Transferencia mitocondrial de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratón a ovocitos de ratón envejecidos

Resumen

Aquí, describimos el aislamiento de mitocondrias a partir de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratón, y luego transferimos las mitocondrias a ovocitos de ratón envejecidos para mejorar la calidad de los ovocitos.

Resumen

Debido a la disminución de la cantidad y calidad de los ovocitos en función de la edad, la fecundidad de las mujeres mayores de 35 años ha disminuido drásticamente. Los mecanismos moleculares que mantienen la calidad de los ovocitos siguen sin estar claros, por lo que es difícil aumentar la tasa de natalidad de las mujeres mayores de 35 años en la actualidad. Los ovocitos contienen más mitocondrias que cualquier otro tipo de célula del cuerpo, y cualquier disfunción mitocondrial puede provocar una reducción de la calidad de los ovocitos. En la década de 1990, la transferencia citoplasmática de ovocitos tuvo un gran éxito en la reproducción humana, pero estuvo acompañada de controversias éticas. Se espera que el trasplante mitólogo autólogo sea una técnica útil para aumentar la calidad de los ovocitos que han disminuido debido a la edad. En el presente estudio, utilizamos células madre derivadas del tejido adiposo de ratones envejecidos como donantes de mitocondrias para aumentar la calidad de los ovocitos de ratones envejecidos. El desarrollo adicional de la tecnología de transferencia mitocondrial autóloga proporcionará un tratamiento nuevo y eficaz para la infertilidad en mujeres mayores.

Introducción

Uno de los factores importantes que afecta a la fertilidad femenina es el envejecimiento de los ovocitos; La disminución de la calidad de los ovocitos es la principal causa de infertilidad en las mujeres mayores. Sin embargo, la causa principal del envejecimiento de los ovocitos y el mecanismo molecular que regula la calidad de los ovocitos aún no están claros. Estudios previos han indicado que tanto el número como la calidad de las mitocondrias están involucrados en el control de calidad de los ovocitos y en el desarrollo embrionario ^1,2,3. La disminución de la cantidad y calidad de las mitocondrias está estrechamente relacionada con el envejecimiento³.

Se han hecho muchos intentos para mejorar la función de las mitocondrias en los ovocitos envejecidos, incluido el suplemento nutricional de las mitocondrias y la transferencia de mitocondrias. Los suplementos nutricionales de mitocondrias conocidos y eficaces incluyen la coenzima Q10 (CoQ10), el ácido alfa lipoico (α-LA) y el resveratrol (RSV)⁴. Los estudios han demostrado que la suplementación con CoQ10 no solo puede mejorar la disminución de la cantidad y la calidad de los ovocitos relacionada con la edad, sino que también promueve el desarrollo normal y la ovulación de los ovocitos⁵. α-LA ralentiza la disminución de la calidad de los ovocitos relacionada con el envejecimiento y el fenotipo metabólico de las pacientes con síndrome de ovario poliquístico (SOP)^6,7. El resveratrol puede reducir el número de ovocitos con husos anormales y una alineación cromosómica inadecuada en ratones envejecidos, al tiempo que afecta el desarrollo embrionario de manera dosis-dependiente⁸. Sin embargo, dado que el efecto clínico de los suplementos nutricionales de mitocondrias no ha alcanzado los niveles esperados, es necesario explorar otros tratamientos efectivos.

El primer intento de transferencia de mitocondrias se llevó a cabo en 1997. La transferencia de citoplasma de ovocitos de donante joven a ovocitos receptores de edad avanzada mejoró la calidad de los ovocitos de las pacientes ancianas, que dieron a luz con éxito a lactantes sanos⁹, lo que motivó el uso de esta técnica. Sin embargo, la transferencia alogénica de citoplasma de ovocitos no se puede aplicar a la práctica clínica debido a dos razones principales: el problema de la heterogeneidad genética y los problemas regulatorios causados por el trasplante de mitocondrias de donante. Un estudio previo demostró que el trasplante mitocondrial de células autólogas podría mejorar la calidad de los ovocitos, el desarrollo embrionario y la fertilidad de ratones envejecidos¹⁰, lo que no tenía problemas éticos ni de heterogeneidad genética y resolvió algunos problemas causados por la transferencia de citoplasma de ovocitos de donante a ovocitos receptores^10,11.

Mientras tanto, la transferencia mitocondrial de células autólogas fue superior al efecto de los suplementos nutricionales previos de mitocondrias en la mejora de la calidad de los ovocitos¹¹. Por lo tanto, el trasplante mitocondrial de células autólogas es la opción adecuada para la aplicación clínica de esta tecnología¹². Las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) pueden obtenerse mediante tecnología mínimamente invasiva, son fáciles de aislar y cultivar, y pueden ser una célula "semilla" ideal para la medicina regenerativa. Las mitocondrias son ricas en ADSC, y la función de las mitocondrias no disminuye con la edad, lo que sugiere que las ADSC son una excelente fuente de mitocondrias^13,14. En este protocolo, introducimos un método para transferir las mitocondrias de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratón a ovocitos de ratón envejecidos para mejorar la calidad de los ovocitos. Este es un modelo útil para la tecnología de transferencia mitocondrial autóloga ADSC humana.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal del Tercer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow. Todas las operaciones siguen las pautas nacionales y de la agencia de cuidado y uso de animales apropiadas. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (ADSC) de ratón envejecido

1. Sacrificar a los ratones viejos (10 meses de edad, un promedio de tres) por luxación cervical bajo anestesia de pentobarbital sódico y remojarlos en alcohol al 75% durante 5 minutos antes del aislamiento del tejido adiposo.
   NOTA: Remojar en alcohol al 75% durante 5 minutos puede reducir eficazmente la contaminación de las células primarias.
2. Realice una incisión de 2 cm en la piel en la inguinal bilateral, exponga la grasa subcutánea y use pinzas para aislar la grasa subcutánea. Recoja la grasa inguinal bilateral de los ratones con tijeras oftálmicas esterilizadas (evite cortar el tejido subcutáneo). Coloque el tejido adiposo en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL sobre hielo y transpórtelo inmediatamente al laboratorio de cultivo celular.
3. Transfiera el tejido adiposo a una placa de 6 pocillos, enjuáguelo 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 100 U/mL de penicilina y estreptomicina. Retire los vasos sanguíneos, la fascia grasa y el tejido conectivo debajo del tejido adiposo y córtelos en trozos de ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm.
   NOTA: Al aislar células madre adiposas, a menudo hay contaminación de las células endoteliales vasculares. La extirpación de los vasos sanguíneos del tejido adiposo puede reducir la contaminación de las células endoteliales vasculares.
4. Transferir el tejido adiposo triturado al mismo volumen de solución de colagenasa tipo I (0,1% de concentración final de colagenasa tipo I) y digerir a 37 °C durante 30 min.
5. Añadir un volumen igual de medio de cultivo completo (medio DMEM F-12 que contenga un 10% de suero fetal bovino) para neutralizar la colagenasa tipo I, centrifugar a 600 × g durante 10 min, y desechar el sobrenadante y el tejido adiposo.
6. Vuelva a suspender el pellet celular en el medio de cultivo completo. Retire el tejido no digerido por filtración a través de un colador de células de 40 μm y luego centrifugue a 600 × g durante 5 min.
7. Vuelva a suspender la suspensión celular con 5 mL del medio de cultivo completo y use una pipeta de 1 mL para pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para formar una suspensión de una sola célula. Verifique la suspensión celular bajo un microscopio colocando una alícuota en un hemocitómetro para confirmar que solo hay células individuales, sin agregados. Añadir la suspensión unicelular a un matraz de cultivo celular de 25^cm2 y cultivar en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C.
8. Cambiar el medio de cultivo 48 h después. Continúe cambiando el medio de cultivo cada 2-3 días.
9. Después de 7-10 días, separe las células para el paso de células cuando su confluencia alcance el 80%-90%. Retire el medio de cultivo completo y lave las células con 2 mL de PBS. A continuación, añadir 2 mL de tripsina/EDTA al 0,05% para realizar la disociación celular ^15,16.
10. Añadir medio de inducción adipogénico durante 14 días para inducir la diferenciación de las ADSC en adipoctyes. Añadir medio de inducción osteogénico durante 28 días a las ADSCs chapadas en placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina al 2% para inducir su diferenciación en osteoblastos. Para la diferenciación neuronal, cultive las ADSC con medio de inducción neuronal, luego detecte la enolasa específica de la neurona y el polipéptido mediador de neurofilamentos utilizando inmunofluorescencia¹⁵.
    1. Fije las células en paraformaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 min.
    2. Después de bloquear con BSA al 3% en PBS, incubar las células con anticuerpos primarios (ver Tabla de Materiales) diluidos en solución de bloqueo a 4 °C durante la noche.
    3. Incubar las células con anticuerpos secundarios durante 45 min y luego teñirlas con DAPI durante 10 min. Luego, examine las células con un microscopio de fluorescencia.
11. Recoja la suspensión de ADSC de una sola celda con tripsina/EDTA al 0,05%, centrifugue a 600 × g durante 5 min a temperatura ambiente y vuelva a suspender en PBS para ajustar la densidad de la celda a 1 × 10⁶/mL. Aliquotar la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (100 μL/tubo) y añadir anticuerpos monoclonales anti-ratón de conejo CD29, CD90, CD34 y HLA-DR marcados con FITC, con una concentración de anticuerpos de 0,5 μg/mL. Tratar el grupo de control con el mismo volumen de IgG FITC de conejo, incubar en hielo durante 30 minutos y enjuagar con PBS para eliminar el anticuerpo no conjugado. Detección de los marcadores de superficie ADSC mediante citometría de flujo¹³.

2. Aislamiento de mitocondrias a partir de células madre adiposas

NOTA: Todas las operaciones de aislamiento de mitocondrias deben realizarse en hielo.

1. Cuando las ADSC crezcan hasta el 90% de densidad, digiera las células con 2 mL de tripsina/EDTA al 0,05%, centrifugar a 600 × g durante 5 minutos, recoja y cuente las células, y tome 1 × 10⁷ células para cada extracción.
2. Vuelva a suspender las células en 2 mL de tampón de extracción de mitocondrias (para la preparación del tampón: 10 mL de Tris-MOPS 0,1 M, 1 mL de 0,1 M de EGTA/Tris y 20 mL de sacarosa 1 M; llevar el volumen a 100 mL con agua destilada y ajustar el pH a 7,4) con 1x cóctel de inhibidores de la proteasa después del lavado con 2 mL de PBS estéril, y luego incubar en hielo durante 5 min.
3. Homogeneizar las células 20x-30x con un homogeneizador de vidrio (2,0 mL) y comprobar el grado de homogeneización mediante tinción con azul de tripano.
   NOTA: La proporción de células teñidas debe ser de ~80%. La homogeneización excesiva dañará la estructura de las mitocondrias.
4. Centrifugar el homogeneizado celular a 600 × g durante 15 min, llevar el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 1,5 mL y repetir la operación una vez.
5. Centrifugar el sobrenadante a 7.500 × g durante 15 min y desechar el sobrenadante. Lave el precipitado mitocondrial y vuelva a suspenderlo agregando ~ 100 μL de tampón de inyección mitocondrial preenfriado (225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 10 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl y 5 mM de KH₂PO₄, pH 7,2), a una concentración de 1-5 mg/mL (concentración total de proteína). Transporta la suspensión mitocondrial en hielo.
6. Analizar la función y pureza de las mitocondrias aisladas mediante análisis de citometría de flujo JC-1 y Western blot (VDAC1, β-actina y Lamin B)¹³.
   1. Divida las mitocondrias aisladas en tres grupos: dimetilsulfóxido (DMSO), teñido con JC-1 y teñido con JC-1 con pretratamiento de 30 min de cianuro de carbonilo 3-clorofenilhidrazona (CCCP).
   2. Después de centrifugar a 7.500 × g, desechar el sobrenadante y suspender el tampón.
   3. Capture la intensidad de fluorescencia de los monómeros JC-1 (canal FITC) y agregados (canal PE) que se capturaron mediante citometría de flujo. Evaluar los potenciales de membrana mitocondrial aislados midiendo las relaciones entre la intensidad de fluorescencia media del canal PE y el canal FITC.
      NOTA: Realice los pasos anteriores en la oscuridad.

3. Sobreestimulación ovárica

1. Inyecte por vía intraperitoneal a ratones hembra C57BL/6 de 10 meses de edad 10 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) para la superovulación. A las 48 h, inyectar 10 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) por vía intraperitoneal.
2. A las 13 h después de la inyección de hCG, desgarre la trompa de Falopio hinchada con pinzas microscópicas. Libera los complejos de cúmulos de la trompa de Falopio inflamada. Disolver las células del cúmulo en medio M2 con hialuronidasa (0,3 mg/mL) a 37 °C.
   NOTA: El tiempo de disolución es inferior a 5 min. Minimice el tiempo durante el cual el complejo cúmulo está expuesto a la hialuronidasa, ya que la exposición prolongada puede afectar el potencial de desarrollo de los ovocitos.

4. Transferencia mitocondrial junto con ICSI

1. Coloque el esperma sin cola en el líquido mitocondrial. Obtener espermatozoides sin cola mediante corte mediante ultrasonido¹⁷. Coloque los espermatozoides sin cola en el líquido mitocondrial, de modo que haya 100 espermatozoides en 50 μL del líquido mitocondrial.
   NOTA: Como la suspensión mitocondrial es ligeramente viscosa y no es estable in vitro, complete la inyección dentro de los 30 minutos y cambie la aguja de microinyección inmediatamente cuando se obstruya. El diámetro interior óptimo de la aguja de microinyección es de 5 μm.
2. Inyecte ~ 2 pL de tampón de respiración mitocondrial o suspensión mitocondrial con esperma en los ovocitos usando un microinyector bajo un microscopio invertido (200x; ver Tabla de Materiales) dentro de los 30 minutos de acuerdo con el protocolo de Hiramoto según lo descrito por Mehlmann y Kline^10,18.
   NOTA: La suspensión mitocondrial inyectada representa el 1%-3% del volumen total de ovocitos. Controlar el volumen (1%-3%) de la suspensión mitocondrial en el citoplasma para asegurar la consistencia de la inyección.
3. Después de la inyección, coloque los ovocitos fertilizados en un medio M2 para su equilibrio durante 15 minutos y transfiera los óvulos fertilizados sobrevivientes al medio de cultivo M16.
4. Examine los huevos fértiles supervivientes observando la morfología lisa, la formación pronuclear y la liberación del segundo cuerpo polar¹⁹. Observe, fotografíe y cuente los embriones a las 09:00 a.m. y a las 06:00 p.m. todos los días durante 4 días. Finalmente, recoja y congele los blastocistos y guárdelos en un refrigerador de -80 °C para la determinación del número de copias de ATP y ADNmt para evaluar el número y la mejora del trasplante mitocondrial.
   1. Prepare un plásmido estándar (plásmido para cuantificación absoluta, como se describió anteriormente¹³), para la determinación del número de copias mitocondriales de acuerdo con el número de copias de 1 ×^{10, 7}, 1 ×, 10,⁶, 1 ×, 1, 10,⁵, 1 ×, 10,⁴, 1 ×,^{10, 3}, 1 ×,^{10, 2} y 1 × 10,¹. Transfiera los embriones al tubo de esterilización y agregue 20 μL de tampón de lisado para liberar el ADN mitocondrial. A continuación, inactive la proteasa en el lisado a 55 °C durante 20 min y a 95 °C durante 10 min.
   2. Determine el número de copias de ADNmt mediante PCR cuantitativa de fluorescencia utilizando la siguiente configuración: 5 μL de mezcla de PCR, 0,5 μL de cebador B6, 0,5 μL de B6 cebador-rev, 2 μL de producto de pirólisis y 2 μL de ddH₂O. Siga las condiciones de PCR: etapa 1, 95 °C durante 3 min; etapa 2, 95 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; Repite el ciclo 40 veces.

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Resultados

En este protocolo, aislamos y caracterizamos ADSCs a partir de grasa de ratón (Figura 1). Para obtener mitocondrias aisladas, la membrana celular debe romperse utilizando un homogeneizador de vidrio. (Figura 2A). Es importante obtener una fracción mitocondrial uniforme y sin grandes grumos para que el tubo de microinyección no se bloquee. Primero, 200 μL y luego 10 μL, se deben usar puntas de pipeta para resuspender los hom...

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Discusión

Los ovocitos contienen más mitocondrias que cualquier tipo de célula en el cuerpo, con ~ 1-5 × 10⁵ números de copias de ADNmt. Las mitocondrias son esenciales para la maduración de los ovocitos, la fertilización y el desarrollo embrionario, por lo tanto, cualquier disfunción mitocondrial puede provocar una disminución de la calidad de los ovocitos. La disminución de la cantidad y calidad mitocondrial está estrechamente relacionada con el envejecimiento fisiológico. ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test