Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

El daño del ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN y los enlaces cruzados entre cadenas, incurridos durante las fases S y G2 del ciclo celular pueden repararse mediante recombinación homóloga (HR). Además, HR representa un mecanismo importante de rescate de la bifurcación de replicación después de un estancamiento o colapso. La regulación de los muchos pasos reversibles e irreversibles de esta compleja vía promueve su fidelidad. El análisis físico de los intermedios de recombinación formados durante la FC permite la caracterización de estos controles por diversos factores de nucleoproteínas y sus interactores. Aunque existen métodos bien establecidos para evaluar eventos específicos e intermedios en la vía de recombinación, la detección de la formación y extensión del bucle D, dos pasos críticos en esta vía, ha demostrado ser un desafío hasta hace poco. Aquí, se describen métodos eficientes para detectar eventos clave en la vía HR, a saber, la formación de rotura de doble cadena de ADN, la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos a través de la replicación inducida por rotura (BIR) en Saccharomyces cerevisiae . Estos ensayos detectan sus intermedios de recombinación relevantes y productos con alta sensibilidad y son independientes de la viabilidad celular. La detección de D-loops, extensión D-loop y el producto BIR se basa en la ligadura de proximidad. Juntos, estos ensayos permiten el estudio de la cinética de la FC a nivel de la población para abordar con precisión las funciones de las proteínas y reguladores de la FC en pasos significativos en la vía.

Introducción

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de alta fidelidad de reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB), enlaces cruzados entre cadenas y brechas de ssDNA, así como una vía para la tolerancia al daño del ADN. La FC difiere de las vías propensas a errores para la reparación/tolerancia al daño del ADN, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la síntesis de translesiones, en que utiliza un ADN dúplex homólogo intacto como donante para modelar el evento de reparación. Además, muchos de los intermedios clave en la vía de FC son reversibles, lo que permite una regulación exquisita de los pasos individuales de la vía. Durante las fases S, G2 y M del ciclo....

Protocolo

1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras

NOTA: Se recomienda la suplementación de todos los medios con 0,01% de adenina para las cepas de Ade.

1. Rayar las cepas haploides apropiadas (ver Tabla 1) en levadura peptona dextrosa adenina (YPDA) ( 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 2% agar, 0,001% adenina) y crecer durante 2 días a 30 °C.
2. Use una sola colonia para inocular 5 ml de YPDA en un tubo de cultivo de vidrio de 15 ml. Cultivar cultivos hasta la saturación a 30 °C con agitación o rotación para aireación.
3. Ensayo DLC: Prepare la solución madre de p....

Resultados

Ensayo DLC
El ensayo DLC detecta bucles D nacientes y extendidos formados por la invasión de un DSB específico del sitio en un solo donante (Figura 2). La reticulación del psoraleno une físicamente la hebra rota y el donante a través del ADN heterodúplex dentro del bucle D. La restauración del sitio de la enzima de restricción con un oligo hibridante largo en la hebra resecada de la ruptura permite la escisión de la enzima de restricción, seguida de la .......

Discusión

Los ensayos presentados permiten la detección de bucles D nacientes y extendidos (ensayo DLC), extensión de bucle D (ensayo DLE) y formación de productos BIR (ensayo DLE sin oligonucleótidos hibridantes) utilizando ligadura de proximidad y qPCR. La ChIP-qPCR de Rad51 a sitios distantes del DSB se ha utilizado previamente como un proxy para la búsqueda de homología mediada por Rad51 y la formación de bucle D. Sin embargo, esta señal ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia entre el sitio de ruptura.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors