Mitochondrialer Transfer von aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen der Maus in gealterte Maus-Eizellen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Isolierung von Mitochondrien aus mesenchymalen Stammzellen aus Maus-Fettgewebe und übertragen die Mitochondrien dann in gealterte Maus-Eizellen, um die Qualität der Eizellen zu verbessern.

Zusammenfassung

Aufgrund des altersbedingten Rückgangs der Quantität und Qualität der Eizellen ist die Fruchtbarkeit von Frauen über 35 Jahren stark zurückgegangen. Die molekularen Mechanismen, die die Qualität der Eizellen erhalten, sind noch unklar, so dass es derzeit schwierig ist, die Geburtenrate von Frauen über 35 Jahren zu erhöhen. Eizellen enthalten mehr Mitochondrien als jede andere Art von Zelle im Körper, und jede mitochondriale Dysfunktion kann zu einer verminderten Eizellqualität führen. In den 1990er Jahren führte der zytoplasmatische Transfer von Eizellen zu großen Erfolgen bei der menschlichen Fortpflanzung, war aber von ethischen Kontroversen begleitet. Es wird erwartet, dass die autologe mitochondriale Transplantation eine nützliche Technik ist, um die Qualität von Eizellen zu erhöhen, die aufgrund des Alters abgenommen haben. In der vorliegenden Studie haben wir aus Fett gewonnene Stammzellen von gealterten Mäusen als Mitochondrienspender verwendet, um die Qualität der Eizellen gealterter Mäuse zu erhöhen. Die Weiterentwicklung der autologen mitochondrialen Transfertechnologie wird eine neue und wirksame Behandlung von Unfruchtbarkeit bei älteren Frauen ermöglichen.

Einleitung

Einer der wichtigsten Faktoren, die die weibliche Fruchtbarkeit beeinflussen, ist die Alterung der Eizellen. Die Verschlechterung der Eizellqualität ist die Hauptursache für Unfruchtbarkeit bei älteren Frauen. Die Hauptursache für die Alterung der Eizellen und der molekulare Mechanismus, der die Eizellqualität reguliert, sind jedoch noch unklar. Frühere Studien haben gezeigt, dass sowohl die Anzahl als auch die Qualität der Mitochondrien an der Qualitätskontrolle der Eizellen und der Embryonalentwicklung beteiligt sind ^1,2,3. Die Abnahme der Quantität und Qualität der Mitochondrien steht in engem Zusammenhang mit dem Altern³.

Es wurden viele Versuche unternommen, die Funktion der Mitochondrien bei gealterten Eizellen zu verbessern, einschließlich der Nahrungsergänzung von Mitochondrien und des Mitochondrientransfers. Zu den bekannten, wirksamen Nahrungsergänzungsmitteln der Mitochondrien gehören Coenzym Q10 (CoQ10), Alpha-Liponsäure (α-LA) und Resveratrol (RSV)⁴. Studien haben gezeigt, dass eine CoQ10-Supplementierung nicht nur den altersbedingten Rückgang der Quantität und Qualität der Eizellen verbessern kann, sondern auch die normale Entwicklung und den Eisprung der Eizellen fördern^{kann 5}. α-LA verlangsamt die altersbedingte Verschlechterung der Eizellqualität und des metabolischen Phänotyps von Patientinnen mit polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS)^6,7. Resveratrol kann die Anzahl der Eizellen mit abnormalen Spindeln und einer fehlerhaften Chromosomenausrichtung bei alternden Mäusen reduzieren, während es die Embryonalentwicklung dosisabhängig beeinflusst⁸. Da die klinische Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln der Mitochondrien jedoch nicht das erwartete Niveau erreicht hat, müssen andere wirksame Behandlungen erforscht werden.

Der erste Versuch des Mitochondrientransfers wurde 1997 durchgeführt. Der Transfer von Zytoplasma junger Spendereizellen in gealterte Empfängereizellen verbesserte die Eizellqualität der älteren Patientinnen, die erfolgreich gesunde Säuglinge zur Welt brachten⁹, was der Grund für die Anwendung dieser Technik war. Der allogene zytoplasmatische Transfer von Eizellen kann jedoch aus zwei Hauptgründen nicht in der klinischen Praxis angewendet werden: dem Problem der genetischen Heterogenität und regulatorischen Problemen, die durch die Transplantation von Mitochondrien von Spendern verursacht werden. Eine frühere Studie zeigte, dass die mitochondriale Zelltransplantation die Qualität der Eizellen, die Embryonalentwicklung und die Fruchtbarkeit gealterter Mäuse verbessern konnte¹⁰, was keine ethischen Probleme oder Probleme mit der genetischen Heterogenität aufwies und einige Probleme löste, die durch den Transfer von Zytoplasma der Spendereizellen in die Empfängereizellen verursacht wurden^10,11.

In der Zwischenzeit war der autologe Zellmitochondrientransfer der Wirkung früherer Nahrungsergänzungsmittel der Mitochondrien auf die Verbesserung der Qualität der Eizellen überlegen¹¹. Daher ist die autologe zelluläre mitochondriale Transplantation die geeignete Wahl für die klinische Anwendung dieser Technologie¹². Aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ADSCs) können durch minimalinvasive Technologie gewonnen werden, sind leicht zu isolieren und zu kultivieren und können eine ideale "Samenzelle" für die regenerative Medizin sein. Mitochondrien sind reich an ADSCs, und die Funktion der Mitochondrien nimmt mit zunehmendem Alter nicht ab, was darauf hindeutet, dass ADSCs eine ausgezeichnete Quelle für Mitochondrien sind^13,14. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode vor, um die Mitochondrien von aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen der Maus in gealterte Maus-Eizellen zu übertragen, um die Eizellqualität zu verbessern. Dies ist ein nützliches Modell für die autologe mitochondriale ADSC-Transfertechnologie beim Menschen.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des dritten angeschlossenen Krankenhauses der Universität Soochow genehmigt. Alle Betriebe befolgen die entsprechenden Richtlinien der Tierpflege- und -verwendungsbehörde und der nationalen Richtlinien. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Isolierung und Charakterisierung gealterter mesenchymaler Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe der Maus

1. Opfern Sie die gealterten Mäuse (10 Monate alt, durchschnittlich drei) durch Gebärmutterhalsdislokation unter Pentobarbital-Natriumanästhesie und weichen Sie sie 5 Minuten lang in 75% Alkohol ein, bevor Sie das Fettgewebe isolieren.
   HINWEIS: Das Einweichen in 75%igem Alkohol für 5 Minuten kann die Kontamination der Primärzellen effektiv reduzieren.
2. Machen Sie einen 2 cm großen Hautschnitt an der beidseitigen Leistenzahl, legen Sie das Unterhautfett frei und isolieren Sie das Unterhautfett mit einer Pinzette. Entnehmen Sie das beidseitige Leistenfett von den Mäusen mit einer sterilisierten Augenschere (vermeiden Sie das Schneiden des Unterhautgewebes). Legen Sie das Fettgewebe in ein steriles 15 mL Zentrifugenröhrchen auf Eis und transportieren Sie es sofort ins Zellkulturlabor.
3. Übertragen Sie das Fettgewebe auf eine 6-Well-Platte, spülen Sie es 3x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 100 U/ml Penicillin und Streptomycin aus. Die Blutgefäße, die Fettfaszien und das Bindegewebe unter dem Fettgewebe entfernen und in ~0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm große Stücke schneiden.
   HINWEIS: Bei der Isolierung von Fettstammzellen kommt es häufig zu einer Kontamination von vaskulären Endothelzellen. Die Entfernung der Blutgefäße aus dem Fettgewebe kann die Kontamination der vaskulären Endothelzellen reduzieren.
4. Das zerkleinerte Fettgewebe in das gleiche Volumen der Kollagenase-Typ-I-Lösung (0,1 % Endkonzentration Kollagenase Typ I) überführen und 30 Minuten lang bei 37 °C verdauen.
5. Zur Neutralisierung der Kollagenase Typ I wird das gleiche Volumen des vollständigen Kulturmediums (DMEM F-12-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum) zugegeben, 10 Minuten lang bei 600 × g zentrifugiert und der Überstand und das Fettgewebe verworfen.
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet im vollständigen Kulturmedium. Entfernen Sie das unverdaute Gewebe durch Filtration durch ein 40-μm-Zellsieb und zentrifugieren Sie es dann 5 Minuten lang bei 600 × g .
7. Resuspendieren Sie die Zellsuspension mit 5 ml des gesamten Kulturmediums und pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipette vorsichtig auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Überprüfen Sie die Zellsuspension unter dem Mikroskop, indem Sie ein Aliquot auf ein Hämozytometer legen, um zu bestätigen, dass es sich nur um einzelne Zellen ohne Aggregate handelt. Die einzellige Suspension wird in einen 25^{cm großen} 2-Zell-Kulturkolben gegeben und in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator bei 37 °C kultiviert.
8. Wechseln Sie das Kulturmedium 48 Stunden später. Wechseln Sie das Kulturmedium weiterhin alle 2-3 Tage.
9. Nach 7-10 Tagen lösen Sie die Zellen für die Zellpassage ab, wenn ihre Konfluenz 80%-90% erreicht. Entfernen Sie das komplette Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS. Fügen Sie dann 2 ml 0,05 % Trypsin/EDTA hinzu, um die Zelldissoziation^{durchzuführen 15,16}.
10. Geben Sie 14 Tage lang adipogenes Induktionsmedium hinzu, um die Differenzierung der ADSCs in Adipoktien zu induzieren. Geben Sie osteogenes Induktionsmedium für 28 Tage zu den ADSCs, die auf 2 % gelatinebeschichteten 24-Well-Platten plattiert sind, um ihre Differenzierung in Osteoblasten zu induzieren. Für die neuronale Differenzierung werden die ADSCs mit neuronalem Induktionsmedium kultiviert und dann die neuronenspezifische Enolase und das Neurofilament-Mediator-Polypeptid mittels Immunfluoreszenz¹⁵ nachgewiesen.
    1. Fixieren Sie die Zellen 30 min lang in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Permeabilisierung mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 15 min.
    2. Nach der Blockierung mit 3 % BSA in PBS inkubieren Sie die Zellen mit Primärantikörpern (siehe Materialtabelle), die über Nacht in einer Blockierungslösung bei 4 °C verdünnt wurden.
    3. Inkubieren Sie die Zellen 45 Minuten lang mit Sekundärantikörpern und färben Sie sie anschließend 10 Minuten lang mit DAPI. Untersuchen Sie dann die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
11. Die einzellige ADSC-Suspension wird mit 0,05 % Trypsin/EDTA aufgefangen, 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600 × g zentrifugiert und in PBS resuspendiert, um die Zelldichte auf 1 × 10⁶/ml einzustellen. Aliquotieren Sie die Zellsuspension in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (100 μl/Röhrchen) und fügen Sie FITC-markierte Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper CD29, CD90, CD34 und HLA-DR monoklonale Antikörper mit einer Antikörperkonzentration von 0,5 μg/ml hinzu. Behandeln Sie die Kontrollgruppe mit der gleichen Menge Kaninchen-IgG-FITC, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis und spülen Sie sie mit PBS aus, um den unkonjugierten Antikörper zu entfernen. Nachweis der ADSC-Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie¹³.

2. Isolierung von Mitochondrien aus Fettstammzellen

HINWEIS: Alle Operationen zur Isolierung der Mitochondrien müssen auf Eis durchgeführt werden.

1. Wenn die ADSCs auf 90 % Dichte anwachsen, verdauen Sie die Zellen mit 2 ml 0,05 % Trypsin/EDTA, zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 600 × g , sammeln und zählen Sie die Zellen und entnehmen Sie 1 × 10⁷ Zellen für jede Extraktion.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL Mitochondrien-Extraktionspuffer (für die Puffervorbereitung: 10 mL mit 0,1 M Tris-MOPS, 1 mL mit 0,1 M EGTA/Tris und 20 mL mit 1 M Saccharose; bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 mL und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein) mit 1x Proteaseinhibitor-Cocktail nach dem Waschen mit 2 mL sterilem PBS, und dann 5 Minuten auf Eis inkubieren.
3. Homogenisieren Sie die Zellen 20x-30x mit einem Glashomogenisator (2,0 mL) und überprüfen Sie den Homogenisierungsgrad durch Trypanblau-Färbung.
   HINWEIS: Der Anteil der gefärbten Zellen sollte ~80% betragen. Eine übermäßige Homogenisierung schädigt die Struktur der Mitochondrien.
4. Zentrifugieren Sie das Zellhomogenat bei 600 × g für 15 min, geben Sie den Überstand in ein neues, vorgekühltes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und wiederholen Sie den Vorgang einmal.
5. Der Überstand wird 15 Minuten lang bei 7.500 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Waschen Sie den mitochondrialen Niederschlag und resuspendieren Sie ihn, indem Sie ~100 μl vorgekühlten mitochondrialen Injektionspuffer (225 mM Mannitol, 75 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl und 5 mM KH₂PO₄, pH 7,2) in einer Konzentration von 1-5 mg/ml (Gesamtproteinkonzentration) hinzufügen. Transportieren Sie die mitochondriale Suspension auf Eis.
6. Analysieren Sie die Funktion und Reinheit der isolierten Mitochondrien durch JC-1-durchflusszytometrische Analyse und Western Blot (VDAC1, β-Aktin und Lamin B)¹³.
   1. Unterteilen Sie die isolierten Mitochondrien in drei Gruppen: Dimethylsulfoxid (DMSO), JC-1 gefärbt und JC-1 gefärbt mit 30 Minuten Carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP) Vorbehandlung.
   2. Nach dem Zentrifugieren bei 7.500 × g wird der Überstand verworfen und der Puffer suspendiert.
   3. Erfassung der Fluoreszenzintensität der JC-1-Monomere (FITC-Kanal) und Aggregate (PE-Kanal), die mittels Durchflusszytometrie erfasst wurden. Bewerten Sie die isolierten mitochondrialen Membranpotentiale, indem Sie das Verhältnis der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität des PE-Kanals zum FITC-Kanal messen.
      HINWEIS: Führen Sie die obigen Schritte im Dunkeln aus.

3. Überstimulation der Eierstöcke

1. Injizieren Sie 10 Monate alten weiblichen C57BL/6-Mäusen intraperitoneal 10 I.E. trächtige Stutenserumgonadotropin (PMSG) zur Superovulation. Nach 48 Stunden sind 10 I.E. humanes Choriongonadotropin (hCG) intraperitoneal zu injizieren.
2. 13 h nach der Injektion von hCG reißen Sie den geschwollenen Eileiter mit einer mikroskopisch kleinen Pinzette auf. Lösen Sie die Kumuluskomplexe aus dem geschwollenen Eileiter. Die Kumuluszellen werden in M2-Medium mit Hyaluronidase (0,3 mg/ml) bei 37 °C gelöst.
   HINWEIS: Die Auflösungszeit beträgt weniger als 5 Minuten. Minimieren Sie die Zeit, in der der Kumuluskomplex Hyaluronidase ausgesetzt ist, da eine längere Exposition das Entwicklungspotenzial der Eizellen beeinträchtigen kann.

4. Mitochondrialer Transfer zusammen mit ICSI

1. Geben Sie das Sperma ohne Schwanz in die mitochondriale Flüssigkeit. Spermien ohne Schwanz durch Schneiden mit Ultraschall^{erhalten 17}. Legen Sie das Sperma ohne Schwanz in die mitochondriale Flüssigkeit, so dass sich 100 Spermien in 50 μl der mitochondrialen Flüssigkeit befinden.
   HINWEIS: Da die mitochondriale Suspension leicht viskos und in vitro nicht stabil ist, schließen Sie die Injektion innerhalb von 30 Minuten ab und wechseln Sie die Mikroinjektionsnadel sofort, wenn sie verstopft ist. Der optimale Innendurchmesser der Mikroinjektionsnadel beträgt 5 μm.
2. Injizieren Sie ~2 pL mitochondrialen Atmungspuffer oder mitochondriale Suspension mit Sperma in die Eizellen mit einem Mikroinjektor unter einem inversen Mikroskop (200x; siehe Materialtabelle) innerhalb von 30 Minuten gemäß dem von Mehlmann und Kline^10,18 beschriebenen Protokoll von Hiramoto.
   HINWEIS: Die injizierte mitochondriale Suspension macht 1%-3% des Gesamtvolumens der Eizellen aus. Kontrollieren Sie das Volumen (1%-3%) der mitochondrialen Suspension im Zytoplasma, um die Konsistenz der Injektion sicherzustellen.
3. Nach der Injektion legen Sie die befruchteten Eizellen für 15 Minuten zur Äquilibrierung in M2-Medium und übertragen Sie die überlebenden befruchteten Eizellen in M16-Kulturmedium.
4. Untersuchen Sie die überlebenden befruchteten Eizellen, indem Sie die glatte Morphologie, die Bildung des Vorkerns und die Freisetzung des zweiten Polkörpers^{beobachten 19}. Beobachten, fotografieren und zählen Sie die Embryonen jeden Tag um 09:00 Uhr und 18:00 Uhr für 4 Tage. Zum Schluss werden die Blastozysten gesammelt, eingefroren und in einem -80 °C-Kühlschrank für die Bestimmung der ATP- und mtDNA-Kopienzahl gelagert, um die Anzahl und Verbesserung der Mitochondrientransplantation zu bewerten.
   1. Präparation eines Standardplasmids (Plasmid zur absoluten Quantifizierung, wie zuvor beschrieben¹³) für die Bestimmung der mitochondrialen Kopienzahl gemäß der Kopienzahl von 1 ×^{10 7}, 1 ×^{10 6}, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² und 1 × 10¹. Übertragen Sie die Embryonen in das Sterilisationsröhrchen und fügen Sie 20 μl Lysatpuffer hinzu, um die mitochondriale DNA freizusetzen. Dann inaktivieren Sie die Protease im Lysat bei 55 °C für 20 min und 95 °C für 10 min.
   2. Bestimmen Sie die mtDNA-Kopienzahl durch quantitative Fluoreszenz-PCR mit folgendem Setup: 5 μl PCR-Mix, 0,5 μl B6-Primer-Forward, 0,5 μl B6-Primer-Rev, 2 μL Pyrolyseprodukt und 2 μL ddH₂O. Befolgen Sie die PCR-Bedingungen: Stufe 1, 95 °C für 3 Minuten; Stufe 2, 95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; Wiederholen Sie den Zyklus 40x.

Ergebnisse

In diesem Protokoll haben wir ADSCs aus Mausfett isoliert und charakterisiert (Abbildung 1). Um isolierte Mitochondrien zu erhalten, muss die Zellmembran mit einem Glashomogenisator aufgebrochen werden. (Abbildung 2A). Es ist wichtig, eine gleichmäßige mitochondriale Fraktion ohne große Klumpen zu erhalten, damit das Mikroinjektionsröhrchen nicht verstopft wird. Zuerst müssen Pipettenspitzen von 200 μl und dann von 10 μl ...

Diskussion

Eizellen enthalten mehr Mitochondrien als jede andere Art von Zellen im Körper, mit ~1-5 × 10⁵ mtDNA-Kopienzahlen. Mitochondrien sind für die Reifung der Eizellen, die Befruchtung und die Embryonalentwicklung unerlässlich, daher kann jede mitochondriale Dysfunktion zu einer verminderten Eizellqualität führen. Eine verminderte mitochondriale Quantität und Qualität steht in engem Zusammenhang mit der physiologischen Alterung. In diesem Protokoll wurde eine einfache Metho...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test