Transferência mitocondrial de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo para oócitos de camundongo envelhecidos

Resumo

Aqui, descrevemos o isolamento de mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo de camundongo e, em seguida, transferimos as mitocôndrias para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade dos oócitos.

Resumo

Devido ao declínio na quantidade e qualidade dos oócitos relacionados à idade, a fertilidade das mulheres com mais de 35 anos diminuiu drasticamente. Os mecanismos moleculares que mantêm a qualidade do oócito permanecem obscuros, portanto, é difícil aumentar a taxa de natalidade de mulheres com mais de 35 anos atualmente. Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, e qualquer disfunção mitocondrial pode levar à redução da qualidade do oócito. Na década de 1990, a transferência citoplasmática de oócitos resultou em grande sucesso na reprodução humana, mas foi acompanhada por controvérsias éticas. Espera-se que o transplante mitócondrio autólogo seja uma técnica útil para aumentar a qualidade dos oócitos que diminuíram devido à idade. No presente estudo, usamos células-tronco derivadas de tecido adiposo de camundongos idosos como doador de mitocôndrias para aumentar a qualidade dos oócitos de camundongos idosos. O desenvolvimento da tecnologia de transferência mitócondrial autóloga proporcionará um tratamento novo e eficaz para a infertilidade em mulheres idosas.

Introdução

Um dos fatores importantes que afeta a fertilidade feminina é o envelhecimento do oócito; O declínio na qualidade do oócito é a principal causa de infertilidade em mulheres idosas. No entanto, a principal causa do envelhecimento oocitário e o mecanismo molecular que regula a qualidade do oócito ainda não estão claros. Estudos anteriores indicaram que tanto o número quanto a qualidade das mitocôndrias estão envolvidos no controle de qualidade dos oócitos e no desenvolvimento embrionário ^1,2,3. A diminuição da quantidade e qualidade das mitocôndrias está intimamente relacionada ao envelhecimento³.

Muitas tentativas foram feitas para melhorar a função das mitocôndrias em oócitos envelhecidos, incluindo o suplemento nutricional das mitocôndrias e a transferência de mitocôndrias. Suplementos nutricionais bem conhecidos e eficazes das mitocôndrias incluem coenzima Q10 (CoQ10), ácido alfa-lipóico (α-LA) e resveratrol (RSV)⁴. Estudos demonstraram que a suplementação de CoQ10 pode não apenas melhorar o declínio relacionado à idade na quantidade e qualidade dos oócitos, mas também promover o desenvolvimento normal e a ovulação dos oócitos⁵. α-AL retarda o declínio da qualidade do oócito relacionado ao envelhecimento e ao fenótipo metabólico de pacientes com síndrome dos ovários policísticos (SOP)^6,7. O resveratrol pode reduzir o número de oócitos com fusos anormais e alinhamento cromossômico inadequado aumentado em camundongos idosos, enquanto afeta o desenvolvimento embrionário de maneira^{dose-dependente 8}. No entanto, como o efeito clínico dos suplementos nutricionais das mitocôndrias não atingiu os níveis esperados, outros tratamentos eficazes precisam ser explorados.

A primeira tentativa de transferência de mitocôndrias foi realizada em 1997. A transferência do citoplasma de oócitos de doadores jovens para oócitos receptores idosos melhorou a qualidade do oócito das pacientes idosas, que deram à luz bebês saudáveis com sucesso⁹, que foi a justificativa por trás do uso dessa técnica. No entanto, a transferência citoplasmática alogênica de oócitos não pode ser aplicada à prática clínica devido a duas razões principais - o problema da heterogeneidade genética e questões regulatórias causadas pelo transplante de mitocôndrias de doadores. Um estudo anterior mostrou que o transplante mitocondrial de células autólogas poderia melhorar a qualidade dos oócitos, o desenvolvimento embrionário e a fertilidade de camundongos idosos¹⁰, que não apresentava problemas éticos ou de heterogeneidade genética e resolveu alguns problemas causados pela transferência do citoplasma do oócito do doador para os oócitos receptores^10,11.

Enquanto isso, a transferência mitocondrial de células autólogas foi superior ao efeito de suplementos nutricionais prévios de mitocôndrias na melhoria da qualidade dos oócitos¹¹. Portanto, o transplante mitocondrial de células autólogas é a escolha adequada para a aplicação clínica dessa tecnologia¹². As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) podem ser obtidas por tecnologia minimamente invasiva, são fáceis de isolar e cultivar e podem ser uma célula "semente" ideal para a medicina regenerativa. As mitocôndrias são ricas em ADSCs e a função das mitocôndrias não diminui com a idade, o que sugere que as ADSCs são uma excelente fonte de mitocôndrias^13,14. Neste protocolo, introduzimos um método para transferir as mitocôndrias de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo para oócitos de camundongos envelhecidos para melhorar a qualidade do oócito. Este é um modelo útil para a tecnologia de transferência mitocondrial autóloga ADSC humana.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Terceiro Hospital Afiliado, Universidade de Soochow. Todas as operações seguem os cuidados e uso adequados dos animais e as diretrizes nacionais e de cuidados. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo de camundongo envelhecido (ADSCs)

1. Sacrifique os camundongos idosos (10 meses de idade, em média três) por luxação cervical sob anestesia com pentobarbital sódico e mergulhe-os em álcool a 75% por 5 minutos antes do isolamento do tecido adiposo.
   NOTA: A imersão em álcool a 75% por 5 min pode reduzir efetivamente a contaminação das células primárias.
2. Faça uma incisão de 2 cm na pele no inguinal bilateral, exponha a gordura subcutânea e use uma pinça para isolar a gordura subcutânea. Colete a gordura inguinal bilateral dos camundongos usando uma tesoura oftálmica esterilizada (evite cortar o tecido subcutâneo). Coloque o tecido adiposo em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL no gelo e transporte-o imediatamente para o laboratório de cultura de células.
3. Transfira o tecido adiposo para uma placa de 6 poços, enxágue 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 100 U/mL de penicilina e estreptomicina. Remova os vasos sanguíneos, fáscia gordurosa e tecido conjuntivo sob o tecido adiposo e corte-os em pedaços de ~ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
   NOTA: Ao isolar células-tronco adiposas, muitas vezes há contaminação das células endoteliais vasculares. A remoção dos vasos sanguíneos do tecido adiposo pode reduzir a contaminação das células endoteliais vasculares.
4. Transfira o tecido adiposo triturado para o mesmo volume de solução de colagenase tipo I (concentração final de 0,1% de colagenase tipo I) e digerir a 37 ° C por 30 min.
5. Adicione um volume igual de meio de cultura completo (meio DMEM F-12 contendo 10% de soro bovino fetal) para neutralizar a colagenase tipo I, centrifugue a 600 × g por 10 min e descarte o sobrenadante e o tecido adiposo.
6. Ressuspenda o sedimento celular no meio de cultura completo. Remova o tecido não digerido por filtração através de um filtro de células de 40 μm e, em seguida, centrifugue a 600 × g por 5 min.
7. Ressuspenda a suspensão celular com 5 ml do meio de cultura completo e utilize uma pipeta de 1 ml para pipetar suavemente para cima e para baixo para formar uma suspensão unicelular. Verifique a suspensão celular ao microscópio colocando uma alíquota em um hemocitômetro para confirmar que existem apenas células chamuscadas, sem agregados. Adicionar a suspensão unicelular a um balão de cultura de² células de 25 cm e cultivar numa incubadora de CO₂ a 5% a 37 °C.
8. Mudar o meio de cultura 48 h mais tarde. Continue a trocar o meio de cultura a cada 2-3 dias.
9. Após 7 a 10 dias, desconecte as células para a passagem celular quando sua confluência atingir 80% -90%. Remova o meio de cultura completo e lave as células com 2 mL de PBS. Em seguida, adicionar 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% para realizar a dissociação celular^15,16.
10. Adicionar meio de indução adipogénica durante 14 dias para induzir a diferenciação das ADSCs em adicôctyes. Adicione meio de indução osteogênica por 28 dias às ADSCs semeadas em placas de 24 poços revestidas com gelatina a 2% para induzir sua diferenciação em osteoblastos. Para diferenciação neural, cultive as ADSCs com meio de indução neural e, em seguida, detecte a enolase específica do neurônio e o polipeptídeo mediador do neurofilamento usando imunofluorescência¹⁵.
    1. Fixe as células em paraformaldeído a 4% por 30 min em temperatura ambiente, seguido de permeabilização com Triton X-100 a 0,5% em PBS por 15 min.
    2. Após o bloqueio com 3% de BSA em PBS, incubar as células com anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) diluídos em solução de bloqueio a 4 °C durante a noite.
    3. Incube as células com anticorpos secundários por 45 min e depois comode-as com DAPI por 10 min. Em seguida, examine as células com um microscópio de fluorescência.
11. Colete a suspensão ADSC de célula única usando 0,05% de tripsina / EDTA, centrifugue a 600 × g por 5 min à temperatura ambiente e ressuspenda em PBS para ajustar a densidade da célula para 1 × 10⁶ / mL. Alicote a suspensão celular em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (100 μL/tubo) e adicione anticorpos monoclonais CD29, CD90, CD34 e HLA-DR de coelho marcados com FITC, com uma concentração de anticorpos de 0,5 μg/mL. Trate o grupo controle com o mesmo volume de IgG FITC de coelho, incube em gelo por 30 min e enxágue com PBS para remover o anticorpo não conjugado. Detecte os marcadores de superfície ADSC por citometria de fluxo¹³.

2. Isolamento de mitocôndrias de células-tronco adiposas

NOTA: Todas as operações de isolamento das mitocôndrias devem ser realizadas no gelo.

1. Quando as ADSCs atingirem 90% de densidade, digerir as células com 2 mL de tripsina a 0,05% / EDTA, centrifugar a 600 × g por 5 min, coletar e contar as células e tomar 1 × 10⁷ células para cada extração.
2. Ressuspenda as células em 2 mL de tampão de extração de mitocôndrias (para preparação do tampão: 10 mL de Tris-MOPS 0,1 M, 1 mL de EGTA/Tris 0,1 M e 20 mL de sacarose 1 M; traga o volume para 100 mL com água destilada e ajuste o pH para 7,4) com 1x coquetel de inibidor de protease após lavagem com 2 mL de PBS estéril, e depois incubar no gelo por 5 min.
3. Homogeneizar as células 20x-30x com um homogeneizador de vidro (2,0 mL) e verificar o grau de homogeneização por coloração com azul de tripano.
   NOTA: A proporção das células coradas deve ser de ~ 80%. A homogeneização excessiva danificará a estrutura das mitocôndrias.
4. Centrifugue o homogeneizado de células a 600 × g por 15 min, leve o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mL e repita a operação uma vez.
5. Centrifugar o sobrenadante a 7.500 × g durante 15 min e rejeitar o sobrenadante. Lave o precipitado mitocondrial e ressuspenda-o adicionando ~ 100 μL de tampão de injeção mitocondrial pré-resfriado (225 mM de manitol, 75 mM de sacarose, 10 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl e 5 mM de KH₂PO₄, pH 7,2), a uma concentração de 1-5 mg / mL (concentração total de proteína). Transporte a suspensão mitocondrial no gelo.
6. Analisar a função e a pureza das mitocôndrias isoladas por análise citométrica de fluxo JC-1 e Western blot (VDAC1, β-actina e Lamin B)¹³.
   1. Divida as mitocôndrias isoladas em três grupos: dimetilsulfóxido (DMSO), JC-1 corado e JC-1 corado com 30 min de pré-tratamento com cianeto de carbonila 3-clorofenilhidrazona (CCCP).
   2. Após centrifugação a 7.500 × g, rejeitar o sobrenadante e suspender o tampão.
   3. Capturar a intensidade de fluorescência dos monômeros JC-1 (canal FITC) e agregados (canal PE) que foram capturados por citometria de fluxo. Avalie os potenciais de membrana mitocondrial isolados medindo as proporções da intensidade média de fluorescência do canal PE para o canal FITC.
      NOTA: Execute as etapas acima no escuro.

3. Superestimulação ovariana

1. Injete camundongos C57BL/6 fêmeas de 10 meses de idade por via intraperitoneal com 10 UI de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) para superovulação. Após 48 h, injetar 10 UI de gonadotrofina coriónica humana (hCG) por via intraperitoneal.
2. Às 13 h após a injeção de hCG, rasgue a trompa de Falópio inchada com uma pinça microscópica. Libere os complexos cumulus da trompa de Falópio inchada. Dissolver as células do cumulus em meio M2 com hialuronidase (0,3 mg/ml) a 37 °C.
   NOTA: O tempo de dissolução é inferior a 5 min. Minimize o tempo durante o qual o complexo cumulus é exposto à hialuronidase, pois a exposição prolongada pode prejudicar o potencial de desenvolvimento do oócito.

4. Transferência mitocondrial junto com ICSI

1. Coloque o esperma sem cauda no líquido mitocondrial. Obtenha esperma sem cauda cortando usando ultrassom¹⁷. Coloque o espermatozóide sem cauda no líquido mitocondrial, de modo que haja 100 espermatozóides em 50 μL do líquido mitocondrial.
   NOTA: Como a suspensão mitocondrial é ligeiramente viscosa e não estável in vitro, conclua a injeção dentro de 30 minutos e troque a agulha de microinjeção imediatamente quando ela ficar entupida. O diâmetro interno ideal da agulha de microinjeção é de 5 μm.
2. Injete ~ 2 pL de tampão respiratório mitocondrial ou suspensão mitocondrial com espermatozóides nos oócitos usando um microinjetor sob um microscópio invertido (200x; ver Tabela de Materiais) dentro de 30 min de acordo com o protocolo de Hiramoto conforme descrito por Mehlmann e Kline^10,18.
   NOTA: A suspensão mitocondrial injetada é responsável por 1% -3% do volume total de oócitos. Controle o volume (1%-3%) da suspensão mitocondrial no citoplasma para garantir a consistência da injeção.
3. Após a injeção, coloque os oócitos fertilizados em meio M2 para equilíbrio por 15 min e transfira os óvulos fertilizados sobreviventes para o meio de cultura M16.
4. Examine os ovos férteis sobreviventes observando a morfologia suave, a formação pró-nuclear e a liberação do segundo corpo polar¹⁹. Observe, fotografe e conte os embriões às 09:00 e 18:00 todos os dias durante 4 dias. Finalmente, colete e congele os blastocistos e armazene-os em uma geladeira a -80 ° C para determinação do número de cópias de ATP e mtDNA para avaliar o número e a melhoria do transplante mitocondrial.
   1. Preparar plasmídeo-padrão (plasmídeo para quantificação absoluta, conforme descrito anteriormente¹³), para a determinação do número de cópias mitocondriais de acordo com o número de cópias de 1 × 10⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² e 1 × 10¹. Transfira os embriões para o tubo de esterilização e adicione 20 μL de tampão lisado para liberar o DNA mitocondrial. Em seguida, inative a protease no lisado a 55 °C por 20 min e 95 °C por 10 min.
   2. Determine o número de cópias do mtDNA por PCR quantitativo de fluorescência usando a seguinte configuração: 5 μL de mistura de PCR, 0,5 μL de primer B6 para frente, 0,5 μL de primer B6 rev, 2 μL de produto de pirólise e 2 μL de ddH₂O. Siga as condições de PCR: estágio 1, 95 ° C por 3 min; estágio 2, 95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s; Repita o ciclo 40x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Neste protocolo, isolamos e caracterizamos as ADSCs da gordura de camundongo (Figura 1). Para obter mitocôndrias isoladas, a membrana celular deve ser rompida usando um homogeneizador de vidro. (Figura 2A). É importante obter uma fração mitocondrial uniforme sem grandes aglomerados para que o tubo de microinjeção não seja bloqueado. Primeiro, 200 μL e depois 10 μL, ponteiras de pipeta devem ser usadas para ressuspender ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Os oócitos contêm mais mitocôndrias do que qualquer tipo de célula do corpo, com ~ 1-5 × 10⁵ números de cópias de mtDNA. As mitocôndrias são essenciais para a maturação do oócito, fertilização e desenvolvimento embrionário, portanto, qualquer disfunção mitocondrial pode levar à diminuição da qualidade do oócito. A diminuição da quantidade e qualidade mitocondrial está intimamente relacionada ao envelhecimento fisiológico. Neste protocolo, um método si...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test