JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تستخدم مقايسات التقاط الحلقة D (DLC) وامتداد الحلقة D (DLE) مبدأ ربط القرب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتحديد تكوين الحلقة D وتمديد الحلقة D وتشكيل المنتج في موقع كسر مزدوج تقطعت به السبل في Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

يمكن إصلاح تلف الحمض النووي ، بما في ذلك فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، والتي تحدث خلال مرحلتي S و G2 من دورة الخلية عن طريق إعادة التركيب المتماثل (HR). بالإضافة إلى ذلك ، تمثل الموارد البشرية آلية مهمة لإنقاذ شوكة النسخ المتماثل بعد التوقف أو الانهيار. إن تنظيم العديد من الخطوات القابلة للعكس والتي لا رجعة فيها لهذا المسار المعقد يعزز إخلاصه. يتيح التحليل الفيزيائي لوسيطات إعادة التركيب التي تشكلت أثناء الموارد البشرية توصيف هذه الضوابط بواسطة عوامل البروتين النووي المختلفة وتفاعلاتها. على الرغم من وجود طرق راسخة لفحص أحداث ووسيطات محددة في مسار إعادة التركيب ، إلا أن اكتشاف تكوين الحلقة D وتمديدها ، وهما خطوتان حاسمتان في هذا المسار ، أثبت أنه يمثل تحديا حتى وقت قريب. هنا ، يتم وصف طرق فعالة للكشف عن الأحداث الرئيسية في مسار الموارد البشرية ، وهي تشكيل كسر الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل ، وتشكيل الحلقة D ، وتمديد الحلقة D ، وتشكيل المنتجات عن طريق النسخ المتماثل الناجم عن الكسر (BIR) في Saccharomyces cerevisiae . تكتشف هذه المقايسات وسيطة إعادة التركيب ذات الصلة والمنتجات ذات الحساسية العالية ومستقلة عن الجدوى الخلوية. يعتمد اكتشاف الحلقات D وامتداد الحلقة D ومنتج BIR على ربط القرب. تسمح هذه المقايسات معا بدراسة حركية الموارد البشرية على مستوى السكان لمعالجة وظائف بروتينات الموارد البشرية والمنظمين بدقة في خطوات مهمة في المسار.

Introduction

إعادة التركيب المتماثل (HR) هي آلية عالية الدقة لإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) ، والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، وفجوات ssDNA ، بالإضافة إلى مسار لتحمل تلف الحمض النووي. يختلف HR عن المسارات المعرضة للخطأ لإصلاح / تحمل تلف الحمض النووي ، مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وتوليف الآفة ، من حيث أنه يستخدم الحمض النووي المزدوج المتماثل السليم كمتبرع لقالب حدث الإصلاح. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الوسائط الرئيسية في مسار الموارد البشرية قابلة للعكس ، مما يسمح بتنظيم رائع لخطوات المسار الفردية. خلال المراحل S و G2 و M من دورة الخلية ، تتنافس HR مع NHEJ لإصلاح DSBs1 ذات النهايات. بالإضافة إلى ذلك ، يعد HR ضروريا لتكرار الحمض النووي لإصلاح تلف الحمض النووي المرتبط بالنسخ المتماثل ، بما في ذلك فجوات ssDNA و DSBs أحادية الجانب ، وكآلية لتجاوز آفة الحمض النووي2.

الوسيط الحرج في مسار الموارد البشرية هو حلقة الإزاحة ، أو الحلقة D (الشكل 1). بعد الاستئصال النهائي ، يتم تحميل recombinase المركزي في التفاعل ، Rad51 ، على ssDNA المستقطع حديثا للجزيء المكسور ، مكونا خيطا حلزونيا2. ثم يقوم Rad51 بإجراء بحث تماثلي لتحديد متبرع متماثل مناسب ، عادة ما يكون الكروماتيد الشقيق في الخلايا الجسدية. تتشكل الحلقة D عندما يغزو خيط Rad51-ssDNA الحمض النووي المزدوج المتماثل ، مما يؤدي إلى اقتران قاعدة Watson-Crick للشريط المكسور مع الشريط المكمل للمتبرع ، مما يؤدي إلى إزاحة شريط المتبرع المقابل. يستبدل تمديد الطرف 3 'من الشريط المكسور بواسطة بوليميراز الحمض النووي القواعد التي فقدت أثناء حدث تلف الحمض النووي ويعزز حل وسيط الحلقة D الممتد إلى منتج dsDNA من خلال تلدين الشريط المعتمد على التوليف (SDSA) ، أو تقاطع هوليداي المزدوج (dHJ) ، أو المسارات الفرعية HR للتكرار الناجم عن الكسر (BIR).

تسمح الفحوصات التي تراقب فعليا المواد الوسيطة في مسار الموارد البشرية بتحليل المتطلبات الجينية لكل خطوة (أي تحليل المسار). يتم ملاحظة تكوين DSB ، والاستئصال النهائي ، و dHJs ، وفقاعات تكرار BIR ، ومنتجات الموارد البشرية بسهولة بواسطة النشاف الجنوبي3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فشل النشاف الجنوبي في الإبلاغ عن حلقات D الناشئة والممتدة ، وبالتالي ، يلزم وجود طريقة بديلة لقياس جزيئات المفاصل هذه بشكل موثوق4،8،9. إحدى الاستراتيجيات المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تكوين الحلقة D الوليدة هي الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ل Rad51 إلى جانب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) 10,11. ومع ذلك ، فإن ارتباط Rad51 مع dsDNA كما تم قياسه بواسطة ChIP-qPCR مستقل عن تماثل التسلسل وعامل ملحق Rad51 Rad5410,11. في المقابل ، تعتمد الإشارة الملموسة باستخدام طريقة تحليل الحلقة D المعروضة هنا ، والتي تسمى مقايسة التقاط الحلقة D (DLC) ، على تكوين DSB ، وتماثل التسلسل ، و Rad51 ، وبروتينات ملحق Rad51 Rad52 و Rad548. إن اكتشاف أن تكوين حلقة D المروج ل Saccharomyces cerevisiae Rad51 يعتمد على Rad54 في الجسم الحي يتفق مع العديد من تجارب إعادة التكوين في المختبر التي تشير إلى أن Rad54 مطلوب للبحث عن التماثل وتشكيل حلقة D بواسطة الخميرة الناشئة Rad518،12،13،14،15.

النهج الحالية لقياس امتداد الحلقة D ، في المقام الأول من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي ، هي إشكالية بالمثل. تعمل المقايسة النموذجية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن امتداد الحلقة D على تضخيم تسلسل فريد ، ناتج عن إعادة التركيب بين موقع الكسر والمتبرع خارج الرحم وتخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب اللاحق ، عبر تمهيدي في المنبع لمنطقة التماثل على الشريط المكسور والتمهيدي الآخر في اتجاه مجرى منطقة التماثل على الشريط المانح. باستخدام هذه الطريقة ، يتطلب الكشف عن تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب عامل معالجة Pol δ غير الأساسي Pol3216. تتعارض هذه النتيجة مع ملاحظة أن حذف POL32 له تأثير خفيف فقط على تحويل الجينات في الجسم الحي17. علاوة على ذلك ، تفشل هذه المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في حل امتداد الحلقة D وتشكيل منتج BIR مؤقتا ، مما يشير إلى أن الإشارة تنتج عن منتجات dsDNA بدلا من وسيطة ssDNA17،18،19. تم تطوير مقايسة تمديد الحلقة D (DLE) مؤخرا لمعالجة هذه التناقضات. يحدد اختبار DLE تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب في موقع ~ 400 زوج أساسي (bp) في اتجاه مجرى النهر من النهاية الغازية الأولية3 '9. بهذه الطريقة ، يكون امتداد الحلقة D مستقلا عن Pol32 ويمكن اكتشافه في غضون 4 ساعات بعد تحريض DSB ، بينما يتم ملاحظة منتجات BIR لأول مرة في 6 ساعات. في الواقع ، أشار منشور حديث من مختبرات هابر ومالكوفا إلى أن استخدام هذه الطريقة في تحضير الحمض النووي الجينومي يؤدي بشكل فريد إلى الحفاظ على ssDNA 9,20.

هنا ، يتم وصف مقايسات DLC و DLE بالتفصيل. تعتمد هذه المقايسات على ربط القرب للكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة في S. cerevisiae (الشكل 2) 8,9. يمكن قياس كمية منتجات BIR باستخدام نفس نظام المقايسة. بالنسبة لكلا الفحصين ، يتم تحفيز تكوين DSB في موقع قطع نوكلياز HO الموجود في موضع URA3 على الكروموسوم (Chr.) V من خلال التعبير عن نوكلياز HO تحت سيطرة مروج محفز للجالاكتوز. يؤدي غزو حبلا الحمض النووي بوساطة Rad51 إلى تكوين حلقة D ناشئة في موقع متبرع خارج الرحم يقع في موضع LYS2 في Chr. II. نظرا لأن الجانب الأيمن من DSB يفتقر إلى التماثل مع المتبرع ، فإن الإصلاح عبر SDSA وتشكيل dHJ غير ممكن. من الممكن إجراء إصلاح أولي لجهاز DSB بواسطة BIR ، ولكن يتم تثبيط تكوين منتجات قابلة للحياة من خلال وجود centromere21. يمنع هذا التصميم المتعمد إصلاح DSB الإنتاجي ، وبالتالي تجنب استئناف النمو بواسطة الخلايا ذات DBSs التي تم إصلاحها ، والتي يمكن أن تتجاوز الثقافة أثناء تحليل الدورة الزمنية.

في مقايسة DLC ، يحافظ تشابك السورالين لشريطي الحمض النووي غير المتجانس داخل الحلقة D على وسيط إعادة التركيب. بعد استعادة موقع إنزيم التقييد على الشريط المكسور (المستأصل) والهضم ، يسمح التشابك بربط التسلسلات الفريدة في المنبع للحمض النووي المتماثل المكسور والمتبرع. باستخدام qPCR ، يتم تحديد مستوى جزيء الحمض النووي الخيمري الموجود في كل عينة. في فحص DLE ، لا يلزم التشابك ، واستعادة موقع إنزيم التقييد والهضم متبوعا بالربط داخل الجزيئات بدلا من ذلك يربط نهاية 5 'من الجزيء المكسور بنهاية 3' الممتدة حديثا. مرة أخرى ، يتم استخدام qPCR لتحديد الكميات النسبية لهذا المنتج الوهمي في كل عينة. في حالة عدم استعادة موقع إنزيم التقييد ، يبلغ اختبار DLE عن المستويات النسبية لمنتج BIR (dsDNA) الذي يتم تشكيله بعد تمديد الحلقة D.

يتم عرض النتائج التمثيلية لكل اختبار باستخدام سلالة من النوع البري ، ويتم إحالة القراء إلى Piazza et al.8 و Piazza et al.9 لاستخدام هذه المقايسات لتحليل طفرات إعادة التركيب 8,9. الغرض من هذه المساهمة هو تمكين المختبرات الأخرى من اعتماد مقايسات DLC و DLE ، والدعم متاح عند الطلب.

Protocol

1. ما قبل النمو ، تحريض DSB ، وجمع العينات

ملاحظة: يوصى بمكملات جميع الوسائط التي تحتوي على 0.01٪ أدينين لسلالات Ade.

  1. قم بإخراج السلالات الفردية المناسبة (انظر الجدول 1) على خميرة بيبتون سكر العنب الأدينين (YPDA) (مستخلص الخميرة 1٪ ، 2٪ ببتون ، 2٪ جلوكوز ، 2٪ أجار ، 0.001٪ أدينين) وتنمو لمدة يومين عند 30 درجة مئوية.
  2. استخدم مستعمرة واحدة لتلقيح 5 مل من YPDA في أنبوب زراعة زجاجي سعة 15 مل. تنمو الثقافات إلى التشبع عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز أو الدوران للتهوية.
  3. مقايسة DLC: قم بإعداد محلول مخزون السورالين 5x (0.5 مجم / مل ثلاثي أوكسالين في إيثانول مقاوم 200) في غطاء دخان عن طريق إذابة السورالين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ملفوف بورق الألمنيوم طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز أو انعكاس مستمر. ختم أعلى المسمار مع فيلم شفاف لمنع التبخر. لا تحضر أكثر من 7 مل من محلول مخزون السورالين 5x لكل أنبوب مخروطي سعة 50 مل لضمان الذوبان السليم للسورالين.
  4. في اليوم التالي ، استخدم 5 مل من مزرعة YPDA المزروعة طوال الليل لتلقيح 50-100 مل من YEP-lactate (1٪ مستخلص خميرة ، 2٪ ببتون ، 2٪ وزن / وزن لاكتات ، 0.001٪ أدينين) في قارورة ذات حجم مناسب (تنمو الخميرة الناشئة على النحو الأمثل في قارورة لا تقل عن 5 أضعاف حجم الثقافة) إلىOD 600 من ~ 0.03.
  5. تنمو الثقافة لمدة ~ 16 ساعة عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. بعد ~ 16 ساعة ، قم بقياس OD600 للثقافة ويجب أن يكون ~ 0.5-0.8. لا تستخدم الثقافات المتخلفة أو المتضخمة.
  6. لكل نقطة زمنية ، اجمع الحجم المناسب للخلايا في أنبوب مخروطي وضعه على الجليد. عادة ما يكون هذا 1 × 108 خلايا (حوالي 7.5 مل من الثقافة عند OD 600 1.0 لسلالة برية أحادية الصيغة الصبغية) لمقايسة DLC و 5 × 107 خلايا (حوالي 2.5 مل من الثقافة عند OD600 1.0) لفحص DLE.
  7. لضمان دقة قيم OD 600 ، قم بإعداد تخفيفات 1: 5 للثقافات باستخدام OD600≥0.2 للحفاظ على قراءة OD عند 0.2 أو أقل. بالنسبة للسلالات من النوع البري ، تتراوح النقاط الزمنية المثلى لتحليل DLC بين 2 ساعة و 6 ساعات ، والنقاط الزمنية المثلى لتحليل DLE بين 4 ساعات و 8 ساعات (انظر الشكل 3 والشكل 4).
  8. مقايسة DLC
    1. قبل كل نقطة زمنية ، قم بإعداد ما يكفي من محلول 1x psoralen (0.1 مجم / مل ثلاثي أوكسسالين ، 50 مللي مول Tris-HCl pH 8.0 ، 50 mM EDTA pH 8.0 ، 20٪ إيثانول) في غطاء دخان لجميع العينات في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ملفوف بورق الألمنيوم. غادر في RT.
    2. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 2500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الحبيبات في 2.5 مل من محلول 1x psoralen في غطاء دخان وانقلها إلى طبق بتري 60 مم × 15 مم. بدلا من ذلك، أعد تعليق الحبيبات في 2.5 مل من محلول TE1 (50 مللي متر Tris-HCl pH 8.0، 50 mM EDTA pH 8.0) للتحكم في عدم التشابك.
    3. ربط العينات. للحصول على رابط متشابك للأشعة فوق البنفسجية يتناسب مع المصابيح طويلة الموجة (365 نانومتر) ، ضع أطباق بتري على بعد 1-2 سم أسفل مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع إزالة الغطاء فوق لوح بلاستيكي أو زجاج شبكي تم تبريده مسبقا عند -20 درجة مئوية. بالنسبة لصندوق ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، ضع أطباق بتري مباشرة فوق مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية. فضح العينات لمدة 10 دقائق مع رج لطيف.
      ملاحظة: يوصى بضبط مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية فوق شاكر مداري تم ضبطه على ~ 50 دورة في الدقيقة.
    4. في غطاء الدخان ، انقل العينة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. اشطف طبق بتري ب 2.5 مل من محلول TE1 وأضفه إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 2500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، والتخلص بشكل صحيح من المادة الطافية ، وتخزين الحبيبات عند -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  9. فحص DLE
    1. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 2500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل حبيبات الخلية في 2.5 مل من محلول TE1 البارد قبل تكرار الدوران وتخزين الكريات عند -20 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 1 أسبوع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  10. لجمع العينات في 0 ساعة ، اجمع العينات قبل إضافة 20٪ جالاكتوز. بالنسبة للنقاط الزمنية اللاحقة ، حث تكوين DSB عن طريق إضافة 20٪ جالاكتوز إلى الثقافات إلى تركيز نهائي قدره 2٪. اجمع العينات المتبقية كما هو موضح أعلاه ، والحبيبات ، والتجميد بالنسبة للوقت بعد تحريض DSB (أي ، يتم جمع عينة 4 ساعات بعد 4 ساعات من إضافة 20٪ جالاكتوز).

2. كروية الخلية ، تحلل ، واستعادة موقع التقييد

  1. قم بإذابة العينات على الجليد. سخني حماما جافا إلى 30 درجة مئوية.
  2. أعد تعليق العينات في 1 مل من المخزن المؤقت للسفع الكروي (0.4 M سوربيتول ، 0.4 M KCl ، 40 mM محلول فوسفات الصوديوم pH 7.2 ، 0.5 mM MgCl2) ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
  3. أضف 3.5 ميكرولتر من محلول زيمولياز (2٪ جلوكوز، 50 ملي مول تريس-هيدروكلورايد درجة حموضة 7.5، 5 ملغم/مل زيمولياز 100T؛ 17.5 ميكروغرام/مل تركيز زيمولياز النهائي). امزج برفق عن طريق النقر أو العكس. احتضنها على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم ضعها على الثلج. خلال فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة ، احصل على النيتروجين السائل أو الثلج الجاف.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 2500 × جم عند 4 درجات مئوية ووضع العينات على الجليد. اغسل العينات 3x في 1 مل من المخزن المؤقت للسفع الكروي. أجهزة الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 2500 × جم عند 4 درجات مئوية.
  5. أعد تعليق العينات في 1 مل من محلول إنزيم التقييد البارد 1x (50 مللي مول من أسيتات البوتاسيوم ، 20 مللي مول من أسيتات Tris-acetate ، 10 مللي مول من أسيتات المغنيسيوم ، 100 ميكروغرام / مل من درجة الحموضة BSA ~ 8.0 عند RT) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية. ضع العينات على الثلج. كرر الغسيل 1x.
  6. أعد تعليق العينات في 1 مل من محلول إنزيم التقييد البارد 1x. قسم العينة (0.5 مل لكل منهما) إلى أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي للعينات لمدة 3 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  7. أعد تعليق أنبوب واحد من كل عينة في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم تقييد 1.4x مع تهجين oligos (انظر الجدول 2) وأنبوب واحد في 180 ميكرولتر من محلول إنزيم تقييد 1.4x دون تهجين oligos. يتم إعادة تعليق كل أوليجو مهجن في 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0 ، 1 mM EDTA pH 8.0) ويستخدم بتركيز نهائي قدره 7 نانومتر. يحل 1x TE محل oligos المهجن في المخزن المؤقت لإنزيم التقييد 1.4x دون تهجين oligos.
    ملاحظة: يجب تخزين oligos المهجنة عند -20 درجة مئوية في حصص صغيرة عند تخفيف العمل. قد يتطلب تركيز oligos المهجن التحسين ؛ انظر المناقشة.
  8. قم بتجميد العينات في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف / الإيثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية. يمكن تخزين العينات في هذه المرحلة لعدة أشهر.

3. هضم إنزيم التقييد والربط داخل الجزيئات

  1. قم بإذابة العينات على الجليد. سخني حماما جافا إلى 65 درجة مئوية وآخر إلى 37 درجة مئوية.
  2. ماصة 36 ميكرولتر من العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل على الجليد. أعد العينة المتبقية على الفور إلى -80 درجة مئوية للتخزين.
  3. أضف 4 ميكرولتر من 1٪ SDS (تركيز نهائي 0.1٪) واخلطه عن طريق النقر برفق على جانب الأنبوب. احتضنها على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بنقرة لطيفة كل 5 دقائق. ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة.
    ملاحظة: يعزز علاج SDS هذا تمسخ البروتينات المرتبطة بالحمض النووي ، وإذابة الغلاف النووي ، وإمكانية الوصول إلى الكروماتين قبل هضم إنزيم التقييد وخطوات الربط داخل الجزيئات.
  4. أضف 4.5 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 (تركيز نهائي 1٪) واخلطه عن طريق السحب. أضف 20-50 وحدة من إنزيم التقييد (EcoRI-HF أو HindIII-HF) إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع تقليب لطيف كل 20-30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، سخن حماما جافا إلى 55 درجة مئوية واضبط حماما مائيا مسبقا على 16 درجة مئوية.
  5. أضف 8.6 ميكرولتر من 10٪ SDS (تركيز نهائي 1.5٪) إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب والتنصت. احتضان عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 80 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 (تركيز نهائي 6٪) إلى كل عينة واخلطها عن طريق السحب.
  6. أضف 660 ميكرولتر من مخزن ربط 1x بدون ATP (50 mM Tris-HCl pH 8.0 ، 10 mM MgCl 2 ، 10 mM DTT ،2.5 ميكروغرام / مل BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA ligase (8 U / عينة) إلى كل عينة واخلطها عن طريق الانقلاب اللطيف. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع انعكاس كل 30 دقيقة. ضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة.

4. تنقية الحمض النووي

  1. سخني حماما جافا إلى 65 درجة مئوية وآخر إلى 37 درجة مئوية. أضف 1 ميكرولتر من 10 ملغم/مل من بروتيناز K (محضر في 1x TE pH 8.0) إلى كل عينة (تركيز نهائي 12.5 ميكروغرام/مل). احتضنها على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وضع العينات على الثلج مباشرة بعد الحضانة حتى تبرد.
  2. نقل العينات إلى أنابيب 2 مل. العمل في غطاء الدخان ، أضف حجما متساويا (~ 800 ميكرولتر) من كحول الفينول / الكلوروفورم / الأيزو أميل (P / C / IA ؛ درجة الحموضة 8.0) لكل عينة. دوامة العينات ل ~ 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 5-10 دقائق في 16000 × ز في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.
  3. قم بإزالة 600 ميكرولتر بعناية من المرحلة العليا من كل عينة في أنبوب جديد سعة 1.5 مل. تخلص بشكل صحيح من المرحلة السفلية وأنابيب 2 مل.
  4. ترسب الحمض النووي بإضافة حجم 1/10 من 3 M أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 5.2 (~ 60 ميكرولتر) إلى كل عينة ، تليها 1 حجم من الأيزوبروبانول (~ 660 ميكرولتر). اقلب العينات 5x-10x واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  5. ضع العينات على الثلج لمدة 2 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 16500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دقيق. أعد العينات إلى الثلج ، واسكب المادة الطافية ، وصفي الأنبوب على منشفة ورقية.
  6. اغسل حبيبات الحمض النووي ب 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. جهاز طرد مركزي على 16500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ضع العينات مرة أخرى على الثلج ، واسكب المادة الطافية ، وأزل الكحول المتبقي باستخدام ماصة. جفف العينات مع فتح أغطية الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة.
  7. أعد تعليق كريات الحمض النووي في 50 ميكرولتر من 1x TE عن طريق الدوامة. احتضن في RT لمدة 30 دقيقة ، دوامة ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية في حمام جاف لمدة 30 دقيقة. دوامة العينات مرة أخرى ، ثم وضعها على الجليد. يمكن تخزين العينات في هذه المرحلة عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر ، ولكن ينصح بالمتابعة على الفور لخطوات فك الارتباط (DLC فقط) و qPCR.

5. عكس الارتباط المتقاطع Psoralen (لفحص DLC فقط)

  1. ماصة 9 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى في أنبوب PCR على الجليد. أضف 1 ميكرولتر من 1 M KOH (تركيز نهائي 0.1 M). احتضان العينات عند 90 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في دراجة حرارية.
  2. أضف 19.73 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم (0.1 م أسيتات الصوديوم ، 9.6 مللي مول Tris-HCl pH 8.0 ، 1.0 mM EDTA pH 8.0). يمكن تخزين العينات في هذه المرحلة عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر ، ولكن ينصح بالمتابعة فورا إلى خطوة qPCR.

6. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي والضوابط والتحليل

  1. باستخدام 2 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى ، مع أو بدون تشابك ، قم بإعداد تفاعل qPCR 20 ميكرولتر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد كل تفاعل من نسختين. لكل من مقايسات DLC و DLE ، هناك خمسة تفاعلات تحكم وتفاعل تكميمي DLC / DLE واحد ، أو ما مجموعه ستة تفاعلات لكل عينة ، تعمل في نسختين. يوفر الجدول التكميلي S1 والجدول التكميلي S2 نموذجا لإعداد هذه التفاعلات والتحليل ، ويتم سرد تسلسلات بادئات qPCR في الجدول 3.
  2. يجب تحسين ظروف ركوب الدراجات qPCR لكل مجموعة qPCR.
    1. استخدم شروط qPCR DLC التالية ، اعتمادا على مجموعات qPCR المستخدمة: التمسخ الأولي (95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ؛ 50 جولة تضخيم (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 61 درجة مئوية لمدة 25 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية مع اكتساب واحد) ؛ تحليل منحنى الذوبان (95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 97 درجة مئوية مع اكتساب مستمر) ؛ والتبريد (37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية).
    2. استخدم شروط qPCR التالية لفحص DLE: تمسخ أولي (95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) ؛ 50 جولة من التضخيم (95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية مع اكتساب واحد) ؛ تحليل منحنى الذوبان (95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 97 درجة مئوية مع اكتساب مستمر) ؛ والتبريد (37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية). لاحظ أنه قد تكون هناك حاجة إلى تحسين أجهزة / مجموعات qPCR المختلفة.
  3. مقايسة DLC
    1. الضوابط: انظر قائمة بادئات qPCR في الجدول 3. تظهر خريطة لمواقع ربط التمهيدي في الشكل S1. بالنسبة لملفات التسلسل التكميلية للميزات الجينومية والأمبليكونات ذات الصلة ، تحقق من ملفات محرر البلازميد (ApE) ؛ ملفات التسلسل التكميلية 1-5.
      1. الحمض النووي الجينومي في ARG4: استخدم olWDH1760 / olWDH1761 لتضخيم dsDNA الموجود في ARG4. استخدم هذا التفاعل كعنصر تحكم في التحميل وقم بتطبيع جميع التفاعلات الأخرى باستثناء تفاعل إشارة DLC لعنصر التحكم هذا.
      2. كفاءة الربط داخل الجزيئات في DAP2: استخدم جزء 1,904 bp الذي تم إنشاؤه بواسطة هضم EcoRI للربط داخل الجزيئات بالتوازي مع ربط DLC. يقدم التضخيم عبر وصلة الربط هذه تقارير عن كفاءة الربط داخل الجزيئات ويعمل كعنصر تحكم يتم فيه تطبيع إشارة DLC.
      3. تحريض DSB: استخدم olWDH1766 / olWDH1767 لتضخيم منطقة تمتد عبر DSB المستحث.
      4. التشابك والاستئصال من Psoralen: استخدم olWDH2019 / olWDH2020 لتضخيم منطقة PhiX الفريدة في اتجاه مجرى موقع التعرف على EcoRI. بدون انعكاس الارتباط المتقاطع ، استخدم نسبة ssDNA (بدون ارتباط متشابك) على ARG4 (dsDNA المتشابك) لتحديد كفاءة التشابك. مع انعكاس الارتباط المتقاطع ، سيؤدي الاستئصال إلى انخفاض تدريجي من 1 إلى 0.5 من الإشارة بالنسبة إلى ARG4.
      5. إيكور استعادة موقع التعرف على I وقطعه: استخدم olWDH1768 / olWDH1764 لتضخيم منطقة تمتد عبر موقع التعرف على EcoRI المستعاد في المنبع من DSB على الشريط المستأصل. olWDH1769 / olWDH1763 تضخيم المنطقة التي تمتد على موقع إنزيم تقييد EcoRI في DAP2. قم بإجراء انقسام EcoRI في هذا الموقع لاستخدامه كتحكم في الربط داخل الجزيئات.
    2. إشارة DLC: استخدم olWDH1764 / olWDH1765 لتضخيم جزيء الحمض النووي الخيمري الناتج عن الربط داخل الجزيئات للشريط المقطوع (الغازي) والمتبرع.
    3. التحليل: احسب المتوسط والانحراف المعياري لقيم Cp لكل من التفاعلات المكررة. استخدم قيم الحمض النووي الجينومي ARG4 qPCR Cp كمرجع لتطبيع جميع qPCRs التحكم الأخرى. تطبيع إشارة DLC إلى التحكم في الربط داخل الجزيئات في DAP2. انظر الشكل 3 لمعرفة قيم إشارة DLC النموذجية عند 2 ساعة.
  4. فحص DLE
    1. الضوابط: انظر قائمة بادئات qPCR في الجدول 3. تظهر خريطة لمواقع ربط التمهيدي في الشكل S1. بالنسبة لملفات التسلسل التكميلية للميزات والأمبليدات الجينومية ذات الصلة ، تحقق من ملفات محرر البلازميد (ApE) (ملفات التسلسل التكميلية 1-5).
      1. الحمض النووي الجينومي في ARG4: انظر القسم 6.3.1.1.
      2. كفاءة الربط داخل الجزيئات عند YLR050C: استخدم عملية الهضم HindIII لإنشاء جزء 765 bp الذي سيخضع للربط داخل الجزيئات بالتوازي مع ربط DLE. يقدم التضخيم عبر وصلة الربط هذه تقارير عن كفاءة الربط داخل الجزيئات ويعمل كعنصر تحكم يتم فيه تطبيع إشارة DLE.
      3. تحريض جهاز تسوية المنازعات: انظر القسم 6.3.1.3.
      4. هند استعادة وقطع موقع التعرف III: استخدم olWDH2010 / olWDH2012 و olWDH2009/2011 لتضخيم منطقة تمتد عبر مواقع إنزيم تقييد HindIII على الشريط المكسور حيث تم استئصاله وتوسيعه ، على التوالي.
    2. إشارة DLE: استخدم olWDH2009 / olWDH2010 لتضخيم جزيء الحمض النووي الخيمري الناتج عن الربط داخل الجزيئات للنهاية المقطوعة للشريط الغازي في المنبع من DSB إلى الطرف الموسع حديثا في اتجاه مجرى DSB.
    3. التحليل: احسب المتوسط والانحراف المعياري لقيم Cp لكل من التفاعلات المكررة. استخدم قيم الحمض النووي الجينومي ARG4 qPCR Cp كمرجع لتطبيع جميع qPCRs التحكم الأخرى. تطبيع إشارة DLE إلى التحكم في الربط داخل الجزيئات في YLR050C. تم الإبلاغ عن قيم إشارة DLE النموذجية عند 6 ساعات في الشكل 4 والمنشورات السابقة9.

النتائج

مقايسة DLC
يكتشف اختبار DLC كلا من حلقات D الناشئة والموسعة التي تشكلت من خلال غزو DSB خاص بالموقع إلى متبرع واحد (الشكل 2). يربط تشابك Psoralen جسديا الشريط المكسور والمتبرع عبر الحمض النووي غير المتجانس داخل الحلقة D. تسمح استعادة موقع إنزيم التقييد باستخدام oligo طويل...

Discussion

تسمح المقايسات المقدمة بالكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة (مقايسة DLC) ، وتمديد الحلقة D (مقايسة DLE) ، وتشكيل منتج BIR (مقايسة DLE بدون تهجين قليل النيوكليوتيدات) باستخدام ربط القرب و qPCR. تم استخدام ChIP-qPCR ل Rad51 إلى مواقع بعيدة عن DSB سابقا كوكيل للبحث عن التماثل بوساطة Rad51 وتشكيل الحلقة D. ومع ذلك ، فإن...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يتم دعم العمل في مختبر هاير من خلال المنح GM58015 و GM137751 إلى W.-D.H. يتم دعم البحث في مختبر Piazza من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-StG 3D-loop ، الاتفاقية الكبرى 851006). يتم دعم D.R. من قبل T32CA108459 ومؤسسة AP Giannini. نشكر Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) على مشاركة نتائج فحص DLC / DLE الخاصة به وللتحقق من صحة التغييرات التي تم إجراؤها على المقايسات المفصلة في هذا البروتوكول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottomSuggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shakerSuggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrupSigma-AldrichL1375For media preparation
AgarFisherBP1423500For media preparation
Bacto peptoneBD Difco211840For media preparation
Bacto yeast extractBD Difco212750For media preparation
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4For media preparation
TrioxsalenSigma-AldrichT6137For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, whiteRoche472969200196-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR kit used by the authors

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187 D Rad51

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved