران المسنة (10 أشهر ، بمتوسط ثلاثة) عن طريق خلع عنق الرحم تحت تخدير البنتوباربيتال الصوديوم وانقعها في كحول 75٪ لمدة 5 دقائق قبل عزل الأنسجة الدهنية.
   ملاحظة: يمكن أن يؤدي النقع في 75٪ من الكحول لمدة 5 دقائق إلى تقليل تلوث الخلايا الأولية بشكل فعال.
2. قم بعمل شق 2 سم في الجلد على الأربي الثنائي ، وكشف الدهون تحت الجلد ، واستخدم الملقط لعزل الدهون تحت الجلد. اجمع الدهون الأربية الثنائية من الفئران باستخدام مقص عين معقم (تجنب قطع الأنسجة تحت الجلد). ضع الأنسجة الدهنية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل على الجليد وانقله على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا.
3. انقل الأنسجة الدهنية إلى طبق مكون من 6 آبار ، واشطفه 3 مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 100 وحدة / مل من البنسلين والستربتومايسين. قم بإزالة الأوعية الدموية واللفافة الدهنية والأنسجة الضامة الموجودة أسفل الأنسجة الدهنية وقطعها إلى قطع ~ 0.5 سم × 0.5 سم × 0.5 سم.
   ملاحظة: عند عزل الخلايا الجذعية الدهنية ، غالبا ما يكون هناك تلوث للخلايا البطانية الوعائية. يمكن أن تقلل إزالة الأوعية الدموية من الأنسجة الدهنية من تلوث الخلايا البطانية الوعائية.
4. انقل الأنسجة الدهنية المقطعة إلى نفس حجم محلول الكولاجيناز من النوع الأول (0.1٪ تركيز نهائي من النوع الأول من الكولاجيناز) وهضمه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. أضف حجما متساويا من وسط الاستزراع الكامل (وسط DMEM F-12 الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني) لتحييد الكولاجيناز من النوع الأول ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من الأنسجة الطافية والدهنية.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط الثقافة الكامل. قم بإزالة الأنسجة غير المهضومة عن طريق الترشيح من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
7. أعد تعليق تعليق الخلية بسعة 5 مل من وسط الاستزراع الكامل واستخدم ماصة سعة 1 مل لتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل لتشكيل تعليق أحادي الخلية. تحقق من تعليق الخلية تحت المجهر عن طريق وضع كمية على مقياس كثافة الدم للتأكد من وجود خلايا مفردة فقط ، بدون أي مجاميع. أضف المعلق أحادي الخلية إلى قارورة مزرعة^خلية مقاس 25 سم وزراعته في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
8. قم بتغيير وسط الثقافة بعد 48 ساعة. استمر في تغيير وسط الثقافة كل 2-3 أيام.
9. بعد 7-10 أيام ، افصل الخلايا لمرور الخلايا عندما يصل التقائها إلى 80٪ -90٪. قم بإزالة وسط الثقافة الكامل واغسل الخلايا ب 2 مل من PBS. ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين / EDTA لإجراء تفكك الخلية^15،16.
10. أضف وسيط تحريض شحمي المنشأ لمدة 14 يوما للحث على تمايز ADSCs إلى adipoctyes. أضف وسط تحريض العظم لمدة 28 يوما إلى ADSCs المطلية بألواح 24 بئرا مطلية بالجيلاتين بنسبة 2٪ للحث على تمايزها إلى بانيات العظم. للتمايز العصبي ، قم بزراعة ADSCs بوسط الحث العصبي ، ثم اكتشف إييولاز خاص بالخلايا العصبية وعديد ببتيد وسيط الخيوط العصبي باستخدام التألق المناعي¹⁵.
    1. قم بتثبيت الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بالنفاذية بنسبة 0.5٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة.
    2. بعد الحظر باستخدام 3٪ BSA في PBS ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الأولية (انظر جدول المواد) المخففة في محلول مانع عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    3. احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة ثم قم بلطخها ب DAPI لمدة 10 دقائق. ثم افحص الخلايا بالمجهر الفلوري.
11. اجمع معلق ADSC أحادي الخلية باستخدام 0.05٪ تريبسين / EDTA ، وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد التعليق في PBS لضبط كثافة الخلية إلى 1 × 10⁶ / مل. قم بتقسيم تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (100 ميكرولتر / أنبوب) وأضف أجسام مضادة أحادية النسيلة CD29 و CD90 و CD34 و HLA-DR المضادة للأرانب المضادة للفأر المسمى FITC ، بتركيز أجسام مضادة يبلغ 0.5 ميكروغرام / مل. عالج المجموعة الضابطة بنفس الحجم من الأرانب IgG FITC ، واحتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة ، واشطفه باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد غير المترافق. الكشف عن علامات سطح ADSC عن طريق قياس التدفق^{الخلوي 13}.

2. عزل الميتوكوندريا عن الخلايا الجذعية الدهنية

ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات عزل الميتوكوندريا على الجليد.

1. عندما تنمو ADSCs إلى كثافة 90٪ ، هضم الخلايا ب 2 مل من 0.05٪ تربسين / EDTA ، وجهاز الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، وجمع الخلايا وعدها ، وخذ 1 × 10^{7 خلايا لكل} استخراج.
2. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الميتوكوندريا (لتحضير المخزن المؤقت: 10 مل من 0.1 M Tris-MOPS ، 1 مل من 0.1 M EGTA / Tris ، و 20 مل من 1 M سكروز ؛ ارفع الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4) مع كوكتيل مثبط البروتياز 1x بعد الغسيل ب 2 مل من PBS المعقم ، ثم يحتضن على الثلج لمدة 5 دقائق.
3. قم بتجانس الخلايا 20x-30x باستخدام الخالط الزجاجي (2.0 مل) وتحقق من درجة التجانس عن طريق تلطيخ الtrypan الأزرق.
   ملاحظة: يجب أن تكون نسبة الخلايا الملطخة ~ 80٪. سيؤدي التجانس المفرط إلى إتلاف بنية الميتوكوندريا.
4. جهاز طرد مركزي تتجانس الخلية عند 600 × جم لمدة 15 دقيقة ، وخذ المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مبرد مسبقا سعة 1.5 مل ، وكرر العملية مرة واحدة.
5. قم بجهاز الطرد المركزي للطافي عند 7,500 × جم لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. اغسل راسب الميتوكوندريا وأعد تعليقه عن طريق إضافة ~ 100 ميكرولتر من مخزن حقن الميتوكوندريا المبرد مسبقا (225 ملي مانيتول ، 75 ملي سكروز ، 10 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك ، و 5 ملي كيلو هيدروكلوريك₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.2) ، بتركيز 1-5 مجم / مل (تركيز البروتين الكلي). نقل معلق الميتوكوندريا على الجليد.
6. تحليل وظيفة ونقاء الميتوكوندريا المعزولة عن طريق تحليل مقياس التدفق الخلوي JC-1 واللطخة الغربية (VDAC1 و β-actin و Lamin B) ¹³.
   1. قسم الميتوكوندريا المعزولة إلى ثلاث مجموعات: ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و JC-1 ملطخ ، و JC-1 ملطخ بمعالجة مسبقة ب 30 دقيقة من الكربونيل سيانيد 3-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP).
   2. بعد الطرد المركزي عند 7,500 × جم ، تخلص من المادة الطافية المخزن المؤقت.
   3. التقط شدة التألق لمونومرات JC-1 (قناة FITC) والمجاميع (قناة PE) التي تم التقاطها بواسطة قياس التدفق الخلوي. قم بتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس نسب متوسط شدة التألق لقناة PE إلى قناة FITC.
      ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه في الظلام.

3. التحفيز الفائق للمبيض

1. حقن أنثى الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 10 أشهر داخل الصفاق مع 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية لمصل الفرس الحامل (PMSG) للإباضة الزائدة. بعد 48 ساعة, حقن 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية) داخل الصفاق.
2. بعد 13 ساعة من حقن قوات حرس السواحل الهايتية، قم بتمزيق قناة فالوب المتورمة باستخدام ملاقط مجهرية. حرر المجمعات الركامية من قناة فالوب المتورمة. قم بإذابة الخلايا الركامية في وسط M2 مع الهيالورونيداز (0.3 مجم / مل) عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: وقت الذوبان أقل من 5 دقائق. قلل من الوقت الذي يتعرض فيه المركب الركامي للهيالورونيداز ، حيث يمكن أن يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى إضعاف إمكانات نمو البويضات.

4. نقل الميتوكوندريا مع الحقن المجهري

1. ضع المنوية بدون ذيل في سائل الميتوكوندريا. الحصول على المنوية بدون ذيل عن طريق القطع باستخدام الموجات فوق الصوتية¹⁷. ضع المنوية بدون ذيل في سائل الميتوكوندريا ، بحيث يوجد 100 منوي في 50 ميكرولتر من سائل الميتوكوندريا.
   ملاحظة: نظرا لأن معلق الميتوكوندريا لزج قليلا وغير مستقر في المختبر ، فأكمل الحقن في غضون 30 دقيقة وقم بتغيير إبرة الحقن المجهري على الفور عندما تصبح مسدودة. القطر الداخلي الأمثل لإبرة الحقن المجهري هو 5 ميكرومتر.
2. حقن ~ 2 لول من عازلة تنفس الميتوكوندريا أو تعليق الميتوكوندريا مع المنوية في البويضات باستخدام حاقن دقيق تحت مجهر مقلوب (200x ؛ انظر جدول المواد) في غضون 30 دقيقة وفقا لبروتوكول Hiramoto كما هو موضح من قبل Mehlmann و Kline^10،18.
   ملاحظة: يمثل معلق الميتوكوندريا المحقون 1٪ -3٪ من الحجم الكلي للبويضات. التحكم في حجم (1٪ -3٪) من تعليق الميتوكوندريا في السيتوبلازم لضمان اتساق الحقن.
3. بعد الحقن ، ضع البويضات المخصبة في وسط M2 لتحقيق التوازن لمدة 15 دقيقة ، وانقل البويضات المخصبة الباقية إلى وسط زراعة M16.
4. افحص البويضات الخصبة الباقية من خلال مراقبة التشكل السلس ، والتكوين النووي ، وإطلاق الجسم القطبي الثاني¹⁹. مراقبة الأجنة وتصويرها وعدها في الساعة 09:00 صباحا و 06:00 مساء كل يوم لمدة 4 أيام. أخيرا ، قم بجمع وتجميد الأكياس الأريمية وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية لتحديد رقم نسخة ATP و mtDNA لتقييم عدد وتحسين زرع الميتوكوندريا.
   1. قم بإعداد البلازميد القياسي (البلازميد للقياس الكمي المطلق ، كما هو موضح^{سابقا 13}) ، لتحديد رقم نسخة الميتوكوندريا وفقا لرقم النسخة 1 × 10⁷ و 1 × 10⁶ و 1 × 10⁵ و 1 × 10⁴ و 1 × 10³ و 1 × 10² و 1 × 10¹. انقل الأجنة إلى أنبوب التعقيم وأضف 20 ميكرولتر من محلول المحللة لتحرير الحمض النووي للميتوكوندريا. بعد ذلك ، قم بإلغاء تنشيط البروتياز في المحللة عند 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. حدد رقم نسخة mtDNA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري باستخدام الإعداد التالي: 5 ميكرولتر من مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل ، 0.5 ميكرولتر من B6 التمهيدي إلى الأمام ، 0.5 ميكرولتر من B6 التمهيدي ، 2 ميكرولتر من منتج الانحلال الحراري ، و 2 ميكرولتر من ddH₂O. اتبع شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): المرحلة 1 ، 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ المرحلة 2 ، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ كرر الدورة 40x.

النتائج

في هذا البروتوكول ، قمنا بعزل وتمييز ADSCs من دهون الفئران (الشكل 1). للحصول على الميتوكوندريا المعزولة ، يجب تعطيل غشاء الخلية باستخدام الخالط الزجاجي. (الشكل 2 أ). من المهم الحصول على جزء ميتوكوندريا موحد بدون كتل كبيرة حتى لا يتم حظر أنبوب ا?...

Discussion

تحتوي البويضات على ميتوكوندريا أكثر من أي نوع من الخلايا في الجسم ، مع ~ 1-5 × 10 5^{أرقام نسخ} mtDNA. الميتوكوندريا ضرورية لنضج البويضات والتخصيب والتطور الجنيني ، وبالتالي ، فإن أي خلل وظيفي في الميتوكوندريا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض جودة البويضات. يرتبط انخفاض كمية الميتوك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test