マウス脂肪由来間葉系幹細胞から老化マウス卵子へのミトコンドリア移行

要約

ここでは、マウス脂肪由来間葉系幹細胞からミトコンドリアを単離し、その後、ミトコンドリアを老化したマウス卵子に移すことで卵子の品質を向上させる方法について述べます。

要約

年齢に関連した卵子の量と質の低下により、35歳以上の女性の生殖能力は急激に低下しています。卵子の質を維持する分子メカニズムは未だ解明されておらず、35歳以上の女性の出生率を上げることは難しいのが現状です。卵子には、体内のどの種類の細胞よりも多くのミトコンドリアが含まれており、ミトコンドリアの機能不全は卵子の質の低下につながる可能性があります。1990年代には、卵母細胞の細胞質移植がヒトの生殖に大きな成功を収めましたが、倫理的な論争を伴いました。自家ミトコンドリア移植は、加齢により低下した卵子の質を高めるための有用な技術として期待されています。本研究では、高齢マウスの脂肪由来幹細胞をミトコンドリアドナーとして用い、高齢マウスの卵子の質を向上させました。自家ミトコンドリア移植技術のさらなる発展により、高齢女性の不妊症に対する新しい効果的な治療法が提供されます。

概要

女性の生殖能力に影響を与える重要な要素の1つは、卵子の老化です。卵子の質の低下は、高齢女性の不妊の主な原因です。しかし、卵子の老化の主な原因や、卵子の品質を制御する分子メカニズムは、まだ解明されていません。これまでの研究では、ミトコンドリアの数と質の両方が卵子の品質管理と胚発生に関与していることが示されている^1,2,3。ミトコンドリアの量と質の低下は、老化と密接に関連しています³。

老化した卵子のミトコンドリアの機能を改善するために、ミトコンドリアの栄養補助食品やミトコンドリアの移植など、多くの試みがなされてきました。ミトコンドリアのよく知られた効果的な栄養補助食品には、コエンザイムQ10(CoQ10)、アルファリポ酸(α-LA)、レスベラトロール(RSV)⁴などがあります。研究によると、コエンザイムQ10の補給は、卵子の量と質の加齢に伴う減少を改善するだけでなく、卵子の正常な発達と排卵を促進することも示されています⁵。α-LAは、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS^)患者の老化と代謝表現型に関連する卵子の質の低下を遅らせます^6,7。レスベラトロールは、老化マウスで異常な紡錘体と不適切な染色体アライメントの増加を伴う卵子の数を減らすことができる一方で、用量依存的に胚発生に影響を与えることができます⁸。しかし、ミトコンドリアの栄養補助食品の臨床効果は期待されるレベルに達していないため、他の効果的な治療法を模索する必要があります。

ミトコンドリア移植の最初の試みは1997年に行われました。若年ドナー卵子細胞質を高齢レシピエント卵子に移すことで、高齢患者の卵子の質が向上し、健康な乳児を無事に出産した⁹、これがこの技術の使用の背後にある理論的根拠であった。しかし、同種卵母細胞の細胞質移植は、遺伝的不均一性の問題とドナーのミトコンドリア移植によって引き起こされる調節上の問題という2つの主要な理由により、臨床診療に適用することはできません。以前の研究では、自家細胞ミトコンドリア移植が、倫理的な問題や遺伝的不均一性の問題を持たず、ドナー卵子の細胞質がレシピエントの卵子に移ることによって引き起こされるいくつかの問題を解決した老齢マウス¹⁰の卵子の質、胚発生、および受精能を改善する可能性があることが示されました^10、11。

一方、自家細胞のミトコンドリア移行は、卵子の質の改善に対するミトコンドリアの以前の栄養補助食品の効果よりも優れていた¹¹。したがって、自家細胞ミトコンドリア移植は、この技術の臨床応用に適した選択です¹²。脂肪由来幹細胞(ADSC)は、低侵襲技術で入手でき、単離や培養が容易で、再生医療の理想的な「シード」細胞となり得ます。ミトコンドリアはADSCが豊富で、ミトコンドリアの機能は加齢とともに低下しないことから、ADSCはミトコンドリアの優れた供給源であることが示唆されています^13,14。本プロトコールでは、マウス脂肪由来間葉系幹細胞のミトコンドリアを老化したマウス卵子に移植し、卵子の品質を向上させる方法を紹介します。これは、ヒトADSC自家ミトコンドリア移植技術に有用なモデルです。

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プロトコル

記載されているすべての動物実験は、東呉大学第三附属病院の動物研究倫理委員会によって承認されました。すべての事業は、適切な動物の世話と使用機関および国のガイドラインに従っています。このプロトコールで使用されるすべての材料、器具、および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 老化マウス脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の単離と評価

1. 老化したマウス(生後10ヶ月、平均3匹)をペントバルビタールナトリウム麻酔下で子宮頸部脱臼によって犠牲にし、脂肪組織を分離する前に75%アルコールに5分間浸します。
   注:75%アルコールに5分間浸漬すると、初代細胞の汚染を効果的に減らすことができます。
2. 両側鼠径部の皮膚に2cmの切開を行い、皮下脂肪を露出させ、ピンセットを使用して皮下脂肪を分離します。滅菌した眼科用ハサミを使用してマウスから両側の鼠径部脂肪を採取します(皮下組織を切断することは避けてください)。脂肪組織を氷上の15 mLの滅菌遠心チューブに入れ、すぐに細胞培養ラボに輸送します。
3. 脂肪組織を6ウェルプレートに移し、100 U / mLのペニシリンとストレプトマイシンを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回すすぎます。.脂肪組織の下の血管、脂肪筋膜、結合組織を切除し、0.5cm×0.5cm×0.5cmに切ります。
   注:脂肪幹細胞を単離する場合、血管内皮細胞が汚染されることがよくあります。脂肪組織から血管を切除することで、血管内皮細胞の汚染を減らすことができます。
4. 細断した脂肪組織を同量のI型コラゲナーゼ溶液(I型コラゲナーゼの最終濃度0.1%)に移し、37°Cで30分間消化します。
5. 等量の完全培地(10%ウシ胎児血清を含むDMEM F-12培地)を添加してI型コラゲナーゼを中和し、600 × g で10分間遠心分離し、上清と脂肪組織を廃棄します。
6. 細胞ペレットを完全な培養培地に再懸濁します。未消化の組織を40 μmのセルストレーナーで濾過して除去し、600 × g で5分間遠心分離します。
7. 細胞懸濁液を5 mLの完全培地で再懸濁し、1 mLピペットを使用してピペットを静かに上下させて単一細胞懸濁液を形成します。細胞懸濁液を顕微鏡で確認し、血球計算盤にアリコートを載せて、凝集体がなく、単一細胞しかないことを確認します。シングルセル懸濁液を25 cm² 細胞培養フラスコに加え、5% CO₂ インキュベーターで37°Cで培養します。
8. 48時間後に培地を交換します。2〜3日ごとに培地を交換し続けます。
9. 7〜10日後、細胞のコンフルエント度が80%〜90%に達したら、細胞継代のために細胞を剥離します。完全な培地を取り出し、2 mLのPBSで細胞を洗浄します。次に、2 mLの0.05%トリプシン/EDTAを加えて、細胞解離^15,16を行います。
10. 脂肪形成誘導培地を14日間添加して、ADSCの脂肪酸への分化を誘導します。2%ゼラチンコーティングされた24ウェルプレートにメッキしたADSCに骨形成誘導培地を28日間追加して、骨芽細胞への分化を誘導します。神経分化のためには、ADSCを神経誘導培地で培養し、次いで免疫蛍光法を用いてニューロン特異的エノラーゼおよびニューロフィラメントメディエーターポリペプチドを検出する¹⁵。
    1. 細胞を4%パラホルムアルデヒドに室温で30分間固定した後、0.5% Triton X-100をPBS溶液で15分間透過処理します。
    2. PBS中の3% BSAでブロッキングした後、ブロッキング溶液で4°Cで一晩希釈した一次抗体( 材料表を参照)で細胞をインキュベートします。
    3. 細胞を二次抗体で45分間インキュベートした後、DAPIで10分間染色します。次に、蛍光顕微鏡で細胞を検査します。
11. 0.05% トリプシン/EDTA を使用してシングルセル ADSC 懸濁液を回収し、室温で 600 × g で 5 分間遠心分離し、PBS に再懸濁して細胞密度を 1 × 10⁶/mL に調整します。細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブ(100 μL/チューブ)に分注し、FITC標識ウサギ抗マウスCD29、CD90、CD34、およびHLA-DRモノクローナル抗体を抗体濃度0.5 μg/mLで添加します。対照群を同量のウサギIgG FITCで処理し、氷上で30分間インキュベートし、PBSですすいで非標識抗体を除去します。フローサイトメトリーによるADSC表面マーカーの検出¹³.

2. 脂肪幹細胞からのミトコンドリアの単離

注:すべてのミトコンドリア単離操作は氷上で実行する必要があります。

1. ADSCが90%密度に成長したら、2mLの0.05%トリプシン/ EDTAで細胞を消化し、600 × g で5分間遠心分離し、細胞を収集してカウントし、抽出ごとに10×⁷ 個の細胞を取ります。
2. 2 mLのミトコンドリア抽出バッファー(バッファー調製用:10 mLの0.1 M Tris-MOPS、1 mLの0.1 M EGTA/Tris、および20 mLの1 Mスクロース;蒸留水で容量を100 mLにし、pHを7.4に調整)に細胞を再懸濁します。2 mLの滅菌PBSで洗浄した後、1xプロテアーゼ阻害剤カクテルで その後、氷上で5分間インキュベートします。
3. ガラスホモジナイザー(2.0mL)で細胞を20倍〜30倍にホモジナイズし、トリパンブルー染色によりホモジナイズの度合いを確認します。
   注:染色された細胞の割合は~80%である必要があります。過度の均質化は、ミトコンドリアの構造を損傷します。
4. 細胞ホモジネートを600 × g で15分間遠心分離し、上清を新しい予冷済みの1.5 mL微量遠心チューブに取り込み、操作を1回繰り返します。
5. 上清を7,500 × g で15分間遠心分離し、上清を捨てます。ミトコンドリア沈殿物を洗浄し、~100 μL の予冷済みミトコンドリア注入バッファー (225 mM マンニトール、75 mM スクロース、10 mM KCl、10 mM Tris-HCl、5 mM KH₂PO₄、pH 7.2) を 1-5 mg/mL (総タンパク質濃度) で添加して再懸濁します。ミトコンドリア懸濁液を氷上で輸送します。
6. 単離されたミトコンドリアの機能と純度を、JC-1フローサイトメトリー解析とウェスタンブロット(VDAC1、β-アクチン、およびラミンB)¹³により解析します。
   1. 単離したミトコンドリアを、ジメチルスルホキシド(DMSO)、JC-1染色、および30分間シアン化カルボニル3-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)前処理で染色したJC-1の3つのグループに分けます。
   2. 7,500 × gで遠心分離した後、上清を捨て、バッファーを懸濁します。
   3. フローサイトメトリーで捕捉したJC-1モノマー(FITCチャネル)と凝集体(PEチャネル)の蛍光強度を捕捉します。PEチャネルとFITCチャネルの平均蛍光強度の比率を測定することにより、単離されたミトコンドリア膜電位を評価します。
      注意: 上記の手順は暗闇で実行します。

3.卵巣の過剰刺激

1. 生後 10 か月の雌 C57BL/6 マウスに、超排卵のために 10 IU の妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン (PMSG) を腹腔内に注射します。48時間後、10IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を腹腔内に注射します。.
2. hCGの注射後13時間で、顕微鏡のピンセットで腫れた卵管を引き裂きます。腫れた卵管から卵丘複合体を放出します。卵丘細胞をM2培地にヒアルロニダーゼ(0.3 mg/mL)と共に37°Cで溶解します。
   注:溶解時間は5分未満です。卵丘複合体がヒアルロニダーゼに曝露される時間は最小限にしてください。長時間の曝露は卵母細胞の発達能力を損なう可能性があるためです。

4. ミトコンドリア移植と顕微授精

1. 尾のない精子をミトコンドリア液に入れます。尾のない精子は超音波¹⁷を用いて切断して得る。尾のない精子をミトコンドリア液に入れ、ミトコンドリア液50μL中に100個の精子が存在するようにします。
   注:ミトコンドリア懸濁液はわずかに粘性があり、 in vitroで安定していないため、30分以内に注射を完了し、目詰まりした場合はすぐにマイクロインジェクション針を交換してください。マイクロインジェクション針の最適な内径は5μmです。
2. Mehlmann と Kline^10,18 で説明されているように、平本のプロトコルに従って、倒立顕微鏡 (200x; 材料の表を参照) の下でマイクロインジェクターを使用して、30 分以内に ~2 pL のミトコンドリア呼吸緩衝液または精子を含むミトコンドリア懸濁液を卵母細胞に注入します。
   注:注入されたミトコンドリア懸濁液は、卵子の総量の1%〜3%を占めます。細胞質内のミトコンドリア懸濁液の量(1%-3%)を制御して、注射の一貫性を確保します。
3. 注入後、受精卵子をM2培地に15分間平衡化させ、生き残った受精卵をM16培地に移します。
4. 第2極体¹⁹の滑らかな形態、前核形成、および放出を観察することにより、生存する受精卵を調べます。4日間、毎日午前09:00と午後06:00に胚を観察し、写真を撮り、数えます。最後に、胚盤胞を採取して凍結し、-80°Cの冷蔵庫に保管して、ATPおよびmtDNAのコピー数を決定し、ミトコンドリア移植の数と改善を評価します。
   1. 1 ×^{10 7}、1 × 10⁶、1 × 10⁵、1 × 10⁴、1 × 10³、1 × 10²、および1 × 10¹のコピー数によるミトコンドリアのコピー数決定のための標準プラスミド(先述のとおり、絶対定量用プラスミド¹³)を調製する。胚を滅菌チューブに移し、20 μLのライセートバッファーを加えてミトコンドリアDNAを遊離させます。次に、ライセート中のプロテアーゼを55°Cで20分間、95°Cで10分間不活性化します。
   2. 次のセットアップを使用して、蛍光定量PCRによるmtDNAコピー数を決定します:5 μLのPCRミックス、0.5 μLのB6プライマーフォワード、0.5 μLのB6 primer-rev、2 μLの熱分解生成物、および2 μLのddH₂O。ステージ2、95°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで30秒。サイクルを40回繰り返します。

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結果

このプロトコルでは、マウス脂肪からADSCを単離し、特性評価しました(図1)。単離されたミトコンドリアを得るためには、ガラスホモジナイザーを用いて細胞膜を破壊する必要があります。(図 2A)。マイクロインジェクションチューブが詰まらないように、大きな塊のない均一なミトコンドリア画分を得ることが重要です。...

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ディスカッション

卵子には、体内のどの種類の細胞よりも多くのミトコンドリアが含まれており、1~5 × 10⁵ mtDNAのコピー数があります。ミトコンドリアは卵子の成熟、受精、および胚発生に不可欠であるため、ミトコンドリアの機能障害は卵子の質の低下につながる可能性があります。ミトコンドリアの量と質の低下は、生理的老化と密接に関連しています。このプロトコール...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test