Митохондриальный перенос из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани мыши, в состарившиеся ооциты мышей

Резюме

В этой статье мы описываем выделение митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жира мыши, а затем перенос митохондрий в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов.

Аннотация

Из-за снижения количества и качества ооцитов, связанного с возрастом, фертильность женщин старше 35 лет резко снизилась. Молекулярные механизмы, поддерживающие качество ооцитов, остаются неясными, поэтому в настоящее время трудно увеличить рождаемость женщин старше 35 лет. Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, и любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению качества ооцитов. В 1990-х годах перенос цитоплазматических ооцитов привел к большим успехам в репродукции человека, но сопровождался этическими спорами. Ожидается, что аутологичная митохондриальная трансплантация станет полезным методом для повышения качества ооцитов, которое уменьшилось из-за возраста. В настоящем исследовании мы использовали стволовые клетки, полученные из жировой ткани от старых мышей, в качестве донора митохондрий для повышения качества ооцитов старых мышей. Дальнейшее развитие технологии аутологичного митохондриального переноса обеспечит новый и эффективный метод лечения бесплодия у пожилых женщин.

Введение

Одним из важных факторов, влияющих на женскую фертильность, является старение ооцитов; Снижение качества ооцитов является основной причиной бесплодия у женщин пожилого возраста. Тем не менее, основная причина старения ооцитов и молекулярный механизм, регулирующий качество ооцитов, до сих пор неясны. Предыдущие исследования показали, что как количество, так и качество митохондрий участвуют в контроле качества ооцитов и эмбриональном развитии ^1,2,3. Уменьшение количества и качества митохондрий тесно связано со старением³.

Было предпринято множество попыток улучшить функцию митохондрий в стареющих ооцитах, включая пищевую добавку митохондрий и перенос митохондрий. Хорошо известные, эффективные пищевые добавки митохондрий включают коэнзим Q10 (CoQ10), альфа-липоевую кислоту (α-LA) и ресвератрол (RSV)⁴. Исследования показали, что добавки с коэнзимом Q10 могут не только улучшить возрастное снижение количества и качества ооцитов, но и способствовать нормальному развитию и овуляции ооцитов⁵. α-ЛК замедляет снижение качества ооцитов, связанное со старением и метаболическим фенотипом пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ)^6,7. Ресвератрол может уменьшать количество ооцитов с аномальными веретенами и неправильным выравниванием хромосом, увеличенным у стареющих мышей, при этом влияя на эмбриональное развитие дозозависимым^{образом.} Однако, поскольку клинический эффект пищевых добавок митохондрий не достиг ожидаемого уровня, необходимо изучить другие эффективные методы лечения.

Первая попытка переноса митохондрий была предпринята в 1997 году. Перенос цитоплазмы молодого донора в состаренные ооциты реципиента улучшил качество ооцитов у пациентов в возрасте, которые успешно родили здоровых^детей9, что и послужило обоснованием использования данной методики. Однако аллогенный цитоплазматический перенос ооцитов не может быть применен в клинической практике по двум основным причинам – проблеме генетической гетерогенности и регуляторным вопросам, вызванным трансплантацией донорских митохондрий. Предыдущее исследование показало, что трансплантация митохондрий аутологичных клеток может улучшить качество ооцитов, развитие эмбрионов и фертильность старых мышей¹⁰, что не имело этических проблем или проблем генетической гетерогенности и решило некоторые проблемы, вызванные переносом цитоплазмы донорских ооцитов в ооциты реципиента ^10,11.

Между тем, перенос митохондрий аутологичными клетками превосходил влияние предыдущих пищевых добавок митохондрий на улучшение качества^{ооцитов11}. Таким образом, трансплантация митохондриальных клеток с помощью аутологичных клеток является подходящим выбором для клинического применения данной технологии¹². Стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), могут быть получены с помощью минимально инвазивной технологии, их легко изолировать и культивировать, и они могут быть идеальными «семенными» клетками для регенеративной медицины. Митохондрии богаты ADSC, и функция митохондрий не снижается с возрастом, что позволяет предположить, что ADSC являются отличным источником митохондрий^13,14. В этом протоколе мы представляем метод переноса митохондрий мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани мыши, в состаренные ооциты мышей для улучшения качества ооцитов. Это полезная модель для технологии аутологичного митохондриального переноса человеческого ADSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике исследований на животных Третьей аффилированной больницы Университета Сучжоу. Все операции проводятся в соответствии с соответствующими рекомендациями агентства по уходу и использованию животных и национальными руководящими принципами. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Выделение и характеристика мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) из жировой ткани старых мышей

1. Принесите в жертву старейших мышей (10 месяцев, в среднем 3 года) при вывихе шейки матки под пентобарбитальной натриевой анестезией и замочите их в 75% спирте в течение 5 минут перед выделением жировой ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замачивание в 75% спирте в течение 5 минут может эффективно снизить загрязнение первичных клеток.
2. Сделайте разрез 2 см на коже на двусторонней паховой поверхности, обнажите подкожный жир и с помощью пинцета изолируйте подкожный жир. Двусторонний паховый жир у мышей соберут с помощью стерилизованных офтальмологических ножниц (избегайте разрезания подкожной клетчатки). Поместите жировую ткань в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл на льду и немедленно транспортируйте ее в лабораторию клеточных культур.
3. Перенесите жировую ткань в 6-луночный планшет, промойте его 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина. Удалите кровеносные сосуды, жировую фасцию и соединительную ткань под жировой тканью и разрежьте их на кусочки размером ~0,5 см x 0,5 см x 0,5 см.
   Примечание: При выделении жировых стволовых клеток часто происходит контаминация эндотелиальных клеток сосудов. Удаление кровеносных сосудов из жировой ткани может уменьшить загрязнение эндотелиальных клеток сосудов.
4. Перенесите измельченную жировую ткань в тот же объем раствора коллагеназы I типа (0,1% конечная концентрация коллагеназы I типа) и разварите при 37 °C в течение 30 минут.
5. Добавьте равный объем полной питательной среды (среда DMEM F-12, содержащая 10% фетальной бычьей сыворотки) для нейтрализации коллагеназы типа I, центрифугируйте при 600 × г в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость и жировую ткань.
6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной питательной среде. Удалите непереваренную ткань путем фильтрации через клеточное сетчатое фильтр 40 мкм, а затем центрифугируйте при 600 × г в течение 5 минут.
7. Повторно суспендируйте клеточную суспензию 5 мл полной питательной среды и с помощью пипетки объемом 1 мл аккуратно пипетируйте вверх и вниз с образованием одноклеточной суспензии. Проверьте клеточную суспензию под микроскопом, поместив аликвоту на гемоцитометр, чтобы подтвердить, что там есть только одиночные клетки, без каких-либо агрегатов. Добавьте суспензию одиночных клеток в колбу для клеточных культур диаметром 25^см2 и культивируйте в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C.
8. Смените питательную среду через 48 часов. Продолжайте менять питательную среду каждые 2-3 дня.
9. Через 7-10 дней отделите клетки для пропускания клеток, когда их слияние достигнет 80%-90%. Удалите всю питательную среду и промойте клетки 2 мл PBS. Затем добавьте 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА для проведения диссоциации клеток^15,16.
10. Добавьте адипогенную индукционную среду в течение 14 дней, чтобы вызвать дифференцировку ADSC в адипокты. Добавьте остеогенную индукционную среду в течение 28 дней к ADSC, нанесенным на 24-луночные планшеты, покрытые 2% желатином, чтобы индуцировать их дифференцировку в остеобласты. Для нейронной дифференцировки культивируют ADSC с помощью нервной индукционной среды, а затем детектируют нейрон-специфичную енолазу и полипептид медиатора нейрофиламентов с помощью иммунофлуоресценции¹⁵.
    1. Зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде на 30 мин при комнатной температуре с последующей пермеабилизацией 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин.
    2. После блокирования 3% БСА в PBS инкубируют клетки с первичными антителами (см. Таблицу материалов), разведенными в блокирующем растворе при 4 °C в течение ночи.
    3. Инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 45 минут, а затем окрашивайте их DAPI в течение 10 минут. Затем исследуйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа.
11. Соберите суспензию ADSC для одиночных клеток с использованием 0,05% трипсина/ЭДТА, центрифугируйте при 600 × г в течение 5 минут при комнатной температуре и повторно суспендируйте в PBS для регулировки плотности клеток до 1 × 10⁶/мл. Аликвотируют клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (100 мкл/пробирку) и добавляют меченые FITC моноклональные антитела кроликов против мышей CD29, CD90, CD34 и HLA-DR с концентрацией антител 0,5 мкг/мл. Обработайте контрольную группу таким же объемом IgG FITC кролика, инкубируйте на льду в течение 30 минут и промойте PBS для удаления неконъюгированного антитела. Определение поверхностных маркеров ADSC с помощью проточной цитометрии¹³.

2. Выделение митохондрий из жировых стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции по выделению митохондрий должны проводиться на льду.

1. Когда ADSCs вырастут до 90% плотности, расщепляют клетки с 2 мл 0,05% трипсина/ЭДТА, центрифугируют при 600 × г в течение 5 мин, собирают и подсчитывают клетки, и берут 1 × 10-7 клеток для каждой экстракции.
2. Ресуспендируйте клетки в 2 мл буфера для экстракции митохондрий (для приготовления буфера: 10 мл 0,1 М Трис-МОПС, 1 мл 0,1 М EGTA/Трис и 20 мл 1 М сахарозы; доведите объем до 100 мл дистиллированной водой и отрегулируйте рН до 7,4) с 1х коктейлем ингибиторов протеазы после промывания 2 мл стерильного PBS, А затем инкубировать на льду в течение 5 минут.
3. Гомогенизируйте клетки в 20-30 раз с помощью стеклянного гомогенизатора (2,0 мл) и проверьте степень гомогенизации путем окрашивания трипановым синим.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доля окрашенных клеток должна составлять ~80%. Чрезмерная гомогенизация повредит структуру митохондрий.
4. Центрифугируйте гомогенат клеток при 600 × г в течение 15 мин, поместите надосадочную жидкость в новую, предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и повторите операцию один раз.
5. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 7 500 × г в течение 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте митохондриальный осадок и повторно суспендируйте его, добавив ~100 мкл предварительно охлажденного митохондриального инъекционного буфера (225 мМ маннитола, 75 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl и 5 мМ KH₂PO₄, pH 7,2) в концентрации 1-5 мг/мл (общая концентрация белка). Транспортируйте митохондриальную суспензию по льду.
6. Анализ функции и чистоты выделенных митохондрий с помощью проточного цитометрического анализа JC-1 и вестерн-блоттинга (VDAC1, β-актин и ламин В)¹³.
   1. Разделите выделенные митохондрии на три группы: диметилсульфоксид (ДМСО), окрашенный JC-1, и JC-1, окрашенный 30-минутной предварительной обработкой карбонилцианидом 3-хлорфенилгидразона (CCCP).
   2. После центрифугирования при 7 500 × г выбросьте надосадочную жидкость и приостановите буфер.
   3. Захват интенсивности флуоресценции мономеров JC-1 (канал FITC) и агрегатов (канал PE), которые были захвачены с помощью проточной цитометрии. Оцените потенциалы изолированных митохондриальных мембран путем измерения отношений средней интенсивности флуоресценции ПЭ-канала и канала FITC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте вышеуказанные действия в темноте.

3. Суперстимуляция яичников

1. Внутрибрюшинно ввести 10-месячной самке мышей C57BL/6 10 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG) для суперовуляции. Через 48 ч внутрибрюшинно ввести 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).
2. Через 13 ч после инъекции ХГЧ разорвите опухшую маточную трубу микроскопическим пинцетом. Выпустите кумулюсные комплексы из опухшей маточной трубы. Кумулюсные клетки растворить в среде М2 гиалуронидазой (0,3 мг/мл) при 37 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время растворения составляет менее 5 минут. Сведите к минимуму время, в течение которого кумулюсный комплекс подвергается воздействию гиалуронидазы, так как длительное воздействие может нарушить потенциал развития ооцитов.

4. Перенос митохондрий вместе с ИКСИ

1. Поместите сперматозоиды без хвостика в митохондриальную жидкость. Получить сперму без хвостика путем разреза с помощью ультразвука¹⁷. Поместите сперматозоиды без хвоста в митохондриальную жидкость таким образом, чтобы в 50 мкл митохондриальной жидкости было 100 сперматозоидов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку митохондриальная суспензия является слегка вязкой и нестабильной in vitro, завершите инъекцию в течение 30 минут и немедленно смените иглу для микроинъекций, как только она закупорится. Оптимальный внутренний диаметр иглы для микроинъекций составляет 5 мкм.
2. Введите ~2 мл буфера митохондриального дыхания или митохондриальной суспензии со сперматозоидами в ооциты с помощью микроинъектора под перевернутым микроскопом (200x; см. Таблицу материалов) в течение 30 минут в соответствии с протоколом Хирамото, описанным Mehlmann и Kline^10,18.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Введенная митохондриальная суспензия составляет 1%-3% от общего объема ооцитов. Контролируйте объем (1%-3%) митохондриальной суспензии в цитоплазме, чтобы обеспечить консистенцию инъекции.
3. После инъекции оплодотворенные яйцеклетки поместить в среду М2 для уравновешивания на 15 минут, а выжившие оплодотворенные яйцеклетки перенести в культуральную среду М16.
4. Исследуйте выжившие оплодотворенные яйца, наблюдая за гладкой морфологией, образованием пронуклеаров и выходом второго полярного тела¹⁹. Наблюдайте, фотографируйте и подсчитывайте эмбрионы в 09:00 и 18:00 каждый день в течение 4 дней. Наконец, соберите и заморозьте бластоцисты и храните их в холодильнике при температуре -80 °C для определения числа копий АТФ и мтДНК для оценки количества и улучшения митохондриальной трансплантации.
   1. Приготовьте стандартную плазмиду (плазмиду для абсолютного количественного определения, как описано ранее¹³) для определения числа митохондриальных копий в соответствии с числом копий 1 ×^{10 7}, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² и 1 × 10¹. Перенесите эмбрионы в стерилизационную пробирку и добавьте 20 мкл буфера для лизата, чтобы высвободить митохондриальную ДНК. Затем инактивируйте протеазу в лизате при 55 °C в течение 20 мин и 95 °C в течение 10 мин.
   2. Определить число копий мтДНК методом флуоресцентной количественной ПЦР с использованием следующей установки: 5 мкл смеси для ПЦР, 0,5 мкл праймера В6, 0,5 мкл праймера В6, 2 мкл продукта пиролиза и 2 мкл ddH₂O. Соблюдайте условия ПЦР: стадия 1, 95 °С в течение 3 мин; stage2, 95 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с; Повторите цикл 40 раз.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этом протоколе мы выделили и охарактеризовали ADSC из мышиного жира (рис. 1). Для получения изолированных митохондрий клеточную мембрану необходимо нарушить с помощью стеклянного гомогенизатора. (Рисунок 2А). Важно получить однородную м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ооциты содержат больше митохондрий, чем любой тип клеток в организме, с числом копий ~1-5 ×^{10 5} мтДНК. Митохондрии необходимы для созревания ооцитов, оплодотворения и эмбрионального развития, поэтому любая митохондриальная дисфункция может привести к снижению кач?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test