线粒体从小鼠脂肪来源的间充质干细胞转移到老年小鼠卵母细胞中

摘要

在这里，我们描述了从小鼠脂肪来源的间充质干细胞中分离线粒体，然后将线粒体转移到老年小鼠卵母细胞中以提高卵母细胞的质量。

摘要

由于与年龄相关的卵母细胞数量和质量的下降，35岁以上女性的生育能力急剧下降。维持卵母细胞质量的分子机制尚不清楚，因此目前难以提高 35 岁以上女性的出生率。卵母细胞含有比体内任何类型的细胞都多的线粒体，任何线粒体功能障碍都会导致卵母细胞质量下降。在 1990 年代，卵母细胞细胞质移植在人类生殖方面取得了巨大成功，但伴随着伦理争议。自体线粒体移植有望成为提高因年龄增长而下降的卵母细胞质量的有用技术。在本研究中，我们使用来自老年小鼠的脂肪来源干细胞作为线粒体供体，以提高老年小鼠卵母细胞的质量。自体线粒体转移技术的进一步发展将为老年妇女不孕症提供一种新的有效治疗方法。

引言

影响女性生育能力的重要因素之一是卵母细胞衰老;卵母细胞质量下降是老年妇女不孕的主要原因。然而，卵母细胞衰老的主要原因和调节卵母细胞质量的分子机制仍不清楚。先前的研究表明，线粒体的数量和质量都与卵母细胞的质量控制和胚胎发育有关 ^1,2,3。线粒体数量和质量的下降与衰老密切相关³。

已经进行了许多尝试来改善老年卵母细胞中线粒体的功能，包括线粒体的营养补充和线粒体转移。众所周知的有效线粒体营养补充剂包括辅酶 Q10 （CoQ10）、α-硫辛酸 （α-LA） 和白藜芦醇 （RSV）⁴。研究表明，补充辅酶 Q10 不仅可以改善与年龄相关的卵母细胞数量和质量下降，还可以促进卵母细胞的正常发育和排卵⁵。α-LA 可减缓与衰老相关的卵母细胞质量下降以及多囊卵巢综合征 （PCOS） 患者的代谢表型^6,7。白藜芦醇可以减少衰老小鼠中纺锤体异常和染色体排列不当增加的卵母细胞数量，同时以剂量依赖性方式影响胚胎发育⁸。然而，由于线粒体营养补充剂的临床效果尚未达到预期水平，因此需要探索其他有效的治疗方法。

线粒体转移的第一次尝试是在 1997 年进行的。将年轻供体卵母细胞细胞质转移到老年受体卵母细胞中提高了老年患者的卵母细胞质量，他们成功生下了健康婴儿⁹，这就是使用该技术的基本原理。然而，由于两个主要原因——遗传异质性问题和供体线粒体移植引起的调控问题，同种异体卵母细胞细胞质转移不能应用于临床实践。先前的一项研究表明，自体细胞线粒体移植可以提高老年小鼠的卵母细胞质量、胚胎发育和生育能力¹⁰，这没有伦理问题或遗传异质性问题，解决了供体卵母细胞细胞质转移到受体卵母细胞引起的一些问题^10,11。

同时，自体细胞线粒体转移在改善卵母细胞质量方面优于先前的线粒体营养补充剂¹¹。因此，自体细胞线粒体移植是该技术临床应用的合适选择¹²。脂肪来源的干细胞 （ADSC） 可以通过微创技术获得，易于分离和培养，可以成为再生医学的理想“种子”细胞。线粒体富含 ADSC，线粒体的功能不会随着年龄的增长而下降，这表明 ADSCs 是线粒体的极好来源^13,14。在该方案中，我们介绍了一种将小鼠脂肪来源的间充质干细胞的线粒体转移到老年小鼠卵母细胞中以提高卵母细胞质量的方法。这是人类 ADSC 自体线粒体转移技术的有用模型。

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研究方案

所描述的所有动物实验均已获得苏州大学第三附属医院动物研究伦理委员会的批准。所有作均遵循适当的动物护理和使用机构和国家指南。有关本协议中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 老年小鼠脂肪来源的间充质干细胞 （ADSC） 的分离和表征

1. 在戊巴比妥钠麻醉下通过颈椎脱位处死老年小鼠 （10 个月大，平均 3 只），并在脂肪组织分离前将它们浸泡在 75% 酒精中 5 分钟。
   注意：在 75% 酒精中浸泡 5 分钟可有效减少原代细胞的污染。
2. 在双侧腹股沟的皮肤上做一个 2 cm 的切口，露出皮下脂肪，用镊子隔离皮下脂肪。使用消毒的眼科剪刀从小鼠身上收集双侧腹股沟脂肪（避免切割皮下组织）。将脂肪组织放入冰上的 15 mL 无菌离心管中，并立即将其运送到细胞培养实验室。
3. 将脂肪组织转移到 6 孔板中，用含有 100 U/mL 青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗 3 次。去除脂肪组织下方的血管、脂肪筋膜和结缔组织，并将它们切成 ~0.5 厘米 x 0.5 厘米 x 0.5 厘米的小块。
   注意：分离脂肪干细胞时，血管内皮细胞通常会受到污染。从脂肪组织中去除血管可以减少血管内皮细胞污染。
4. 将切碎的脂肪组织转移到相同体积的I型胶原酶溶液（I型胶原酶的最终浓度为0.1%）中，并在37°C下消化30分钟。
5. 加入等体积的完全培养基（含有 10% 胎牛血清的 DMEM F-12 培养基）以中和 I 型胶原酶，以 600 × g 离心 10 分钟，弃去上清液和脂肪组织。
6. 将细胞沉淀重悬于完全培养基中。通过 40 μm 细胞过滤器过滤去除未消化的组织，然后以 600 × g 离心 5 分钟。
7. 用 5 mL 完全培养基重悬细胞悬液，并使用 1 mL 移液器轻轻上下移液以形成单细胞悬液。将等分试样放在血细胞计数器上，在显微镜下检查细胞悬液，以确认只有单个细胞，没有任何聚集体。将单细胞悬液加入 25 cm² 细胞培养瓶中，并在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中培养。
8. 48 小时后更换培养基。继续每 2-3 天更换一次培养基。
9. 7-10 天后，当细胞汇合度达到 80%-90% 时，分离细胞进行细胞传代。去除完全培养基，用 2 mL PBS 洗涤细胞。然后，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 进行细胞解离^15,16。
10. 添加成脂诱导培养基 14 天以诱导 ADSCs 分化为 adipoctyes。将成骨诱导培养基添加到铺在 2% 明胶包被的 24 孔板上的 ADSCs 中 28 天，以诱导它们分化为成骨细胞。对于神经分化，用神经诱导培养基培养 ADSC，然后使用免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶和神经丝介质多肽¹⁵。
    1. 在室温下将细胞在 4% 多聚甲醛中固定 30 分钟，然后用 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液透化 15 分钟。
    2. 用 PBS 中的 3% BSA 封闭后，将细胞与在 4 °C 封闭溶液中稀释的一抗（参见 材料表）孵育过夜。
    3. 将细胞与二抗孵育 45 分钟，然后用 DAPI 染色 10 分钟。然后，用荧光显微镜检查细胞。
11. 使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 收集单细胞 ADSC 悬液，在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，然后重悬于 PBS 中以将细胞密度调节至 1 × 10⁶/mL。将细胞悬液分装到 1.5 mL 微量离心管（100 μL/管）中，并加入 FITC 标记的兔抗小鼠 CD29、CD90、CD34 和 HLA-DR 单克隆抗体，抗体浓度为 0.5 μg/mL。用相同体积的兔 IgG FITC 处理对照组，在冰上孵育 30 分钟，然后用 PBS 冲洗以去除未偶联的抗体。通过流式细胞术检测 ADSC 表面标志物¹³。

2. 从脂肪干细胞中分离线粒体

注意：所有线粒体分离作都必须在冰上进行。

1. 当 ADSCs 生长到 90% 密度时，用 2 mL 的 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 消化细胞，以 600 × g 离心 5 分钟，收集并计数细胞，每次提取取 1 × 10⁷ 个细胞。
2. 用 2 mL 无菌 PBS 洗涤后，用 1x 蛋白酶抑制剂混合物将细胞重悬于 2 mL 线粒体提取缓冲液中（用于缓冲液制备：10 mL 0.1 M Tris-MOPS、1 mL 0.1 M EGTA/Tris 和 20 mL 1 M 蔗糖;用蒸馏水将体积调至 100 mL，并将 pH 值调节至 7.4），用 2 mL 无菌 PBS 洗涤后，用 1x 蛋白酶抑制剂混合物， 然后在冰上孵育 5 分钟。
3. 用玻璃匀浆器 （2.0 mL） 将细胞匀浆 20 倍至 30 倍，并通过台盼蓝染色检查匀浆程度。
   注意：染色细胞的比例应为 ~80%。过度均质化会破坏线粒体的结构。
4. 将细胞匀浆以 600 × g 离心 15 分钟，将上清液放入新的预冷 1.5 mL 微量离心管中，重复一次作。
5. 将上清液以 7,500 × g 离心 15 分钟，然后弃去上清液。洗涤线粒体沉淀物，并通过添加 ~100 μL 预冷的线粒体注射缓冲液（225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、10 mM KCl、10 mM Tris-HCl 和 5 mM KH₂PO_4，pH 7.2）重新悬浮，浓度为 1-5 mg/mL（总蛋白浓度）。将线粒体悬浮液在冰上运输。
6. 通过 JC-1 流式细胞术分析和 Western blot（VDAC1、β-肌动蛋白和 Lamin B）¹³ 分析分离的线粒体的功能和纯度。
   1. 将分离的线粒体分为三组：二甲基亚砜 （DMSO）、JC-1 染色和 JC-1 用 30 分钟羰基氰化物 3-氯苯腙 （CCCP） 预处理染色。
   2. 以 7,500 × g 离心后，弃去上清液并悬浮缓冲液。
   3. 捕获通过流式细胞术捕获的 JC-1 单体（FITC 通道）和聚集体（PE 通道）的荧光强度。通过测量 PE 通道与 FITC 通道的平均荧光强度的比率来评估分离的线粒体膜电位。
      注意：在黑暗中执行上述步骤。

3. 卵巢超级刺激

1. 用 10 IU 怀孕母马血清促性腺激素 （PMSG） 腹膜内注射 10 个月大的雌性 C57BL/6 小鼠进行超排卵。48 小时后，腹膜内注射 10 IU 人绒毛膜促性腺激素 （hCG）。
2. 注射 hCG 后 13 小时，用显微镜镊子撕裂肿胀的输卵管。从肿胀的输卵管中释放卵丘复合体。在 37 °C 下将卵丘细胞溶解在含有透明质酸酶 （0.3 mg/mL） 的 M2 培养基中。
   注：溶解时间小于 5 分钟。尽量减少卵丘复合体暴露于透明质酸酶的时间，因为长时间暴露会损害卵母细胞发育潜力。

4. 线粒体转移与 ICSI 一起

1. 将没有尾巴的精子放入线粒体液中。通过使用超声波切割获得没有尾巴的精子¹⁷.将没有尾巴的精子放入线粒体液中，使 100 μL 线粒体液中有 50 个精子。
   注意：由于线粒体悬浮液略有粘性， 在体外不稳定，请在 30 分钟内完成注射，并在显微注射针堵塞时立即更换显微注射针。显微注射针的最佳内径为 5 μm。
2. 根据 Mehlmann 和 Kline^10,18 描述的 Hiramoto 方案，在 30 分钟内使用显微注射器将 ~2 pL 线粒体呼吸缓冲液或带有精子的线粒体悬浮液注射到卵母细胞中（200x;参见材料表）。
   注意：注射的线粒体悬浮液占卵母细胞总体积的 1%-3%。控制细胞质中线粒体悬液的体积 （1%-3%），以确保注射的一致性。
3. 注射后，将受精卵母细胞置于 M2 培养基中平衡 15 分钟，然后将存活的受精卵转移到 M16 培养基中。
4. 通过观察第二极体的光滑形态、原核形成和释放来检查幸存的受精卵¹⁹。每天上午 09：00 和下午 06：00 观察、拍照和计数胚胎，持续 4 天。最后，收集并冷冻囊胚并将其储存在 -80 °C 冰箱中用于 ATP 和 mtDNA 拷贝数测定，以评估线粒体移植的数量和改善情况。
   1. 根据拷贝数 1 × 10⁷、1 × 10⁶、1 × 10⁵、1 × 10⁴、1 × 10³、1 × 10² 和 1 × 10 1 制备标准质粒（用于绝对定量的质粒，如前所述¹³），用于线粒体拷贝数^测定。将胚胎转移到灭菌管中，加入 20 μL 裂解物缓冲液以释放线粒体 DNA。然后，在 55 °C 下灭活裂解物中的蛋白酶 20 分钟，在 95 °C 下灭活 10 分钟。
   2. 使用以下设置通过荧光定量 PCR 确定 mtDNA 拷贝数：5 μL PCR 混合物、0.5 μL B6 引物转发、0.5 μL B6 引物修订版、2 μL 热解产物和 2 μL ddH₂O。遵循 PCR 条件：阶段 1,95 °C 3 分钟;阶段 2,95 °C 持续 30 s，58 °C 持续 30 s，72 °C 持续 30 s;重复循环 40 次。

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结果

在该协议中，我们从小鼠脂肪中分离并表征了 ADSC（图 1）。为了获得分离的线粒体，必须使用玻璃匀浆器破坏细胞膜。（图 2A）。获得均匀的线粒体部分而没有大团块是很重要的，这样显微注射管就不会被堵塞。首先，必须使用 200 μL 和 10 μL 移液器吸头轻轻重悬匀浆;最后，必须使用 29 G 针头缓慢吸出两到三次，以获得可用?...

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讨论

卵母细胞含有比体内任何类型的细胞都多的线粒体，具有 ~1-5 × 10⁵ 个 mtDNA 拷贝数。线粒体对于卵母细胞成熟、受精和胚胎发育至关重要，因此，任何线粒体功能障碍都会导致卵母细胞质量下降。线粒体数量和质量的下降与生理衰老密切相关。在该方案中，引入了一种从老年小鼠的 ADSCs 中分离线粒体并转移到老年小鼠卵母细胞的简单方法，以试图提高老年卵母细?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test