Fare Adipozundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerden Yaşlı Fare Oositlerine Mitokondriyal Transfer

Özet

Burada, fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerden mitokondri izolasyonunu açıklıyoruz ve daha sonra oositlerin kalitesini artırmak için mitokondriyi yaşlı fare oositlerine aktarıyoruz.

Özet

Yaşa bağlı olarak oositlerin miktar ve kalitesindeki düşüş nedeniyle, 35 yaşın üzerindeki kadınların doğurganlığı keskin bir şekilde azalmıştır. Oosit kalitesini koruyan moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır, bu nedenle şu anda 35 yaşın üzerindeki kadınların doğum oranını artırmak zordur. Oositler, vücuttaki herhangi bir hücre tipinden daha fazla mitokondri içerir ve herhangi bir mitokondriyal disfonksiyon, oosit kalitesinin düşmesine neden olabilir. 1990'larda, oosit sitoplazmik transferi insan üremesinde büyük başarı ile sonuçlandı, ancak etik tartışmalar eşlik etti. Otolog mitokondriyal transplantasyonun yaşa bağlı olarak azalan oositlerin kalitesini artırmak için yararlı bir teknik olması beklenmektedir. Bu çalışmada, yaşlı farelerin oositlerinin kalitesini artırmak için yaşlı farelerden elde edilen adipoz kaynaklı kök hücreleri mitokondri donörü olarak kullandık. Otolog mitokondriyal transfer teknolojisinin daha da geliştirilmesi, yaşlı kadınlarda kısırlık için yeni ve etkili bir tedavi sağlayacaktır.

Giriş

Kadın doğurganlığını etkileyen önemli faktörlerden biri oosit yaşlanmasıdır; Oosit kalitesindeki azalma yaşlı kadınlarda infertilitenin ana nedenidir. Bununla birlikte, oosit yaşlanmasının ana nedeni ve oosit kalitesini düzenleyen moleküler mekanizma hala belirsizdir. Önceki çalışmalar, mitokondri sayısının ve kalitesinin oositlerin kalite kontrolünde ve embriyonik gelişimde rol oynadığını göstermiştir ^1,2,3. Mitokondri miktarının ve kalitesinin azalması yaşlanma ile yakından ilişkilidir³.

Mitokondri besin takviyesi ve mitokondri transferi de dahil olmak üzere yaşlı oositlerde mitokondrinin işlevini iyileştirmek için birçok girişimde bulunulmuştur. Mitokondrinin iyi bilinen, etkili besin takviyeleri arasında Koenzim Q10 (CoQ10), Alfa-lipoik asit (α-LA) ve resveratrol (RSV)⁴ bulunur. Çalışmalar, CoQ10 takviyesinin sadece oositlerin miktarı ve kalitesindeki yaşa bağlı düşüşü iyileştirmekle kalmayıp, aynı zamanda oositlerin normal gelişimini ve yumurtlamasını da desteklediğini göstermiştir⁵. α-LA, polikistik over sendromlu (PKOS) hastaların yaşlanmasına ve metabolik fenotipine bağlı oosit kalitesi düşüşünü ^{yavaşlatır6,7}. Resveratrol, yaşlanan farelerde anormal iğciklere ve yanlış kromozom hizalamasına sahip oosit sayısını azaltabilirken, embriyonik gelişimi doza bağlı bir şekilde etkileyebilir⁸. Bununla birlikte, mitokondri besin takviyelerinin klinik etkisi beklenen seviyelere ulaşmadığından, diğer etkili tedavilerin araştırılması gerekmektedir.

İlk mitokondri transferi girişimi 1997 yılında gerçekleştirilmiştir. Genç donör oosit sitoplazmasının yaşlı alıcı oositlere transferi, sağlıklı bebekleri başarılı bir şekilde doğuran yaşlı hastaların oosit kalitesini iyileştirmiştir⁹, bu tekniğin kullanılmasının arkasındaki mantık budur. Bununla birlikte, allojenik oosit sitoplazmik transferi, genetik heterojenlik sorunu ve donör mitokondri transplantasyonunun neden olduğu düzenleyici sorunlar olmak üzere iki ana nedenden dolayı klinik uygulamaya uygulanamaz. Daha önce yapılan bir çalışma, otolog hücreli mitokondriyal transplantasyonun, etik sorunları veya genetik heterojenlik sorunları olmayan yaşlı farelerin¹⁰ oosit kalitesini, embriyo gelişimini ve doğurganlığını iyileştirebileceğini ve donör oosit sitoplazmasının alıcı oositlere transferinden kaynaklanan bazı sorunları çözdüğünü göstermiştir^10,11.

Bu arada, otolog hücre mitokondriyal transferi, mitokondrinin önceki besin takviyelerinin oositlerin kalitesini iyileştirme üzerindeki etkisinden daha üstündü¹¹. Bu nedenle, otolog hücreli mitokondriyal transplantasyon, bu teknolojinin klinik uygulaması için uygun seçimdir¹². Adipoz kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler) minimal invaziv teknoloji ile elde edilebilir, izole edilmesi ve kültürlenmesi kolaydır ve rejeneratif tıp için ideal bir "tohum" hücresi olabilir. Mitokondri ADSC'ler açısından zengindir ve mitokondrinin işlevi yaşla birlikte azalmaz, bu da ADSC'lerin mükemmel bir mitokondri kaynağı olduğunu düşündürür^13,14. Bu protokolde, oosit kalitesini artırmak için fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin mitokondrisini yaşlı fare oositlerine aktarmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu, insan ADSC otolog mitokondriyal transfer teknolojisi için yararlı bir modeldir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Soochow Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi'nin Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylandı. Tüm operasyonlar uygun hayvan bakımı ve kullanımı ajansı ve ulusal yönergeleri takip eder. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, aletlerin ve reaktiflerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Yaşlı fare adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) izolasyonu ve karakterizasyonu

1. Yaşlı fareleri (10 aylık, ortalama üç) pentobarbital sodyum anestezisi altında servikal çıkık ile sakride edin ve yağ dokusu izolasyonundan önce 5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.
   NOT: 5 dakika boyunca %75 alkole batırmak, birincil hücrelerin kontaminasyonunu etkili bir şekilde azaltabilir.
2. Bilateral kaşek kemiğinde deride 2 cm'lik bir kesi yapın, deri altı yağını açığa çıkarın ve deri altı yağını izole etmek için cımbız kullanın. Sterilize edilmiş oftalmik makas kullanarak farelerden bilateral kasık yağını toplayın (deri altı dokusunu kesmekten kaçının). Yağ dokusunu buz üzerinde 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve hemen hücre kültürü laboratuvarına taşıyın.
3. Yağ dokusunu 6 oyuklu bir plakaya aktarın, 100 U / mL penisilin ve streptomisin içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez durulayın. Yağ dokusunun altındaki kan damarlarını, yağ fasyasını ve bağ dokusunu çıkarın ve ~ 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm'lik parçalar halinde kesin.
   NOT: Adipoz kök hücreleri izole ederken, genellikle vasküler endotel hücrelerinde kontaminasyon olur. Kan damarlarının yağ dokusundan çıkarılması vasküler endotel hücre kontaminasyonunu azaltabilir.
4. Parçalanmış yağ dokusunu aynı hacimde kollajenaz tip I çözeltisine (% 0.1 nihai kollajenaz tip I konsantrasyonu) aktarın ve 37 ° C'de 30 dakika sindirin.
5. Kollajenaz tip I'i nötralize etmek için eşit hacimde tam kültür ortamı (% 10 fetal sığır serumu içeren DMEM F-12 ortamı) ekleyin, 10 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin ve süpernatan ve yağ dokusunu atın.
6. Hücre peletini tam kültür ortamında yeniden süspanse edin. Sindirilmemiş dokuyu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzülerek çıkarın ve ardından 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
7. Hücre süspansiyonunu 5 mL tam kültür ortamı ile yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetlemek için 1 mL'lik bir pipet kullanın. Herhangi bir agrega olmadan sadece tek hücreler olduğunu doğrulamak için bir hemositometre üzerine bir alikot yerleştirerek hücre süspansiyonunu mikroskop altında kontrol edin. Tek hücreli süspansiyonu 25^cm2'lik bir hücre kültürü şişesine ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde kültürleyin.
8. Kültür ortamını 48 saat sonra değiştirin. Kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirmeye devam edin.
9. 7-10 gün sonra, birleşmeleri% 80 -% 90'a ulaştığında hücre geçişi için hücreleri ayırın. Tüm kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın. Ardından, hücre ayrışmasını gerçekleştirmek için 2 mL% 0.05 tripsin / EDTA ekleyin^15,16.
10. ADSC'lerin adipoktilere farklılaşmasını indüklemek için 14 gün boyunca adipojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Osteoblastlara farklılaşmalarını indüklemek için% 2 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine kaplanmış ADSC'lere 28 gün boyunca osteojenik indüksiyon ortamı ekleyin. Nöral farklılaşma için, ADSC'leri nöral indüksiyon ortamı ile kültürleyin, ardından immünofloresan¹⁵ kullanarak nörona özgü enolaz ve nörofilament aracı polipeptidi tespit edin.
    1. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından 15 dakika boyunca PBS'de% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirme yapın.
    2. PBS'de% 3 BSA ile bloke ettikten sonra, hücreleri gece boyunca 4 ° C'de bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
    3. Hücreleri ikincil antikorlarla 45 dakika inkübe edin ve ardından 10 dakika boyunca DAPI ile boyayın. Ardından, hücreleri bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
11. % 0.05 tripsin / EDTA kullanarak tek hücreli ADSC süspansiyonunu toplayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüjleyin ve hücre yoğunluğunu 1 × 10⁶ / mL'ye ayarlamak için PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (100 μL / tüp) ayırın ve 0.5 μg / mL'lik bir antikor konsantrasyonu ile FITC etiketli tavşan anti-fare CD29, CD90, CD34 ve HLA-DR monoklonal antikorları ekleyin. Kontrol grubuna aynı hacimde tavşan IgG FITC uygulayın, 30 dakika buz üzerinde inkübe edin ve konjuge olmayan antikoru çıkarmak için PBS ile durulayın. Akış sitometrisi¹³ ile ADSC yüzey belirteçlerini tespit edin.

2. Mitokondrinin adipoz kök hücrelerden izolasyonu

NOT: Tüm mitokondri izolasyon işlemleri buz üzerinde yapılmalıdır.

1. ADSC'ler %90 yoğunluğa ulaştığında, hücreleri 2 mL %0.05 tripsin / EDTA ile sindirin, 600 × g'da 5 dakika santrifüjleyin, hücreleri toplayın ve sayın ve her ekstraksiyon için 1 × 10⁷ hücre alın.
2. Hücreleri 2 mL mitokondri ekstraksiyon tamponunda yeniden süspanse edin (tampon hazırlığı için: 10 mL 0.1 M Tris-MOPS, 1 mL 0.1 M EGTA / Tris ve 20 mL 1 M sükroz; hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye getirin ve pH'ı 7.4'e ayarlayın) 2 mL steril PBS ile yıkadıktan sonra 1x proteaz inhibitörü kokteyli ile, ve sonra 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
3. Hücreleri bir cam homojenizatör (2.0 mL) ile 20x-30x homojenize edin ve tripan mavisi boyama ile homojenizasyon derecesini kontrol edin.
   NOT: Lekeli hücrelerin oranı ~%80 olmalıdır. Aşırı homojenizasyon mitokondrinin yapısına zarar verir.
4. Hücre homojenatını 600 × g'da 15 dakika santrifüjleyin, süpernatanı yeni, önceden soğutulmuş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne alın ve işlemi bir kez tekrarlayın.
5. Süpernatanı 15 dakika boyunca 7.500 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Mitokondriyal çökeltiyi yıkayın ve ~ 100 μL önceden soğutulmuş mitokondriyal enjeksiyon tamponu (225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl ve 5 mM KH₂PO₄, pH 7.2) ekleyerek yeniden süspanse edin, 1-5 mg / mL konsantrasyonda (toplam protein konsantrasyonu). Mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde taşıyın.
6. İzole edilmiş mitokondrinin işlevini ve saflığını JC-1 akış sitometrik analizi ve Western blot (VDAC1, β-aktin ve Lamin B) ile analiz ^edin13.
   1. İzole edilmiş mitokondriyi üç gruba ayırın: dimetil sülfoksit (DMSO), JC-1 lekeli ve 30 dakikalık karbonil siyanür 3-klorofenilhidrazon (CCCP) ön işlemi ile boyanmış JC-1.
   2. 7.500 × g'da santrifüjledikten sonra, süpernatanı atın ve tamponu askıya alın.
   3. Akış sitometrisi ile yakalanan JC-1 monomerlerinin (FITC kanalı) ve agregaların (PE kanalı) floresan yoğunluğunu yakalayın. PE kanalının ortalama floresan yoğunluğunun FITC kanalına oranlarını ölçerek izole edilmiş mitokondriyal membran potansiyellerini değerlendirin.
      NOT: Yukarıdaki adımları karanlıkta gerçekleştirin.

3. Yumurtalık süper stimülasyonu

1. Süperovülasyon için 10 aylık dişi C57BL / 6 farelere intraperitoneal olarak 10 IU hamile kısrak serumu gonadotropin (PMSG) enjekte edin. 48 saat sonra, intraperitoneal olarak 10 IU insan koryonik gonadotropini (hCG) enjekte edin.
2. HCG enjeksiyonundan 13 saat sonra, şişmiş fallop tüpünü mikroskobik cımbızla yırtın. Şişmiş fallop tüpünden kümülüs komplekslerini serbest bırakın. M2 ortamındaki kümülüs hücrelerini 37 ° C'de hyaluronidaz (0.3 mg / mL) ile çözün.
   NOT: Çözünme süresi 5 dakikadan azdır. Kümülüs kompleksinin hyaluronidaza maruz kaldığı süreyi en aza indirin, çünkü uzun süreli maruz kalma oosit gelişim potansiyelini bozabilir.

4. ICSI ile birlikte mitokondriyal transfer

1. Spermi kuyruksuz mitokondriyal sıvıya koyun. Ultrason¹⁷ kullanarak keserek kuyruksuz sperm elde edin. Spermi kuyruksuz mitokondriyal sıvıya yerleştirin, böylece mitokondriyal sıvının 50 μL'sinde 100 sperm olur.
   NOT: Mitokondriyal süspansiyon hafif viskoz olduğundan ve in vitro olarak stabil olmadığından, enjeksiyonu 30 dakika içinde tamamlayın ve tıkandığında mikroenjeksiyon iğnesini hemen değiştirin. Mikroenjeksiyon iğnesinin optimum iç çapı 5 μm'dir.
2. Mehlmann ve Kline^10,18 tarafından tarif edilen Hiramoto protokolüne göre 30 dakika içinde ters mikroskop altında (200x; Malzeme Tablosuna bakınız) bir mikroenjektör kullanarak oositlere ~ 2 pL mitokondriyal solunum tamponu veya sperm ile mitokondriyal süspansiyon enjekte edin.
   NOT: Enjekte edilen mitokondriyal süspansiyon, toplam oosit hacminin %1-3'ünü oluşturur. Enjeksiyonun tutarlılığını sağlamak için sitoplazmadaki mitokondriyal süspansiyonun hacmini (% 1 -% 3) kontrol edin.
3. Enjeksiyondan sonra, döllenmiş oositleri 15 dakika boyunca dengeleme için M2 ortamına yerleştirin ve hayatta kalan döllenmiş yumurtaları M16 kültür ortamına aktarın.
4. İkinci kutup gövdesinin¹⁹ düzgün morfolojisini, pronükleer oluşumunu ve salınımını gözlemleyerek hayatta kalan verimli yumurtaları inceleyin. Embriyoları 4 gün boyunca her gün 09:00 ve 18:00'de gözlemleyin, fotoğraflayın ve sayın. Son olarak, blastokistleri toplayın ve dondurun ve mitokondriyal transplantasyonun sayısını ve gelişimini değerlendirmek için ATP ve mtDNA kopya sayısı belirleme için -80 ° C'lik bir buzdolabında saklayın.
   1. 1 ila 10^{7, 1} ×× 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10² ve 1 × 10^{1 kopya} numarasına göre mitokondriyal kopya sayısı tayini için standart plazmid (daha önce tarif edildiği gibi¹³ gibi mutlak miktar tayini için plazmit) hazırlayın. Embriyoları sterilizasyon tüpüne aktarın ve mitokondriyal DNA'yı serbest bırakmak için 20 μL lizat tamponu ekleyin. Ardından, lizattaki proteazı 55 ° C'de 20 dakika ve 95 ° C'de 10 dakika inaktive edin.
   2. Aşağıdaki kurulumu kullanarak floresan kantitatif PCR ile mtDNA kopya sayısını belirleyin: 5 μL PCR karışımı, 0.5 μL B6 primer-ileri, 0.5 μL B6 primer-rev, 2 μL piroliz ürünü ve 2 μL ddH₂O. PCR koşullarını takip edin: aşama 1, 3 dakika boyunca 95 °C; aşama2, 30 saniye boyunca 95 °C, 30 saniye boyunca 58 °C ve 30 saniye boyunca 72 °C; Döngüyü 40x tekrarlayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolde, ADSC'leri fare yağından izole ettik ve karakterize ettik (Şekil 1). İzole mitokondri elde etmek için, hücre zarının bir cam homojenizatör kullanılarak parçalanması gerekir. (Şekil 2A). Mikroenjeksiyon tüpünün tıkanmaması için büyük kümeler olmadan düzgün bir mitokondriyal fraksiyon elde etmek önemlidir. Önce 200 μL, ardından 10 μL'lik pipet uçları kullanılarak homojenatlar nazikçe ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Oositler, vücuttaki herhangi bir hücre türünden daha fazla mitokondri içerir ve ~ 1-5 × 10⁵ mtDNA kopya sayısına sahiptir. Mitokondri, oosit olgunlaşması, döllenme ve embriyonik gelişim için gereklidir, bu nedenle herhangi bir mitokondriyal disfonksiyon, oosit kalitesinin düşmesine neden olabilir. Azalmış mitokondriyal miktar ve kalite fizyolojik yaşlanma ile yakından ilişkilidir. Bu protokolde, yaşlı oosit kalitesini iyileştirmeye çalışmak için yaş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% trypsin/EDTA	Gibco	25300054	Cell Culture
4% paraformaldehyde	beyotime	P0099	immunofluorescence
40 μm cell strainer	Corning	352340	ADSC isolation
adipogenic induction	Cyagen	HUXXC-90031	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD29	BD Biosciences	558741	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD90	BD Biosciences	553016	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
β-actin	Abcam	ab-8226	Mitochondrial function test
BSA	Sigma	V900933	immunofluorescence
CCCP	Solarbio	C6700	mitochondria JC-1 flow analysis
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
collagenase type I	Sigma	SCR103	ADSC isolation
DAPI	Invitrogen	D1306	immunofluorescence
DMEM-F12	Gibco	11320033	Cell Culture
DMSO	Sigma	276855	mitochondria JC-1 flow analysis
EGTA	Sigma	324626	Mitochondria isolation
FBS	Gibco	10100147	Cell Culture
Flow cytometry	BD Biosciences	FACSCanto™ II	Characteristics of ADSCs
fluorescence microscope	leica	DM2500	immunofluorescence
gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
glass homogenization tube	Sangon	F519062	Mitochondria isolation
hCG	Aibei	M2520	Ovarian superstimulation
hyaluronidase	Sigma	H1115000	Ovarian superstimulation
Inverted microscope	Olympus	IMT-2	Microinjection
Isolated Mitochondria Staining Kit	Sigma	CS0760	mitochondria JC-1 flow analysis
JC-1	Sigma	T4069	Mitochondrial function test
KCl	Sigma	P5405	Mitochondria transfer
KH2PO4	Sigma	P5655	Mitochondria transfer
LaminB	Abcam	ab-16048	Mitochondrial function test
M16 Medium	Sigma	M7292	embryo cell culture
M2 Medium	Sigma	M7167	embryo cell culture
mannitol	Sigma	M9546	Mitochondria transfer
Microinjector	Olympus+ eppendorf	IX73	Mitochondria transfer
MitoTracker red	Invitrogen	M22425	Mitochondria staining
MOPS	Sigma	M1442	Mitochondria isolation
neurofilament mediator polypeptide (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	Multidirectional differentiation
neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Neuron-specific enolase (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
Oil Red O	Sangon	E607319	Adipogenic differentiation
oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	Cell Culture
penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell Culture
PMSG	Aibei	M2620	Ovarian superstimulation
protease Inhibitor cocktail	Sigma	P8340	Mitochondria isolation
sucrose	Sigma	V900116	Mitochondria isolation
Tris	Sigma	648314	Mitochondria isolation
Tris-HCl	Sigma	108319	Mitochondria transfer
Triton X-100	beyotime	P0096	immunofluorescence
VDAC	Abcam	ab-14734	Mitochondrial function test