마우스 지방 유래 중간엽 줄기 세포에서 노화된 마우스 난모세포로의 미토콘드리아 전달

요약

여기에서는 마우스 지방 유래 중간엽 줄기 세포에서 미토콘드리아를 분리한 다음 미토콘드리아를 노화된 마우스 난모세포로 이식하여 난모세포의 품질을 개선하는 방법을 설명합니다.

초록

나이와 관련된 난모세포의 양과 질이 감소함에 따라 35세 이상 여성의 생식력은 급격히 감소했습니다. 난모세포의 질을 유지하는 분자 메커니즘은 불분명한 상태로 남아 있어 현재로서는 35세 이상 여성의 출산율을 높이기가 어렵습니다. 난모세포는 신체의 어떤 세포보다 더 많은 미토콘드리아를 함유하고 있으며, 미토콘드리아 기능 장애는 난모세포의 질을 저하시킬 수 있습니다. 1990년대에 난모세포 세포질 이식은 인간 생식에 큰 성공을 거두었지만 윤리적 논란을 동반했습니다. 자가 미토콘드리아 이식은 노화로 인해 감소한 난모세포의 질을 높이는 데 유용한 기술이 될 것으로 기대됩니다. 본 연구에서는 노화된 마우스의 난모세포의 품질을 높이기 위해 노화된 마우스의 지방 유래 줄기세포를 미토콘드리아 기증자로 사용했습니다. 자가 미토콘드리아 전달 기술의 추가 개발은 고령 여성의 불임에 대한 새롭고 효과적인 치료법을 제공할 것입니다.

서문

여성의 생식력에 영향을 미치는 중요한 요인 중 하나는 난모세포 노화입니다. 난모세포의 질 저하는 고령 여성의 불임의 주요 원인입니다. 그러나 난모세포 노화의 주요 원인과 난모세포 질을 조절하는 분자 메커니즘은 아직 불분명합니다. 이전 연구에서는 미토콘드리아의 수와 질이 모두 난모세포의 품질 관리와 배아 발달에 관여한다고 밝혔습니다 ^1,2,3. 미토콘드리아의 양과 질의 감소는 노화와 밀접한 관련이 있습니다³.

노화된 난모세포에서 미토콘드리아의 기능을 개선하기 위한 많은 시도가 이루어졌으며, 여기에는 미토콘드리아 및 미토콘드리아 전달의 영양 보충제가 포함됩니다. 잘 알려진 효과적인 미토콘드리아의 영양 보충제로는 코엔자임 Q10(CoQ10), 알파 리포산(α-LA), 레스베라트롤(RSV)^이 있습니다4. 연구에 따르면 CoQ10 보충제는 노화와 관련된 난모세포의 양과 질 감소를 개선할 수 있을 뿐만 아니라 난모세포의 정상적인 발달과 배란을 촉진할 수 있습니다⁵. α-LA는 다낭성 난소 증후군(PCOS) 환자의 노화 및 대사 표현형과 관련된 난모세포의 질 저하를 늦춥니다^6,7. 레스베라트롤은 노화 마우스에서 비정상적인 방추체와 부적절한 염색체 정렬이 증가한 난모세포의 수를 감소시키는 동시에 용량 의존적 방식으로 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다⁸. 그러나 미토콘드리아의 영양 보충제의 임상적 효과가 기대 수준에 도달하지 못했기 때문에 다른 효과적인 치료법을 모색해야 합니다.

미토콘드리아 이식의 첫 번째 시도는 1997년에 이루어졌습니다. 젊은 기증자의 난모세포 세포질이 고령의 수혜자 난모세포로 이식되자 고령 환자의 난모세포 질이 향상되었고, 건강한 유아^{를 성공적으로 출산}한 환자9는 이 기법을 사용하게 된 근거가 되었다. 그러나 동종 난모세포 세포질 이식은 유전적 이질성 문제와 공여자 미토콘드리아 이식으로 인한 조절 문제의 두 가지 주요 원인으로 인해 임상 실습에 적용할 수 없습니다. 이전 연구에서는 자가 세포 미토콘드리아 이식이 윤리적 문제나 유전적 이질성 문제가 없는 노화된 마우스¹⁰의 난모세포의 질, 배아 발달 및 생식력을 향상시킬 수 있으며 기증자 난모세포 세포질이 수혜자 난모세포로 전달되어 발생하는 일부 문제를 해결할 수 있음을 보여주었습니다^10,11.

한편, 자가 세포 미토콘드리아 전달은 이전의 미토콘드리아 영양 보충제보다 난모세포의 질을 개선하는 효과가 우수했다¹¹. 그러므로, 자가 세포 미토콘드리아 이식은 이 기술의 임상적 적용을 위한 적절한 선택이다¹². 지방 유래 줄기세포(ADSC)는 최소 침습 기술로 얻을 수 있고, 분리 및 배양이 용이하며, 재생 의학에 이상적인 "씨앗" 세포가 될 수 있습니다. 미토콘드리아는 ADSC가 풍부하고 미토콘드리아의 기능은 나이가 들어도 감소하지 않으며, 이는 ADSC가 미토콘드리아^13,14의 훌륭한 공급원임을 시사합니다. 이 프로토콜에서는 마우스 지방 유래 중간엽 줄기세포의 미토콘드리아를 노화된 마우스 난모세포로 전달하여 난모세포 품질을 향상시키는 방법을 소개합니다. 이것은 인간 ADSC 자가 미토콘드리아 전달 기술에 유용한 모델입니다.

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프로토콜

기술된 모든 동물실험은 수저우대학교 제3부속병원의 동물연구윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 작업은 적절한 동물 관리 및 사용 기관 및 국가 지침을 따릅니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 노화된 마우스 지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)의 분리 및 특성화

1. 늙은 쥐(10개월령, 평균 3마리)를 펜토바르비탈 나트륨 마취 하에 자궁경부 탈구로 희생시키고 지방 조직을 분리하기 전에 75% 알코올에 5분 동안 담가둡니다.
   참고: 75% 알코올에 5분 동안 담그면 일차 세포의 오염을 효과적으로 줄일 수 있습니다.
2. 양측 서혜부의 피부를 2cm 절개하여 피하 지방을 노출시킨 후 핀셋을 사용하여 피하 지방을 분리합니다. 멸균된 안과 가위를 사용하여 마우스에서 양측 서혜부 지방을 수집합니다(피하 조직을 절단하지 마십시오). 지방 조직을 얼음 위의 15mL 멸균 원심분리 튜브에 넣고 즉시 세포 배양 실험실로 운반합니다.
3. 지방 조직을 6웰 플레이트로 옮기고 100U/mL의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)로 3번 헹굽니다. 지방 조직 아래의 혈관, 지방근막, 결합 조직을 제거하고 ~0.5cm x 0.5cm x 0.5cm 조각으로 자릅니다.
   참고: 지방 줄기 세포를 분리할 때 혈관 내피 세포가 오염되는 경우가 많습니다. 지방 조직에서 혈관을 제거하면 혈관 내피 세포 오염을 줄일 수 있습니다.
4. 파쇄된 지방 조직을 동일한 부피의 콜라겐분해효소 I형 용액(콜라겐분해효소 I형의 최종 농도 0.1%)으로 옮기고 37°C에서 30분 동안 분해합니다.
5. 콜라겐분해효소 I형을 중화시키기 위해 동일한 부피의 완전 배양 배지(10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM F-12 배지)를 첨가하고, 600 × g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액 및 지방 조직을 버립니다.
6. 세포 펠렛을 완전한 배양 배지에 재현탁시킵니다. 소화되지 않은 조직을 40μm 세포 여과기를 통해 여과하여 제거한 다음 600 ×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
7. 5mL의 완전한 배양 배지로 세포 현탁액을 재현탁하고 1mL 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 형성합니다. 혈구계에 부분 표본을 올려 현미경으로 세포 현탁액을 확인하여 응집체 없이 단일 세포만 있는지 확인합니다. 단일 세포 현탁액을 25cm² 세포 배양 플라스크에 추가하고 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다.
8. 48시간 후에 배양 매체를 변경합니다. 2-3일마다 배양 배지를 계속 교체하십시오.
9. 7-10 일 후에, 그들의 합류도가 80%-90%를 도달할 때 세포 passaging 세포를 분리하십시오. 전체 배양 배지를 제거하고 PBS 2mL로 세포를 세척합니다. 그런 다음 0.05% 트립신/EDTA 2mL를 첨가하여 세포 해리^15,16을 수행합니다.
10. ADSC를 아디옥티스로 분화시키기 위해 14일 동안 아디포겐 유도 배지를 추가합니다. 2% 젤라틴으로 코팅된 24웰 플레이트에 도금된 ADSC에 28일 동안 골형성 유도 배지를 첨가하여 조골세포로의 분화를 유도합니다. 신경 분화를 위해 신경 유도 배지로 ADSC를 배양한 다음 면역형광¹⁵를 사용하여 뉴런 특이적 에놀라아제 및 뉴로필라멘트 매개체 폴리펩티드를 검출합니다.
    1. 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드에 있는 세포를 고정한 다음 PBS에서 0.5% Triton X-100으로 15분 동안 투과화합니다.
    2. PBS에서 3% BSA로 차단한 후, 차단 용액에 희석한 1차 항체( 재료 표 참조)로 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 세포를 2차 항체로 45분 동안 배양한 후 DAPI로 10분 동안 염색합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 세포를 검사합니다.
11. 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 단일 세포 ADSC 현탁액을 수집하고 실온에서 5분 동안 600× g 에서 원심분리한 후 PBS에 재현탁하여 세포 밀도를 1 × 10⁶/mL로 조정합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브(100μL/튜브)에 분취하고 항체 농도가 0.5μg/mL인 FITC 표지 토끼 항 마우스 CD29, CD90, CD34 및 HLA-DR 단클론 항체를 추가합니다. 대조군을 동일한 부피의 토끼 IgG FITC로 치료하고 얼음에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 헹구어 접합되지 않은 항체를 제거합니다. 유세포 분석법¹³으로 ADSC 표면 마커를 검출합니다.

2. 지방 줄기 세포에서 미토콘드리아의 분리

참고: 모든 미토콘드리아 분리 작업은 얼음 위에서 수행해야 합니다.

1. ADSC가 90% 밀도로 성장하면 0.05% 트립신/EDTA 2mL로 세포를 분해하고 600× g 에서 5분 동안 원심분리한 후 세포를 수집 및 계수하고 추출할 때마다 1 × 10⁷ 개의 세포를 채취합니다.
2. 2mL의 미토콘드리아 추출 완충액(완충액 준비용: 0.1M Tris-MOPS 10mL, 0.1M EGTA/Tris 1mL 및 1M 수크로스 20mL, 증류수로 부피를 100mL로 가져오고 pH를 7.4로 조정)에 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 얼음 위에서 5 분 동안 배양합니다.
3. 유리 균질화기(2.0mL)로 세포 20x-30x를 균질화하고 트리판 블루 염색으로 균질화 정도를 확인합니다.
   참고: 염색된 세포의 비율은 ~80%여야 합니다. 과도한 균질화는 미토콘드리아의 구조를 손상시킵니다.
4. 600 × g 에서 15분 동안 세포 균질액을 원심분리하고, 상층액을 사전 냉각된 새 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣은 다음 작업을 한 번 반복합니다.
5. 상층액을 7,500×g에서 15 분 동안 원 심분리한 후 상층액을 버립니다. 미토콘드리아 침전물을 세척하고 1-5 mg/mL (총 단백질 농도)의 농도에서 ~100 μL의 예냉각된 미토콘드리아 주입 완충액(225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl 및 5 mM KH₂PO₄, pH 7.2)을 첨가하여 재현탁합니다. 미토콘드리아 현탁액을 얼음 위로 운반합니다.
6. JC-1 유세포 분석 및 웨스턴 블롯(VDAC1, β-actin 및 Lamin B)¹³을 통해 분리된 미토콘드리아의 기능과 순도를 분석합니다.
   1. 분리된 미토콘드리아를 30분 카르보닐 시안화물 3-클로로페닐히드라존(CCCP) 전처리로 염색된 디메틸설폭사이드(DMSO), JC-1 염색 및 JC-1의 세 그룹으로 나눕니다.
   2. 7,500 × g에서 원심분리 후 상층액을 버리고 완충액을 현탁시킵니다.
   3. 유세포 분석으로 캡처된 JC-1 단량체(FITC 채널) 및 응집체(PE 채널)의 형광 강도를 캡처합니다. FITC 채널에 대한 PE 채널의 평균 형광 강도의 비율을 측정하여 분리된 미토콘드리아 막 전위를 평가합니다.
      참고: 어두운 곳에서 위의 단계를 수행하십시오.

3. 난소 초자극

1. 10개월 된 암컷 C57BL/6 마우스에게 과배란을 위해 10IU의 임산부 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 복강내 주사합니다. 48시간 후, 10IU의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)을 복강내에 주입합니다.
2. hCG 주입 후 13시간이 지나면 미세한 핀셋으로 부풀어 오른 나팔관을 찢습니다. 부풀어 오른 나팔관에서 적운 복합체를 방출합니다. 37°C에서 히알루로니다아제(0.3mg/mL)로 M2 배지에 적운 세포를 용해시킵니다.
   참고: 용해 시간은 5분 미만입니다. 적운 복합체가 히알루로니다아제에 노출되는 시간을 최소화하는데, 장기간 노출되면 난모세포 발달 잠재력이 손상될 수 있으므로 최소화합니다.

4. ICSI와 함께 미토콘드리아 전달

1. 꼬리가 없는 정자를 미토콘드리아 액체에 넣는다. 꼬리가 없는 정자를 초음파를 사용하여 절단한다¹⁷. 미토콘드리아 액체에 꼬리가 없는 정자를 넣어 50μL의 미토콘드리아 액체에 100개의 정자가 있도록 합니다.
   참고: 미토콘드리아 현탁액은 약간 점성이 있고 체외에서 안정적이지 않으므로 30분 이내에 주입을 완료하고 미세주입 바늘이 막히면 즉시 교체하십시오. 미세주입 바늘의 최적 내경은 5μm입니다.
2. Mehlmann 및 Kline^10,18에 의해 기술된 바와 같이 Hiramoto의 프로토콜에 따라 30분 이내에 도립 현미경(200x, 재료 표 참조)에서 마이크로 인젝터를 사용하여 정자와 함께 미토콘드리아 호흡 완충액 또는 미토콘드리아 현탁액 ~2pL를 난모세포에 주입합니다.
   참고: 주입된 미토콘드리아 현탁액은 총 난모세포 부피의 1%-3%를 차지합니다. 주사의 일관성을 보장하기 위해 세포질에서 미토콘드리아 현탁액의 부피(1%-3%)를 조절합니다.
3. 주입 후, 수정된 난모세포를 M2 배지에 놓고 15분 동안 평형을 이루고, 살아남은 수정란을 M16 배양 배지로 옮깁니다.
4. 두 번째 극체¹⁹의 부드러운 형태, 전핵 형성 및 방출을 관찰하여 살아남은 유정란을 조사합니다. 4일 동안 매일 09:00 a.m.과 06:00 p.m.에 배아를 관찰하고, 사진을 찍고, 세십시오. 마지막으로, 배반포를 채취 및 동결하고 -80°C 냉장고에 보관하여 ATP 및 mtDNA 복제 수를 측정하여 미토콘드리아 이식의 수와 개선을 평가합니다.
   1. 1 ×^{10 7}, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² 및 1 × 10¹의 복제 수에 따라 미토콘드리아 복제 수를 결정하기 위한 표준 플라스미드(앞서 설명한 바와 같이 절대 정량화를 위한 플라스미드, 앞서 설명한^{바와 같이 13} 준비합니다. 배아를 멸균 튜브로 옮기고 20μL의 용해물 완충액을 추가하여 미토콘드리아 DNA를 방출합니다. 그런 다음 55°C에서 20분 동안, 95°C에서 10분 동안 용해물에서 프로테아제를 비활성화합니다.
   2. PCR 믹스 5 μL, B6 프라이머 포워드 0.5 μL, B6 프라이머 레브 0.5 μL, 열분해 산물 2 μL 및 ddH₂O 2 μL를 사용하여 형광 정량 PCR로 mtDNA 복제 수를 결정합니다. PCR 조건을 따르십시오 : 스테이지 1, 95 ° C에서 3 분; stage2, 30초 동안 95°C, 30초 동안 58°C, 30초 동안 72°C; 사이클을 40회 반복합니다.

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결과

이 프로토콜에서는 마우스 지방에서 ADSC를 분리하고 특성화했습니다(그림 1). 분리된 미토콘드리아를 얻으려면 유리 균질기를 사용하여 세포막을 파괴해야 합니다. (그림 2A). 미세주입관이 막히지 않도록 큰 덩어리가 없는 균일한 미토콘드리아 분획을 얻는 것이 중요합니다. 먼저 200 μL, 그 다음 10 μL의 피펫 팁을 사용하여 균?...

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토론

난모세포는 체내 어떤 유형의 세포보다 더 많은 미토콘드리아를 함유하고 있으며, ~1-5 × 10⁵ mtDNA 복제 수를 가지고 있습니다. 미토콘드리아는 난모세포 성숙, 수정 및 배아 발달에 필수적이므로 미토콘드리아 기능 장애는 난모세포 품질 저하로 이어질 수 있습니다. 미토콘드리아의 양과 질이 감소하는 것은 생리적 노화와 밀접한 관련이 있습니다. 이 프로토콜에?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test