Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

Riepilogo

I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

I danni al DNA, comprese le rotture a doppio filamento del DNA e i legami incrociati tra filamenti, subiti durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare possono essere riparati mediante ricombinazione omologa (HR). Inoltre, HR rappresenta un importante meccanismo di salvataggio della forcella di replica dopo lo stallo o il collasso. La regolazione dei molti passi reversibili e irreversibili di questo complesso percorso ne promuove la fedeltà. L'analisi fisica degli intermedi di ricombinazione formati durante la HR consente la caratterizzazione di questi controlli da parte di vari fattori nucleoproteici e dei loro interattori. Sebbene esistano metodi consolidati per analizzare eventi specifici e intermedi nel percorso di ricombinazione, il rilevamento della formazione e dell'estensione del D-loop, due passaggi critici in questo percorso, si è dimostrato difficile fino a poco tempo fa. Qui vengono descritti metodi efficienti per rilevare eventi chiave nel percorso HR, vale a dire la formazione di rottura a doppio filamento del DNA, la formazione del D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione di prodotti tramite replicazione indotta da rottura (BIR) in Saccharomyces cerevisiae . Questi test rilevano i loro intermedi di ricombinazione rilevanti e prodotti ad alta sensibilità e sono indipendenti dalla vitalità cellulare. Il rilevamento di D-loop, estensione D-loop e il prodotto BIR si basa sulla legatura di prossimità. Insieme, questi saggi consentono lo studio della cinetica della FC a livello di popolazione per affrontare con precisione le funzioni delle proteine HR e dei regolatori in fasi significative del percorso.

Introduzione

La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo ad alta fedeltà di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB), dei legami incrociati tra filamenti e delle lacune del ssDNA, nonché un percorso per la tolleranza al danno del DNA. L'HR differisce dai percorsi soggetti a errori per la riparazione/tolleranza al danno al DNA, come la giunzione finale non omologa (NHEJ) e la sintesi translesionale, in quanto utilizza un DNA duplex intatto e omologo come donatore per modellare l'evento di riparazione. Inoltre, molti degli intermedi chiave nel percorso HR sono reversibili, consentendo una regolazione squisita delle singole fasi del percorso. Durante le fasi S, G2 e M del ciclo cellulare, HR compete con NHEJ per la riparazione dei DSB a due estremità¹. Inoltre, la HR è essenziale per la replicazione del DNA per la riparazione dei danni al DNA associati alla replicazione, comprese le lacune del ssDNA e le DSB unilaterali, e come meccanismo di bypass della lesione del DNA².

Un intermedio critico nel percorso HR è il ciclo di spostamento, o D-loop (Figura 1). Dopo la resezione finale, la ricombinasi centrale nella reazione, Rad51, si carica sul ssDNA appena resecato della molecola rotta, formando un filamento elicoidale². Rad51 effettua quindi una ricerca di omologia per identificare un donatore omologo adatto, tipicamente il cromatide fratello nelle cellule somatiche. Il D-loop si forma quando il filamento Rad51-ssDNA invade un DNA duplex omologo, che porta all'accoppiamento di basi Watson-Crick del filamento rotto con il filamento complementare del donatore, spostando il filamento donatore opposto. L'estensione dell'estremità 3' del filamento rotto da parte di una DNA polimerasi sostituisce le basi che sono state perse durante l'evento di danno al DNA e promuove la risoluzione dell'intermedio esteso D-loop in un prodotto dsDNA attraverso la ricottura del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA), la giunzione a doppio Holliday (dHJ) o le sottovie HR di replicazione indotta da rottura (BIR).

I saggi che monitorano fisicamente gli intermedi nel percorso HR consentono l'analisi dei requisiti genetici per ogni fase (ad esempio, analisi del percorso). La formazione di DSB, la resezione finale, i dHJ, le bolle di replicazione BIR e i prodotti HR sono facilmente osservabili dal Southern blotting 3,4,5,6,7. Tuttavia, il Southern blotting non riesce a riferire sui D-loop nascenti ed estesi e, quindi, è necessario un metodo alternativo per misurare in modo affidabile queste molecole articolari ^4,8,9. Una strategia ampiamente utilizzata per analizzare la nascente formazione del D-loop è l'immunoprecipitazione cromatinica (ChIP) di Rad51 accoppiata con PCR quantitativa (qPCR)^10,11. Tuttavia, l'associazione di Rad51 con il dsDNA misurata da ChIP-qPCR è indipendente dall'omologia di sequenza e dal fattore accessorio Rad51 Rad54^10,11. Al contrario, un segnale apprezzabile che utilizza il metodo di analisi D-loop qui presentato, chiamato saggio di acquisizione D-loop (DLC), dipende dalla formazione di DSB, dall'omologia di sequenza, da Rad51 e dalle proteine accessorie Rad51 Rad52 e Rad54⁸. La scoperta che la formazione di D-loop promossa da Rad51 da Saccharomyces cerevisiae dipende da Rad54 in vivo è in accordo con numerosi esperimenti di ricostituzione in vitro che indicano che Rad54 è necessario per la ricerca di omologia e la formazione di D-loop da parte del lievito in erba Rad51 8,12,13,14,15.

Gli attuali approcci per misurare l'estensione del D-loop, principalmente attraverso la PCR semi-quantitativa, sono altrettanto problematici. Un tipico test basato sulla PCR per rilevare l'estensione del D-loop amplifica una sequenza unica, risultante dalla ricombinazione tra un sito di rottura e un donatore ectopico e dalla successiva sintesi del DNA associata alla ricombinazione, tramite un primer a monte della regione di omologia sul filamento rotto e un altro primer a valle della regione di omologia sul filamento donatore. Utilizzando questo metodo, la rilevazione della sintesi del DNA associata alla ricombinazione richiede il fattore di processività Pol32¹⁶ non essenziale δ Pol32. Questa scoperta è in conflitto con l'osservazione che la delezione di POL32 ha solo un lieve effetto sulla conversione genica in vivo¹⁷. Inoltre, questi test basati sulla PCR non riescono a risolvere temporalmente l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto BIR, suggerendo che il segnale deriva da prodotti dsDNA piuttosto che da intermedi ssDNA^17,18,19. Il test di estensione D-loop (DLE) è stato recentemente sviluppato per risolvere queste discrepanze. Il test DLE quantifica la sintesi del DNA associata alla ricombinazione in un sito ~ 400 coppie di basi (bp) a valle dell'iniziale 3' invasione fine⁹. Con questo metodo, l'estensione del D-loop è indipendente da Pol32 ed è rilevabile entro 4 ore dall'induzione post-DSB, mentre i prodotti BIR vengono osservati per la prima volta a 6 ore. Infatti, una recente pubblicazione dei laboratori Haber e Malkova ha osservato che l'uso di questo metodo di preparazione del DNA genomico porta singolarmente alla conservazione del ssDNA ^9,20.

Qui, i test DLC e DLE sono descritti in dettaglio. Questi saggi si basano sulla legatura di prossimità per rilevare le anse D nascenti ed estese in S. cerevisiae (Figura 2)^8,9. I prodotti BIR possono essere quantificati utilizzando lo stesso sistema di analisi. Per entrambi i test, la formazione di DSB in un sito di taglio dell'endonucleasi HO situato nel locus URA3 sul cromosoma (Chr.) V è indotta dall'espressione dell'endonucleasi HO sotto il controllo di un promotore inducibile dal galattosio. L'invasione del filamento di DNA mediata da Rad51 porta alla nascente formazione di D-loop nel sito di un donatore ectopico situato nel locus LYS2 su Chr. II. Poiché il lato destro del DSB manca di omologia con il donatore, la riparazione tramite SDSA e formazione di dHJ non è fattibile. La riparazione iniziale del DSB da parte di BIR è possibile, ma la formazione di prodotti vitali è inibita dalla presenza del centromero²¹. Questo disegno deliberato impedisce la riparazione produttiva del DSB, evitando così la ripresa della crescita da parte delle cellule con DBS riparati, che altrimenti potrebbero superare la coltura durante l'analisi del decorso temporale.

Nel test DLC, la reticolazione psoralenica dei due filamenti del DNA eteroduplex all'interno del D-loop preserva l'intermedio di ricombinazione. Dopo il ripristino del sito enzimatico di restrizione sul filamento rotto (resecato) e la digestione, la reticolazione consente la legatura delle sequenze uniche a monte del DNA omologo rotto e donatore. Utilizzando la qPCR, viene quantificato il livello di molecola di DNA chimerico presente in ciascun campione. Nel test DLE, la reticolazione non è richiesta e il ripristino del sito enzimatico di restrizione e la digestione seguiti dalla legatura intramolecolare collegano invece l'estremità 5' della molecola rotta all'estremità 3' appena estesa. Ancora una volta, la qPCR viene utilizzata per quantificare le quantità relative di questo prodotto chimerico in ciascun campione. In assenza di ripristino del sito enzimatico di restrizione, il test DLE riporta i livelli relativi del prodotto BIR (dsDNA) che si forma dopo l'estensione del D-loop.

Vengono mostrati i risultati rappresentativi per ciascun test che utilizza un ceppo wild type, e i lettori sono rimandati a Piazza et al.8 e Piazza et al.9 per l'uso di questi saggi per l'analisi dei mutanti di ricombinazione ^8,9. L'intento di questo contributo è quello di consentire ad altri laboratori di adottare i saggi DLC e DLE, e il supporto per loro è disponibile su richiesta.

Protocollo

1. Pre-crescita, induzione DSB e raccolta di campioni

NOTA: L'integrazione di tutti i terreni con 0,01% di adenina è raccomandata per i ceppi di ade.

1. Striare i ceppi aploidi appropriati (vedi Tabella 1) su peptone destrosio adenina (YPDA) ( 1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% glucosio, 2% agar, 0,001% adenina) e crescere per 2 giorni a 30 °C.
2. Utilizzare una singola colonia per inoculare 5 ml di YPDA in un tubo di coltura di vetro da 15 ml. Coltivare colture fino alla saturazione a 30 °C con agitazione o rotazione per l'aerazione.
3. Saggio DLC: preparare la soluzione madre di psoralene 5x (0,5 mg/ml di triossalene in etanolo 200-proof) in una cappa aspirante sciogliendo lo psoralene in un tubo conico da 50 mL avvolto in un foglio di alluminio durante la notte a temperatura ambiente con agitazione o inversione continua. Guarnire il tappo a vite con una pellicola trasparente per evitare l'evaporazione. Non preparare più di 7 mL di 5x soluzione madre di psoralene per tubo conico da 50 mL per garantire la corretta dissoluzione dello psoralene.
4. Il giorno successivo, utilizzare 5 ml di coltura YPDA coltivata durante la notte per inoculare 50-100 ml di YEP-lattato (1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% p/p di lattato, 0,001% adenina) in un matraccio di dimensioni appropriate (il lievito in erba cresce in modo ottimale in un pallone che è almeno 5 volte il volume della coltura) a un OD₆₀₀ di ~ 0,03.
5. Coltivare la coltura per ~16 h a 30 °C agitando a 220 giri/min. Dopo ~ 16 h, misurare l'OD₆₀₀ della coltura e dovrebbe essere ~ 0,5-0,8. Non utilizzare colture insufficienti o troppo cresciute.
6. Per ogni punto temporale, raccogliere il volume appropriato di celle in un tubo conico e posizionarlo sul ghiaccio. Tipicamente, si tratta di 1 x 10⁸ cellule (circa 7,5 ml di coltura a OD 600 1,0 per un ceppo aploide wild type) per il test DLC e 5 x 10⁷ cellule (circa 2,5 ml di coltura a OD₆₀₀ 1,0) per il test DLE.
7. Per garantire l'accuratezza dei valori OD 600, preparare diluizioni 1:5 per colture con OD₆₀₀≥0,2 per mantenere la lettura OD a 0,2 o inferiore. Per i ceppi wild type, i punti temporali ottimali per l'analisi DLC sono compresi tra 2 h e 6 h, mentre i time point ottimali per l'analisi DLE sono compresi tra 4 h e 8 h (vedere Figura 3 e Figura 4).
8. Saggio DLC
   1. Prima di ogni punto temporale, preparare una quantità sufficiente di 1x soluzione di psoralene (0,1 mg/mL di triossalen, 50 mM di Tris-HCl pH 8,0, 50 mM di EDTA pH 8,0, etanolo al 20%) in una cappa aspirante per tutti i campioni in un tubo conico da 50 mL avvolto in un foglio. Esci a RT.
   2. Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 2,5 ml di soluzione di psoralene 1x in una cappa aspirante e trasferire in una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm. In alternativa, risospendere il pellet in 2,5 mL di soluzione di TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) per un controllo senza reticolazione.
   3. Crosslink i campioni. Per un reticolante UV compatibile con lampadine a onde lunghe (365 nm), posizionare le piastre di Petri 1-2 cm sotto la sorgente di luce UV con il coperchio rimosso sopra una lastra di plastica o plexiglass pre-raffreddata a -20 ° C. Per una scatola di luce UV, posizionare le piastre di Petri direttamente sopra la sorgente di luce UV. Esporre i campioni per 10 minuti agitando delicatamente.
      NOTA: Si consiglia di impostare la sorgente di luce UV su uno shaker orbitale impostato a ~ 50 giri / min.
   4. In una cappa aspirante, trasferire il campione in una nuova provetta da 15 ml. Risciacquare la capsula di Petri con 2,5 mL di soluzione di TE1 e aggiungerla al tubetto. Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C, smaltire correttamente il surnatante e conservare il pellet a -20 ° C. I campioni possono essere conservati fino a 1 settimana prima di passare alla fase successiva.
9. Saggio DLE
   1. Centrifugare i campioni a 2.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare il pellet cellulare in 2,5 ml di soluzione fredda di TE1 prima di ripetere la centrifuga e conservare il pellet a -20 °C. I campioni possono essere conservati per un massimo di 1 settimana prima di passare alla fase successiva.
10. Per la raccolta dei campioni a 0 ore, raccogliere i campioni prima dell'aggiunta del 20% di galattosio. Per i timepoint successivi, indurre la formazione di DSB aggiungendo il 20% di galattosio alle colture a una concentrazione finale del 2%. Raccogliere i campioni rimanenti come descritto sopra, pellet e congelare rispetto al tempo post-induzione DSB (cioè, il campione di 4 ore viene raccolto 4 ore dopo l'aggiunta del 20% di galattosio).

2. Sferoplastica cellulare, lisi e ripristino del sito di restrizione

1. Scongelare i campioni sul ghiaccio. Preriscaldare un bagno asciutto a 30 °C.
2. Risospendere i campioni in 1 mL di tampone sferoplastico (0,4 M sorbitolo, 0,4 M KCl, 40 mM tampone fosfato di sodio pH 7,2, 0,5 mM MgCl₂) e trasferire in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
3. Aggiungere 3,5 μL di soluzione di zimolyasi (glucosio al 2%, 50 mM di Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/mL di zimolyasi 100T; concentrazione finale di 17,5 μg/mL di zimolyasi). Mescolare delicatamente picchiettando o capovolgendo. Incubare a 30 °C per 15 minuti, quindi mettere su ghiaccio. Durante i 15 minuti di incubazione, ottenere azoto liquido o ghiaccio secco.
4. Centrifugare per 3 minuti a 2.500 x g a 4 °C e posizionare i campioni su ghiaccio. Lavare i campioni 3 volte in 1 mL di tampone sferoplastrico. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 2.500 x g a 4 °C.
5. Risospendere i campioni in 1 mL di tampone enzimatico di restrizione 1x freddo (50 mM acetato di potassio, 20 mM di tris-acetato, 10 mM di acetato di magnesio, 100 μg/mL BSA pH ~8,0 a RT) e centrifugare per 3 minuti a 16.000 x g a 4 °C. Posizionare i campioni sul ghiaccio. Ripetere il lavaggio 1x.
6. Risospendere i campioni in 1 mL di tampone enzimatico di restrizione freddo 1x. Dividere il campione (0,5 ml ciascuno) in due provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Centrifugare i campioni per 3 minuti a 16.000 x g a 4 °C.
7. Risospendere una provetta da ciascun campione in 180 μL di tampone enzimatico di restrizione 1,4x con oligo ibridanti (vedere Tabella 2) e una provetta in 180 μL di tampone enzimatico di restrizione 1,4x senza oligo ibridanti. Ogni oligo ibridante viene risospeso in 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) e utilizzato ad una concentrazione finale di 7 nM. L'1x TE sostituisce gli oligo ibridanti nel tampone enzimatico di restrizione 1,4x senza oligo ibridanti.
   NOTA: Gli oligo ibridanti devono essere conservati a −20 °C in piccole aliquote alla diluizione di lavoro. La concentrazione degli oligo ibridanti può richiedere un'ottimizzazione; vedi Discussione.
8. Congelare i campioni in azoto liquido o ghiaccio secco/etanolo e conservare a -80 °C. I campioni possono essere conservati in questa fase per diversi mesi.

3. Digerimento enzimatico di restrizione e legatura intramolecolare

1. Scongelare i campioni sul ghiaccio. Preriscaldare un bagno secco a 65 °C e un altro a 37 °C.
2. Pipet 36 μL del campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio. Riportare immediatamente il campione rimanente a -80 °C per la conservazione.
3. Aggiungere 4 μL di SDS all'1% (concentrazione finale allo 0,1%) e mescolare picchiettando delicatamente sul lato del tubo. Incubare a 65 °C per 15 minuti picchiettando delicatamente ogni 5 min. Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione.
   NOTA: Questo trattamento SDS promuove la denaturazione delle proteine associate al DNA, la solubilizzazione dell'involucro nucleare e l'accessibilità della cromatina prima della digestione enzimatica di restrizione e delle fasi di legatura intramolecolare.
4. Aggiungere 4,5 μL di Triton X-100 al 10% (concentrazione finale all'1%) e mescolare mediante pipettaggio. Aggiungere 20-50 U di enzima di restrizione (EcoRI-HF o HindIII-HF) ad ogni campione e incubare a 37 °C per 1 ora agitando delicatamente ogni 20-30 minuti. Durante questo periodo, preriscaldare un bagno asciutto a 55 °C e preimpostare un bagno d'acqua a 16 °C.
5. Aggiungere 8,6 μL di SDS al 10% (concentrazione finale dell'1,5%) a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio e maschiatura. Incubare a 55 °C per 10 min. Aggiungere 80 μL di Triton X-100 al 10% (concentrazione finale del 6%) a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio.
6. Aggiungere 660 μL di tampone di legatura 1x senza ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligasi (8 U/campione) a ciascun campione e mescolare per leggera inversione. Incubare a 16 °C per 1,5 h con capovolgimento ogni 30 min. Posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione.

4. Purificazione del DNA

1. Preriscaldare un bagno secco a 65 °C e un altro a 37 °C. Aggiungere 1 μL di 10 mg/mL di proteinasi K (preparato in 1x TE pH 8,0) a ciascun campione (concentrazione finale di 12,5 μg/ml). Incubare a 65 °C per 30 minuti e porre i campioni su ghiaccio immediatamente dopo l'incubazione fino a quando non si sono raffreddati.
2. Trasferire i campioni in provette da 2 ml. Lavorando in una cappa aspirante, aggiungere un volume uguale (~800 μL) di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (P / C / IA; pH 8,0) a ciascun campione. Vortice i campioni per ~ 30 s e centrifugare i campioni per 5-10 minuti a 16.000 x g in una microcentrifuga.
3. Rimuovere con cautela 600 μL della fase superiore di ciascun campione in una nuova provetta da 1,5 ml. Smaltire correttamente la fase inferiore e i tubi da 2 ml.
4. Precipitare il DNA aggiungendo un volume 1/10 di acetato di sodio 3 M pH 5,2 (~60 μL) a ciascun campione, seguito da 1 volume di isopropanolo (~660 μL). Capovolgere i campioni 5x-10x e incubare a RT per 30 minuti.
5. Mettere i campioni su ghiaccio per 2 minuti, quindi centrifugarli a 16.500 x g per 15 minuti a 4 °C in una microcentrifuga. Riportare i campioni sul ghiaccio, versare il surnatante e scolare il tubo su un tovagliolo di carta.
6. Lavare il pellet di DNA con 200 μL di etanolo al 70%. Centrifugare a 16.500 x g per 3 minuti a 4 °C, riporre i campioni sul ghiaccio, versare il surnatante e rimuovere l'alcol residuo con un pipet. Asciugare i campioni con i tappi delle provette aperte a 37 °C per 15-20 min.
7. Risospendere i pellet di DNA in 50 μL di 1x TE mediante vortexing. Incubare a RT per 30 minuti, vortice, quindi incubare a 37 °C in un bagno asciutto per 30 minuti. Vortice di nuovo i campioni, quindi metterli sul ghiaccio. I campioni possono essere conservati in questa fase a -20 °C per diversi mesi, ma è consigliabile procedere immediatamente per le fasi di decrosslinking (solo DLC) e qPCR.

5. Inversione del reticolo psoralenico (solo per il test DLC)

1. Pipet 9 μL di DNA purificato in una provetta PCR su ghiaccio. Aggiungere 1 μL di 1 M KOH (concentrazione finale 0,1 M). Incubare i campioni a 90 °C per 30 minuti in un termociclatore.
2. Aggiungere 19,73 μL di soluzione di acetato di sodio (0,1 M acetato di sodio, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). I campioni possono essere conservati in questa fase a -20 °C per diversi mesi, ma è consigliabile procedere immediatamente alla fase qPCR.

6. PCR quantitativa, controlli e analisi

1. Utilizzando 2 μL di DNA purificato, con o senza reticolazione, impostare una reazione qPCR da 20 μL secondo le istruzioni del produttore. Imposta ogni reazione in duplicato. Per entrambi i saggi DLC e DLE, ci sono cinque reazioni di controllo e una reazione di quantificazione DLC / DLE, o un totale di sei reazioni per campione, eseguite in duplicato. La Tabella Supplementare S1 e la Tabella Supplementare S2 forniscono un modello per impostare queste reazioni e analisi, e le sequenze dei primer qPCR sono elencate nella Tabella 3.
2. Le condizioni di ciclo della qPCR devono essere ottimizzate per ogni kit qPCR.
   1. Utilizzare le seguenti condizioni DLC qPCR, a seconda dei kit qPCR utilizzati: denaturazione iniziale (95 °C per 3 min); 50 giri di amplificazione (95 °C per 15 s, 61 °C per 25 s, 72 °C per 15 s con una singola acquisizione); analisi della curva di fusione (95 °C per 5 s, 65 °C per 1 min, 97 °C con acquisizione continua); e raffreddamento (37 °C per 30 s).
   2. Utilizzare le seguenti condizioni qPCR per il test DLE: denaturazione iniziale (95 °C per 5 min); 50 giri di amplificazione (95 °C per 15 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 15 s con una singola acquisizione); analisi della curva di fusione (95 °C per 5 s, 65 °C per 1 min, 97 °C con acquisizione continua); e raffreddamento (37 °C per 30 s). Si noti che potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione per diverse macchine/kit qPCR.
3. Saggio DLC
   1. Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE); File di sequenza supplementari 1-5.
      1. DNA genomico in ARG4: Utilizzare olWDH1760/olWDH1761 per amplificare il dsDNA situato in ARG4. Utilizzare questa reazione come controllo di caricamento e normalizzare tutte le altre reazioni ad eccezione della reazione del segnale DLC a questo controllo.
      2. Efficienza di legatura intramolecolare al DAP2: utilizzare il frammento da 1.904 bp creato dalla digestione EcoRI per la legatura intramolecolare in parallelo con la legatura DLC. L'amplificazione attraverso questa giunzione di legatura riporta l'efficienza della legatura intramolecolare e funge da controllo a cui viene normalizzato il segnale DLC.
      3. Induzione DSB: utilizzare olWDH1766/olWDH1767 per amplificare una regione che si estende sul DSB indotto.
      4. Crosslinking e resezione degli psoraleni: utilizzare olWDH2019/olWDH2020 per amplificare la regione PhiX unica a valle del sito di riconoscimento EcoRI. Senza inversione di crosslinking, utilizzare il rapporto tra ssDNA (nessuna reticolazione) su ARG4 (dsDNA reticolato) per determinare l'efficienza di reticolazione. Con l'inversione del reticolo, la resezione porterà ad una progressiva diminuzione da 1 a 0,5 del segnale relativo ad ARG4.
      5. EcoR Ripristino e taglio del sito di riconoscimento: utilizzare olWDH1768/olWDH1764 per amplificare una regione che si estende sul sito di riconoscimento EcoRI restaurato a monte del DSB sul filamento resecato. olWDH1769/olWDH1763 amplificano una regione che si estende sul sito dell'enzima di restrizione EcoRI al DAP2. Eseguire la scissione EcoRI in questo sito da utilizzare come controllo della legatura intramolecolare.
   2. Segnale DLC: utilizzare olWDH1764/olWDH1765 per amplificare la molecola di DNA chimerico creata dalla legatura intramolecolare del filamento resecato (invasore) e del donatore.
   3. Analisi: calcolare la deviazione media e standard dei valori Cp per ciascuna delle reazioni duplicate. Utilizzare i valori Cp del DNA genomico ARG4 qPCR come riferimento per normalizzare tutti gli altri qPCR di controllo. Normalizzare il segnale DLC al controllo della legatura intramolecolare al DAP2. Vedere la Figura 3 per i valori tipici del segnale DLC a 2 ore.
4. Saggio DLE
   1. Controlli: Vedere l'elenco dei primer qPCR nella Tabella 3. Una mappa dei siti di legame del primer è mostrata nella Figura S1. Per i file di sequenza supplementari per le caratteristiche genomiche e gli ampliconi rilevanti, controllare i file A plasmid Editor (ApE) (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. DNA genomico in ARG4: vedere paragrafo 6.3.1.1.
      2. Efficienza di legatura intramolecolare a YLR050C: utilizzare la digestione HindIII per creare un frammento di 765 bp che subirà la legatura intramolecolare in parallelo con la legatura DLE. L'amplificazione attraverso questa giunzione di legatura riporta l'efficienza della legatura intramolecolare e serve come controllo a cui il segnale DLE è normalizzato.
      3. Induzione DSB: vedere paragrafo 6.3.1.3.
      4. Cerva Ripristino e taglio del sito di riconoscimento III: utilizzare olWDH2010/olWDH2012 e olWDH2009/2011 per amplificare una regione che si estende sui siti dell'enzima di restrizione HindIII sul filamento rotto dove è stato resecato ed esteso, rispettivamente.
   2. Segnale DLE: Utilizzare olWDH2009/olWDH2010 per amplificare la molecola di DNA chimerico creata dalla legatura intramolecolare dell'estremità resecata del filamento invasore a monte del DSB fino all'estremità appena estesa a valle del DSB.
   3. Analisi: calcolare la deviazione media e standard dei valori Cp per ciascuna delle reazioni duplicate. Utilizzare i valori Cp del DNA genomico ARG4 qPCR come riferimento per normalizzare tutti gli altri qPCR di controllo. Normalizzare il segnale DLE al controllo della legatura intramolecolare a YLR050C. I valori tipici del segnale DLE a 6 ore sono riportati nella Figura 4 e nelle precedenti pubblicazioni⁹.

Risultati

Saggio DLC
Il test DLC rileva sia i D-loop nascenti che quelli estesi formati dall'invasione di un DSB sito-specifico in un singolo donatore (Figura 2). La reticolazione degli psoraleni collega fisicamente il filamento rotto e il donatore attraverso il DNA eteroduplex all'interno del D-loop. Il ripristino del sito enzimatico di restrizione con un lungo oligo ibridante sul filamento resecato della rottura consente la scissione dell'enzima di restrizione, seguita d...

Discussione

I saggi presentati consentono la rilevazione di D-loop nascenti ed estesi (saggio DLC), estensione D-loop (saggio DLE) e formazione del prodotto BIR (saggio DLE senza oligonucleotidi ibridanti) utilizzando la legatura di prossimità e la qPCR. ChIP-qPCR di Rad51 verso siti distanti dal DSB è stato precedentemente utilizzato come proxy per la ricerca di omologia mediata da Rad51 e la formazione di D-loop. Tuttavia, questo segnale ChIP-qPCR è indipendente dall'omologia di sequenza tra il sito di rottura e un potenziale d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors