Transfert mitochondrial de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris dans des ovocytes de souris âgés

Résumé

Ici, nous décrivons l’isolement des mitochondries à partir de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris, puis nous transférons les mitochondries dans des ovocytes de souris âgés pour améliorer la qualité des ovocytes.

Résumé

En raison de la baisse de la quantité et de la qualité des ovocytes liée à l’âge, la fertilité des femmes de plus de 35 ans a fortement diminué. Les mécanismes moléculaires qui maintiennent la qualité des ovocytes restent flous, il est donc difficile d’augmenter le taux de natalité des femmes de plus de 35 ans à l’heure actuelle. Les ovocytes contiennent plus de mitochondries que n’importe quel type de cellule dans le corps, et tout dysfonctionnement mitochondrial peut entraîner une réduction de la qualité des ovocytes. Dans les années 1990, le transfert cytoplasmique d’ovocytes a connu un grand succès dans la reproduction humaine, mais s’est accompagné de controverses éthiques. La transplantation mitochondriale autologue devrait être une technique utile pour augmenter la qualité des ovocytes qui ont diminué en raison de l’âge. Dans la présente étude, nous avons utilisé des cellules souches dérivées du tissu adipeux de souris âgées comme donneur de mitochondries pour augmenter la qualité des ovocytes de souris âgées. La poursuite du développement de la technologie de transfert mitochondrial autologue fournira un traitement nouveau et efficace de l’infertilité chez les femmes âgées.

Introduction

L’un des facteurs importants qui affectent la fertilité féminine est le vieillissement des ovocytes ; La baisse de la qualité des ovocytes est la principale cause d’infertilité chez les femmes âgées. Cependant, la principale cause du vieillissement des ovocytes et le mécanisme moléculaire qui régule la qualité des ovocytes ne sont pas encore clairs. Des études antérieures ont indiqué que le nombre et la qualité des mitochondries sont impliqués dans le contrôle de la qualité des ovocytes et^{le développement} embryonnaire1,2,3. La diminution de la quantité et de la qualité des mitochondries est étroitement liée au vieillissement³.

De nombreuses tentatives ont été faites pour améliorer la fonction des mitochondries dans les ovocytes âgés, y compris la supplémentation nutritionnelle des mitochondries et le transfert de mitochondries. Les suppléments nutritionnels bien connus et efficaces des mitochondries comprennent la coenzyme Q10 (CoQ10), l’acide alpha-lipoïque (α-LA) et le resvératrol (RSV)⁴. Des études ont montré que la supplémentation en CoQ10 peut non seulement améliorer le déclin de la quantité et de la qualité des ovocytes lié à l’âge, mais aussi favoriser le développement normal et l’ovulation des ovocytes⁵. α-LA ralentit le déclin de la qualité des ovocytes lié au vieillissement et au phénotype métabolique des patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK)^6,7. Le resvératrol peut réduire le nombre d’ovocytes avec des fuseaux anormaux et un alignement chromosomique incorrect augmenté chez les souris vieillissantes, tout en affectant le développement embryonnaire de manière dose-dépendante⁸. Cependant, comme l’effet clinique des suppléments nutritionnels des mitochondries n’a pas atteint les niveaux attendus, d’autres traitements efficaces doivent être explorés.

La première tentative de transfert de mitochondries a été réalisée en 1997. Le transfert du cytoplasme de l’ovocyte d’une jeune donneuse dans des ovocytes receveurs âgés a amélioré la qualité des ovocytes des patientes âgées, qui ont donné naissance avec succès à des nourrissons en bonne santé⁹, ce qui était la raison d’être de l’utilisation de cette technique. Cependant, le transfert cytoplasmique allogénique d’ovocytes ne peut pas être appliqué à la pratique clinique pour deux raisons principales : le problème de l’hétérogénéité génétique et les problèmes de régulation causés par la transplantation de mitochondries de donneur. Une étude antérieure a montré que la transplantation mitochondriale autologue pouvait améliorer la qualité des ovocytes, le développement embryonnaire et la fertilité des souris âgées¹⁰, qui ne présentaient aucun problème éthique ou problème d’hétérogénéité génétique et résolvaient certains problèmes causés par le transfert du cytoplasme de l’ovocyte du donneur dans les ovocytes du receveur^10,11.

Pendant ce temps, le transfert mitochondrial de cellules autologues était supérieur à l’effet des suppléments nutritionnels précédents de mitochondries sur l’amélioration de la qualité des ovocytes¹¹. Par conséquent, la transplantation mitochondriale de cellules analogues autologues est le choix approprié pour l’application clinique de cette technologie¹². Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC) peuvent être obtenues par une technologie mini-invasive, sont faciles à isoler et à cultiver, et peuvent être une cellule « germe » idéale pour la médecine régénérative. Les mitochondries sont riches en ADSC, et la fonction des mitochondries ne diminue pas avec l’âge, ce qui suggère que les ADSC sont une excellente source de mitochondries^13,14. Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour transférer les mitochondries de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux de souris dans des ovocytes de souris âgés afin d’améliorer la qualité des ovocytes. Il s’agit d’un modèle utile pour la technologie de transfert mitochondrial autologue ADSC humain.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale du troisième hôpital affilié de l’Université Soochow. Toutes les opérations respectent les directives appropriées de l’agence et de l’utilisation des animaux et les directives nationales. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole.

1. Isolement et caractérisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (ADSC) de souris âgées

1. Sacrifiez les souris âgées (âgées de 10 mois, soit une moyenne de trois) par luxation cervicale sous anesthésie sodium pentobarbital et faites-les tremper dans de l’alcool à 75 % pendant 5 minutes avant d’isoler le tissu adipeux.
   REMARQUE : Le trempage dans de l’alcool à 75 % pendant 5 minutes peut réduire efficacement la contamination des cellules primaires.
2. Faites une incision de 2 cm dans la peau sur l’inguinal bilatéral, exposez la graisse sous-cutanée et utilisez une pince à épiler pour isoler la graisse sous-cutanée. Prélever la graisse inguinale bilatérale des souris à l’aide de ciseaux ophtalmiques stérilisés (éviter de couper le tissu sous-cutané). Placez le tissu adipeux dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml sur de la glace et transportez-le immédiatement au laboratoire de culture cellulaire.
3. Transférez le tissu adipeux dans une plaque à 6 puits, rincez-le 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine. Retirez les vaisseaux sanguins, le fascia adipeux et le tissu conjonctif sous le tissu adipeux et coupez-les en morceaux de ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
   REMARQUE : Lors de l’isolement des cellules souches adipeuses, il y a souvent une contamination des cellules endothéliales vasculaires. L’ablation des vaisseaux sanguins du tissu adipeux peut réduire la contamination des cellules endothéliales vasculaires.
4. Transférez le tissu adipeux déchiqueté dans le même volume de solution de collagénase de type I (concentration finale de 0,1 % de collagénase de type I) et digérez à 37 °C pendant 30 min.
5. Ajouter un volume égal de milieu de culture complet (milieu DMEM F-12 contenant 10 % de sérum de veau fœtal) pour neutraliser la collagénase de type I, centrifuger à 600 × g pendant 10 min, et jeter le surnageant et le tissu adipeux.
6. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de culture complet. Retirer le tissu non digéré par filtration à travers une crépine cellulaire de 40 μm, puis centrifuger à 600 × g pendant 5 min.
7. Remettre la suspension cellulaire avec 5 ml du milieu de culture complet et utiliser une pipette de 1 ml pour pipeter doucement de haut en bas pour former une suspension unicellulaire. Vérifiez la suspension cellulaire au microscope en plaçant une aliquote sur un hémocytomètre pour confirmer qu’il n’y a que des cellules uniques, sans aucun agrégat. Ajouter la suspension unicellulaire dans un ballon de culture de²⁵ cm et cultiver dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
8. Changez le milieu de culture 48 h plus tard. Continuez à changer de milieu de culture tous les 2-3 jours.
9. Après 7 à 10 jours, détachez les cellules pour le passage cellulaire lorsque leur confluence atteint 80 % à 90 %. Retirer le milieu de culture complet et laver les cellules avec 2 mL de PBS. Ensuite, ajoutez 2 mL de trypsine/EDTA à 0,05 % pour effectuer la dissociation cellulaire^15,16.
10. Ajouter un milieu d’induction adipogénique pendant 14 jours pour induire la différenciation des ADSC en adipoctyes. Ajouter un milieu d’induction ostéogénique pendant 28 jours aux ADSC plaqués sur des plaques à 24 puits recouvertes de gélatine à 2 % pour induire leur différenciation en ostéoblastes. Pour la différenciation neurale, cultivez les ADSC avec un milieu d’induction neurale, puis détectez l’énolase spécifique du neurone et le polypeptide médiateur des neurofilaments à l’aide de l’immunofluorescence¹⁵.
    1. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante, suivi d’une perméabilisation avec du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 15 min.
    2. Après le blocage avec 3 % de BSA dans le PBS, incuber les cellules avec des anticorps primaires (voir Tableau des matériaux) dilués dans une solution de blocage à 4 °C pendant la nuit.
    3. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires pendant 45 min, puis les colorer avec du DAPI pendant 10 min. Ensuite, examinez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence.
11. Prélever la suspension ADSC unicellulaire à l’aide de 0,05 % de trypsine/EDTA, centrifuger à 600 × g pendant 5 minutes à température ambiante et remettre en suspension dans du PBS pour ajuster la densité cellulaire à 1 × 10⁶/mL. Aliquote la suspension cellulaire dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL (100 μL/tube) et ajoutez des anticorps monoclonaux anti-souris de lapin CD29, CD90, CD34 et HLA-DR marqués FITC, avec une concentration d’anticorps de 0,5 μg/mL. Traitez le groupe témoin avec le même volume d’IgG FITC de lapin, incubez sur de la glace pendant 30 minutes et rincez avec du PBS pour éliminer l’anticorps non conjugué. Détection des marqueurs de surface ADSC par cytométrie en flux¹³.

2. Isolement des mitochondries à partir de cellules souches adipeuses

REMARQUE : Toutes les opérations d’isolement des mitochondries doivent être effectuées sur de la glace.

1. Lorsque les ADSC atteignent une densité de 90 %, digérez les cellules avec 2 ml de trypsine à 0,05 %, centrifugez à 600 × g pendant 5 min, collectez et comptez les cellules, et prélevez 1 × 10⁷ cellules pour chaque extraction.
2. Remettre les cellules en suspension dans 2 mL de tampon d’extraction des mitochondries (pour la préparation du tampon : 10 mL de 0,1 M Tris-MOPS, 1 mL de 0,1 M d’EGTA/Tris et 20 mL de 1 M de saccharose ; porter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée et ajuster le pH à 7,4) avec 1x cocktail inhibiteur de protéase après lavage avec 2 mL de PBS stérile, puis incuber sur glace pendant 5 min.
3. Homogénéiser les cellules 20x-30x avec un homogénéisateur en verre (2,0 mL) et vérifier le degré d’homogénéisation par coloration au bleu de trypan.
   REMARQUE : La proportion de cellules colorées doit être de ~80 %. Une homogénéisation excessive endommagera la structure des mitochondries.
4. Centrifuger l’homogénat de cellule à 600 × g pendant 15 min, introduire le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi de 1,5 mL et répéter l’opération une fois.
5. Centrifugez le surnageant à 7 500 × g pendant 15 min et jetez-le. Lavez le précipité mitochondrial et mettez-le en suspension en ajoutant ~100 μL de tampon d’injection mitochondriale prérefroidi (225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose, 10 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl et 5 mM de KH₂PO₄, pH 7,2), à une concentration de 1 à 5 mg/mL (concentration totale en protéines). Transportez la suspension mitochondriale sur de la glace.
6. Analyser la fonction et la pureté des mitochondries isolées par cytométrie en flux JC-1 et Western blot (VDAC1, β-actine et Lamin B)¹³.
   1. Divisez les mitochondries isolées en trois groupes : le diméthylsulfoxyde (DMSO), coloré au JC-1 et le JC-1 coloré au 3-chlorophénylhydrazone (CCCP) au cyanure de carbonyle (30 min).
   2. Après centrifugation à 7 500 × g, jeter le surnageant et suspendre le tampon.
   3. Capturer l’intensité de fluorescence des monomères JC-1 (canal FITC) et des agrégats (canal PE) qui ont été capturés par cytométrie en flux. Évaluez les potentiels de membrane mitochondriale isolés en mesurant les rapports de l’intensité moyenne de fluorescence du canal PE par rapport au canal FITC.
      REMARQUE : Effectuez les étapes ci-dessus dans l’obscurité.

3. Superstimulation ovarienne

1. Injecter par voie intrapéritonéale 10 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG) chez des souris C57BL/6 âgées de 10 mois pour la superovulation. Après 48 h, injecter 10 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) par voie intrapéritonéale.
2. 13 h après l’injection d’hCG, déchirez la trompe de Fallope enflée avec une pince à épiler microscopique. Libérez les complexes de cumulus de la trompe de Fallope enflée. Dissoudre les cellules du cumulus dans un milieu M2 avec de l’hyaluronidase (0,3 mg/mL) à 37 °C.
   REMARQUE : Le temps de dissolution est inférieur à 5 min. Réduire au minimum la durée d’exposition du complexe cumulus à la hyaluronidase, car une exposition prolongée peut nuire au potentiel de développement de l’ovocyte.

4. Transfert mitochondrial avec ICSI

1. Mettez le sperme sans queue dans le liquide mitochondrial. Obtenez des spermatozoïdes sans queue par coupe à l’aide d’ultrasons¹⁷. Placez les spermatozoïdes sans queue dans le liquide mitochondrial, de sorte qu’il y ait 100 spermatozoïdes dans 50 μL du liquide mitochondrial.
   REMARQUE : Comme la suspension mitochondriale est légèrement visqueuse et instable in vitro, terminez l’injection dans les 30 minutes et changez l’aiguille de micro-injection immédiatement lorsqu’elle est bouchée. Le diamètre intérieur optimal de l’aiguille de micro-injection est de 5 μm.
2. Injecter ~2 pL de tampon de respiration mitochondriale ou de suspension mitochondriale avec des spermatozoïdes dans les ovocytes à l’aide d’un micro-injecteur sous microscope inversé (200x ; voir tableau des matériaux) dans les 30 minutes selon le protocole d’Hiramoto tel que décrit par Mehlmann et Kline^10,18.
   REMARQUE : La suspension mitochondriale injectée représente 1 % à 3 % du volume total des ovocytes. Contrôler le volume (1 à 3 %) de la suspension mitochondriale dans le cytoplasme pour assurer la cohérence de l’injection.
3. Après l’injection, placez les ovocytes fécondés dans un milieu M2 pour une équilibrage pendant 15 min, et transférez les ovules fécondés survivants dans un milieu de culture M16.
4. Examinez les œufs fertiles survivants en observant la morphologie lisse, la formation pronucléaire et la libération du deuxième corps polaire¹⁹. Observez, photographiez et comptez les embryons à 09h00 et 18h00 tous les jours pendant 4 jours. Enfin, collectez et congelez les blastocystes et conservez-les dans un réfrigérateur à -80 °C pour la détermination du nombre de copies d’ATP et d’ADNmt afin d’évaluer le nombre et l’amélioration de la transplantation mitochondriale.
   1. Préparez le plasmide standard (plasmide pour la quantification absolue, comme décrit précédemment¹³), pour la détermination du nombre de copies mitochondriales selon le nombre de copies de 1 × 10⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² et 1 × 10¹. Transférez les embryons dans le tube de stérilisation et ajoutez 20 μL de tampon de lysat pour libérer l’ADN mitochondrial. Ensuite, inactivez la protéase dans le lysat à 55 °C pendant 20 min et à 95 °C pendant 10 min.
   2. Déterminez le nombre de copies de l’ADNmt par PCR quantitative par fluorescence à l’aide de la configuration suivante : 5 μL de mélange de PCR, 0,5 μL d’amorce B6 directe, 0,5 μL d’amorce B6 à rotation directe, 2 μL de produit de pyrolyse et 2 μL de ddH₂O. Suivez les conditions de PCR : stade 1, 95 °C pendant 3 min ; stade 2, 95 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; Répétez le cycle 40 fois.

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Résultats

Dans ce protocole, nous avons isolé et caractérisé les ADSC à partir de graisse de souris (Figure 1). Pour obtenir des mitochondries isolées, la membrane cellulaire doit être perturbée à l’aide d’un homogénéisateur en verre. (Figure 2A). Il est important d’obtenir une fraction mitochondriale uniforme sans gros amas afin que le tube de micro-injection ne soit pas bloqué. D’abord, des pointes de pipette de 200 ?...

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Discussion

Les ovocytes contiennent plus de mitochondries que n’importe quel type de cellule dans le corps, avec ~1-5 × 10⁵ numéros de copie d’ADNmt. Les mitochondries sont essentielles à la maturation des ovocytes, à la fécondation et au développement embryonnaire, ainsi, tout dysfonctionnement mitochondrial peut entraîner une diminution de la qualité des ovocytes. La diminution de la quantité et de la qualité mitochondriales est étroitement liée au vieillissement physio...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test