Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Resumen

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

El daño del ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN y los enlaces cruzados entre cadenas, incurridos durante las fases S y G2 del ciclo celular pueden repararse mediante recombinación homóloga (HR). Además, HR representa un mecanismo importante de rescate de la bifurcación de replicación después de un estancamiento o colapso. La regulación de los muchos pasos reversibles e irreversibles de esta compleja vía promueve su fidelidad. El análisis físico de los intermedios de recombinación formados durante la FC permite la caracterización de estos controles por diversos factores de nucleoproteínas y sus interactores. Aunque existen métodos bien establecidos para evaluar eventos específicos e intermedios en la vía de recombinación, la detección de la formación y extensión del bucle D, dos pasos críticos en esta vía, ha demostrado ser un desafío hasta hace poco. Aquí, se describen métodos eficientes para detectar eventos clave en la vía HR, a saber, la formación de rotura de doble cadena de ADN, la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos a través de la replicación inducida por rotura (BIR) en Saccharomyces cerevisiae . Estos ensayos detectan sus intermedios de recombinación relevantes y productos con alta sensibilidad y son independientes de la viabilidad celular. La detección de D-loops, extensión D-loop y el producto BIR se basa en la ligadura de proximidad. Juntos, estos ensayos permiten el estudio de la cinética de la FC a nivel de la población para abordar con precisión las funciones de las proteínas y reguladores de la FC en pasos significativos en la vía.

Introducción

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de alta fidelidad de reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB), enlaces cruzados entre cadenas y brechas de ssDNA, así como una vía para la tolerancia al daño del ADN. La FC difiere de las vías propensas a errores para la reparación/tolerancia al daño del ADN, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la síntesis de translesiones, en que utiliza un ADN dúplex homólogo intacto como donante para modelar el evento de reparación. Además, muchos de los intermedios clave en la vía de FC son reversibles, lo que permite una regulación exquisita de los pasos individuales de la vía. Durante las fases S, G2 y M del ciclo celular, HR compite con NHEJ para la reparación de los DSB de dos extremos¹. Además, la FC es esencial para la replicación del ADN para la reparación del daño del ADN asociado a la replicación, incluidas las brechas de ssDNA y los DSB unilaterales, y como mecanismo de derivación de la lesión del ADN².

Un intermediario crítico en la vía HR es el bucle de desplazamiento, o bucle D (Figura 1). Después de la resección final, la recombinasa central en la reacción, Rad51, se carga sobre el ssDNA recién resecado de la molécula rota, formando un filamento helicoidal². Rad51 luego lleva a cabo una búsqueda de homología para identificar un donante homólogo adecuado, típicamente la cromátida hermana en células somáticas. El D-loop se forma cuando el filamento Rad51-ssDNA invade un ADN dúplex homólogo, lo que conduce al emparejamiento de la base Watson-Crick de la hebra rota con la hebra complementaria del donante, desplazando la hebra donante opuesta. La extensión del extremo 3' de la hebra rota por una ADN polimerasa reemplaza las bases que se perdieron durante el evento de daño del ADN y promueve la resolución del intermedio de bucle D extendido en un producto de dsDNA a través del recocido de hebra dependiente de la síntesis (SDSA), la unión de doble Holliday (dHJ) o las subvías HR de replicación inducida por rotura (BIR).

Los ensayos que monitorean físicamente los intermediarios en la vía HR permiten el análisis de los requisitos genéticos para cada paso (es decir, análisis de vía). La formación de DSB, la resección final, las dHJ, las burbujas de replicación BIR y los productos HR se observan fácilmente mediante Southern blotting 3,4,5,6,7. Sin embargo, Southern blotting no informa sobre los bucles D nacientes y extendidos y, por lo tanto, se requiere un método alternativo para medir de manera confiable estas moléculas conjuntas ^4,8,9. Una estrategia ampliamente utilizada para analizar la formación naciente del bucle D es la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de Rad51 junto con la PCR cuantitativa (qPCR)^10,11. Sin embargo, la asociación de Rad51 con dsDNA medida por ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia y del factor accesorio Rad51 Rad54^10,11. En contraste, una señal apreciable utilizando el método de análisis de bucle D presentado aquí, llamado ensayo de captura de bucle D (DLC), depende de la formación de DSB, homología de secuencia, Rad51 y las proteínas accesorias Rad51 Rad52 y Rad54⁸. El hallazgo de que la formación del bucle D promovido por Rad51 por Saccharomyces cerevisiae depende de Rad54 in vivo está de acuerdo con numerosos experimentos de reconstitución in vitro que indican que Rad54 es necesario para la búsqueda de homología y la formación del bucle D por la levadura en ciernes Rad51 8,12,13,14,15.

Los enfoques actuales para medir la extensión del bucle D, principalmente a través de PCR semicuantitativa, son igualmente problemáticos. Un ensayo típico basado en PCR para detectar la extensión del bucle D amplifica una secuencia única, resultante de la recombinación entre un sitio de ruptura y un donante ectópico y la posterior síntesis de ADN asociada a la recombinación, a través de un cebador aguas arriba de la región de homología en la hebra rota y otro cebador aguas abajo de la región de homología en la cadena donante. Utilizando este método, la detección de la síntesis de ADN asociada a la recombinación requiere el factor de procesividad Pol δ no esencial Pol32¹⁶. Este hallazgo entra en conflicto con la observación de que la eliminación de POL32 tiene solo un efecto leve sobre la conversión génica in vivo¹⁷. Además, estos ensayos basados en PCR no logran resolver temporalmente la extensión del bucle D y la formación del producto BIR, lo que sugiere que la señal resulta de productos de dsDNA en lugar de intermedios de ssDNA^17,18,19. El ensayo de extensión de bucle D (DLE) se desarrolló recientemente para abordar estas discrepancias. El ensayo DLE cuantifica la síntesis de ADN asociada a la recombinación en un sitio ~ 400 pares de bases (pb) aguas abajo del extremo invasor inicial³' 9. Mediante este método, la extensión del bucle D es independiente de Pol32 y es detectable dentro de las 4 h posteriores a la inducción DSB, mientras que los productos BIR se observan por primera vez a las 6 h. De hecho, una publicación reciente de los laboratorios Haber y Malkova señaló que el uso de este método de preparación de ADN genómico resulta singularmente en la preservación del ssDNA ^9,20.

Aquí, los ensayos DLC y DLE se describen en detalle. Estos ensayos se basan en la ligadura de proximidad para detectar bucles D nacientes y extendidos en S. cerevisiae (Figura 2)^8,9. Los productos BIR se pueden cuantificar utilizando este mismo sistema de ensayo. Para ambos ensayos, la formación de DSB en un sitio de corte de endonucleasa HO ubicado en el locus URA3 en el cromosoma (Chr.) V es inducida por la expresión de la endonucleasa HO bajo el control de un promotor inducible por galactosa. La invasión de la cadena de ADN mediada por Rad51 conduce a la formación naciente del bucle D en el sitio de un donante ectópico ubicado en el locus LYS2 en Chr. II. Como el lado derecho del DSB carece de homología con el donante, la reparación a través de SDSA y la formación de dHJ no es factible. La reparación inicial del DSB por BIR es posible, pero la formación de productos viables es inhibida por la presencia del centrómero²¹. Este diseño deliberado impide la reparación productiva de DSB, evitando así la reanudación del crecimiento de las células con DBS reparadas, que de otro modo podrían superar el cultivo durante el análisis del curso del tiempo.

En el ensayo DLC, la reticulación de psoraleno de las dos hebras del ADN heterodúplex dentro del bucle D preserva el intermedio de recombinación. Después de la restauración del sitio de la enzima de restricción en la hebra rota (resecada) y la digestión, la reticulación permite la ligadura de las secuencias únicas aguas arriba de los ADN rotos homólogos y donantes. Usando qPCR, se cuantifica el nivel de molécula de ADN quimérico presente en cada muestra. En el ensayo DLE, no se requiere reticulación, y la restauración del sitio de la enzima de restricción y la digestión seguida de la ligadura intramolecular en su lugar vinculan el extremo 5' de la molécula rota al extremo 3' recién extendido. Una vez más, la qPCR se utiliza para cuantificar las cantidades relativas de este producto quimérico en cada muestra. En ausencia de restauración del sitio de la enzima de restricción, el ensayo DLE informa sobre los niveles relativos del producto BIR (dsDNA) que se forma después de la extensión del bucle D.

Se muestran los resultados representativos de cada ensayo con una cepa de tipo salvaje, y los lectores son remitidos a Piazza et al.8 y Piazza et al.9 para el uso de estos ensayos para el análisis de mutantes de recombinación ^8,9. La intención de esta contribución es permitir que otros laboratorios adopten los ensayos DLC y DLE, y el soporte para ellos está disponible a pedido.

Protocolo

1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras

NOTA: Se recomienda la suplementación de todos los medios con 0,01% de adenina para las cepas de Ade.

1. Rayar las cepas haploides apropiadas (ver Tabla 1) en levadura peptona dextrosa adenina (YPDA) ( 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 2% agar, 0,001% adenina) y crecer durante 2 días a 30 °C.
2. Use una sola colonia para inocular 5 ml de YPDA en un tubo de cultivo de vidrio de 15 ml. Cultivar cultivos hasta la saturación a 30 °C con agitación o rotación para aireación.
3. Ensayo DLC: Prepare la solución madre de psoraleno 5x (0.5 mg / ml de trioxaleno en etanol a prueba de 200) en una campana extractora disolviendo psoraleno en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio durante la noche a temperatura ambiente con agitación o inversión continua. Selle la parte superior de tornillo con una película transparente para evitar la evaporación. No prepare más de 7 ml de solución madre de psoraleno 5x por tubo cónico de 50 ml para asegurar la disolución adecuada del psoraleno.
4. Al día siguiente, use 5 ml del cultivo YPDA cultivado durante la noche para inocular 50-100 ml de YEP-lactato (1% de extracto de levadura, 2% peptona, 2% p/p de lactato, 0,001% de adenina) en un matraz de tamaño adecuado (la levadura en ciernes crece de manera óptima en un matraz que es al menos 5 veces el volumen del cultivo) a un OD₆₀₀ de ~0,03.
5. Cultivar el cultivo durante ~16 h a 30 °C con agitación a 220 rpm. Después de ~16 h, mida el OD₆₀₀ del cultivo y debe ser ~0.5-0.8. No utilice cultivos submaduros o demasiado grandes.
6. Para cada punto de tiempo, recoja el volumen apropiado de células en un tubo cónico y colóquelo en hielo. Típicamente, esto es 1 x 10⁸ células (aproximadamente 7,5 ml de cultivo en OD 600 1,0 para una cepa haploide de tipo salvaje) para el ensayo DLC y 5 x 10⁷ células (aproximadamente 2,5 ml de cultivo en OD₆₀₀ 1.0) para el ensayo DLE.
7. Para garantizar la precisión de los valores de OD 600, prepare diluciones 1:5 para cultivos con un OD₆₀₀≥0.2 para mantener la lectura de OD en 0.2 o menos. Para las cepas de tipo salvaje, los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLC son entre 2 h y 6 h, y los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLE son entre 4 h y 8 h (ver Figura 3 y Figura 4).
8. Ensayo DLC
   1. Antes de cada punto de tiempo, prepare suficiente solución de psoraleno 1x (0,1 mg/ml de trioxsaleno, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% de etanol) en una campana extractora para todas las muestras en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio. Salir en RT.
   2. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet en 2,5 ml de 1x solución de psoraleno en una campana extractora y transferir a una placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Alternativamente, resuspenda el pellet en 2,5 ml de solución TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) para un control sin reticulación.
   3. Entrecruza las muestras. Para un ajuste de reticulación UV con bombillas de onda larga (365 nm), coloque las placas de Petri 1-2 cm por debajo de la fuente de luz UV con la tapa retirada sobre una placa de plástico o plexiglás que se haya enfriado previamente a -20 ° C. Para una caja de luz UV, coloque las placas de Petri directamente encima de la fuente de luz UV. Exponga las muestras durante 10 minutos con una agitación suave.
      NOTA: Se recomienda colocar la fuente de luz UV encima de un agitador orbital configurado a ~ 50 rpm.
   4. En una campana extractora, transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 ml. Enjuague la placa de Petri con 2,5 ml de solución TE1 y agréguela al tubo. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C, desechar adecuadamente el sobrenadante y almacenar el pellet a -20° C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.
9. Ensayo DLE
   1. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Lavar el pellet de la celda en 2,5 ml de solución TE1 fría antes de repetir el centrifugado y almacenar los gránulos a -20 °C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.
10. Para la recolección de muestras a las 0 h, recolectar las muestras antes de la adición de galactosa al 20%. Para puntos de tiempo posteriores, inducir la formación de DSB agregando 20% de galactosa a los cultivos a una concentración final de 2%. Recolectar las muestras restantes como se describió anteriormente, pellets y congelar en relación con el tiempo posterior a la inducción DSB (es decir, la muestra de 4 h se recolecta 4 h después de la adición de galactosa al 20%).

2. Esferoplastia celular, lisis y restauración del sitio de restricción

1. Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 30 °C.
2. Resuspender las muestras en 1 mL de tampón de esferoplasting (0,4 M de sorbitol, 0,4 M KCl, tampón fosfato de sodio de 40 mM pH 7,2, 0,5 mM MgCl₂) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Añadir 3,5 μL de solución de zimolyase (2% de glucosa, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml de zymolyase 100T; 17,5 μg/ml de zymolyase concentración final). Mezclar suavemente dando golpecitos o inversión. Incubar a 30 °C durante 15 min, y luego colocar en hielo. Durante la incubación de 15 minutos, obtenga nitrógeno líquido o hielo seco.
4. Centrifugar durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C y colocar las muestras en hielo. Lave las muestras 3 veces en 1 ml de tampón de esferaturado. Centrifugar las muestras durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C.
5. Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío (50 mM de acetato de potasio, 20 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de magnesio, 100 μg/mL BSA pH ~8,0 a RT) y centrifugar durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C. Coloque las muestras en hielo. Repita el lavado 1x.
6. Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío. Divida la muestra (0,5 ml cada una) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar las muestras durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C.
7. Resuspender un tubo de cada muestra en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x con oligos hibridantes (ver Tabla 2) y un tubo en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x sin oligos hibridantes. Cada oligo hibridante se resuspende en 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) y se utiliza a una concentración final de 7 nM. El TE 1x reemplaza los oligos hibridantes en el tampón de la enzima de restricción 1.4x sin hibridar oligos.
   NOTA: Los oligos hibridantes deben almacenarse a −20 °C en pequeñas alícuotas en la dilución de trabajo. La concentración de los oligos hibridantes puede requerir optimización; véase Discusión.
8. Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido o hielo seco/etanol y guárdelas a -80 °C. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa durante varios meses.

3. Digestión enzimática de restricción y ligadura intramolecular

1. Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C.
2. Pipet 36 μL de la muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo. Devuelva rápidamente la muestra restante a −80 °C para su almacenamiento.
3. Añadir 4 μL de SDS al 1% (0,1% de concentración final) y mezclar golpeando suavemente el lado del tubo. Incubar a 65 °C durante 15 min con golpecitos suaves cada 5 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación.
   NOTA: Este tratamiento SDS promueve la desnaturalización de las proteínas asociadas al ADN, la solubilización de la envoltura nuclear y la accesibilidad a la cromatina antes de los pasos de digestión de enzimas de restricción y ligadura intramolecular.
4. Añadir 4,5 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 1%) y mezclar por pipeteo. Añadir 20-50 U de enzima de restricción (EcoRI-HF o HindIII-HF) a cada muestra e incubar a 37 °C durante 1 h con agitación suave cada 20-30 min. Durante este tiempo, precaliente un baño seco a 55 °C y preajuste un baño maría a 16 °C.
5. Añadir 8,6 μL de SDS al 10% (concentración final del 1,5%) a cada muestra y mezclar mediante pipeteo y roscado. Incubar a 55 °C durante 10 min. Añadir 80 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 6%) a cada muestra y mezclar por pipeteo.
6. Añadir 660 μL de 1x tampón de ligadura sin ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligasa (8 U/muestra) a cada muestra y mezclar mediante una inversión suave. Incubar a 16 °C durante 1,5 h con inversión cada 30 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación.

4. Purificación del ADN

1. Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C. Añadir 1 μL de proteinasa K de 10 mg/ml (preparada en 1x TE pH 8,0) a cada muestra (concentración final de 12,5 μg/ml). Incubar a 65 °C durante 30 min y colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación hasta que se hayan enfriado.
2. Transfiera las muestras a tubos de 2 ml. Trabajando en una campana extractora, agregue un volumen igual (~ 800 μL) de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (P / C / IA; pH 8.0) a cada muestra. Vortex las muestras durante ~30 s y centrifugar las muestras durante 5-10 min a 16.000 x g en una microcentrífuga.
3. Retire con cuidado 600 μL de la fase superior de cada muestra en un nuevo tubo de 1,5 ml. Deseche adecuadamente los tubos de fase inferior y de 2 ml.
4. Precipitar el ADN añadiendo un volumen de 1/10 de acetato de sodio 3 M pH 5.2 (~60 μL) a cada muestra, seguido de 1 volumen de isopropanol (~660 μL). Invierta las muestras 5x-10x e incube a RT durante 30 min.
5. Colocar las muestras en hielo durante 2 min, y luego centrifugar las muestras a 16.500 x g durante 15 min a 4 °C en una microcentrífuga. Devuelva las muestras al hielo, vierta el sobrenadante y drene el tubo en una toalla de papel.
6. Lave el pellet de ADN con 200 μL de etanol al 70%. Centrifugar a 16.500 x g durante 3 min a 4 °C, volver a colocar las muestras en hielo, verter el sobrenadante y eliminar el alcohol residual con una pipeta. Secar las muestras con las tapas de los tubos abiertas a 37 °C durante 15-20 min.
7. Resuspender los gránulos de ADN en 50 μL de 1x TE por vórtice. Incubar a RT durante 30 min, vórtice, y luego incubar a 37 °C en un baño seco durante 30 min. Vuelva a vomitar las muestras y luego colóquelas en hielo. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente para los pasos de desenlace (DLC solamente) y qPCR.

5. Reversión de enlaces cruzados de psoraleno (solo para el ensayo DLC)

1. Pipet 9 μL de ADN purificado en un tubo de PCR sobre hielo. Añadir 1 μL de 1 M KOH (0,1 M concentración final). Incubar las muestras a 90 °C durante 30 min en un termociclador.
2. Añadir 19,73 μL de solución de acetato de sodio (0,1 M de acetato de sodio, 9,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Las muestras pueden almacenarse en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente a la etapa de qPCR.

6. PCR cuantitativa, controles y análisis

1. Usando 2 μL de ADN purificado, con o sin reticulación, configure una reacción qPCR de 20 μL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Configura cada reacción por duplicado. Para los ensayos DLC y DLE, hay cinco reacciones de control y una reacción de cuantificación DLC/DLE, o un total de seis reacciones por muestra, ejecutadas por duplicado. La Tabla Suplementaria S1 y la Tabla Suplementaria S2 proporcionan una plantilla para configurar estas reacciones y análisis, y las secuencias de los cebadores de qPCR se enumeran en la Tabla 3.
2. Las condiciones de ciclo de qPCR deben optimizarse para cada kit de qPCR.
   1. Utilice las siguientes condiciones de qPCR DLC, dependiendo de los kits de qPCR utilizados: desnaturalización inicial (95 °C durante 3 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 61 °C durante 25 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s).
   2. Utilice las siguientes condiciones de qPCR para el ensayo de DLA: desnaturalización inicial (95 °C durante 5 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s). Tenga en cuenta que puede ser necesaria la optimización para diferentes máquinas/kits de qPCR.
3. Ensayo DLC
   1. Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE); Archivos de secuencia suplementaria 1-5.
      1. ADN genómico en ARG4: Utilice olWDH1760/olWDH1761 para amplificar el dsDNA localizado en ARG4. Utilice esta reacción como control de carga y normalice todas las demás reacciones, excepto la reacción de la señal DLC a este control.
      2. Eficiencia de la ligadura intramolecular en DAP2: Utilice el fragmento de 1.904 pb creado por la digestión EcoRI para la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLC. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLC.
      3. Inducción DSB: Utilice olWDH1766/olWDH1767 para amplificar una región que abarca el DSB inducido.
      4. Reticulación y resección de psoraleno: use olWDH2019/olWDH2020 para amplificar la región única de PhiX aguas abajo del sitio de reconocimiento EcoRI. Sin inversión de reticulación, utilice la proporción de ssDNA (sin reticulación) sobre ARG4 (dsDNA reticulado) para determinar la eficiencia de reticulación. Con la inversión de reticulación, la resección conducirá a una disminución progresiva de 1 a 0,5 de la señal en relación con ARG4.
      5. EcoR I restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH1768/olWDH1764 para amplificar una región que abarca el sitio de reconocimiento EcoRI restaurado aguas arriba del DSB en la hebra resecada. olWDH1769/olWDH1763 amplifican una región que abarca el sitio de la enzima de restricción EcoRI en DAP2. Realizar la escisión EcoRI en este sitio para usarla como control de ligadura intramolecular.
   2. Señal DLC: Utilice olWDH1764/olWDH1765 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular de la hebra resecada (invasora) y el donante.
   3. Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLC al control de ligadura intramolecular en DAP2. Consulte la Figura 3 para conocer los valores típicos de la señal DLC a las 2 h.
4. Ensayo DLE
   1. Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE) (Archivos de secuencia suplementaria 1-5).
      1. ADN genómico en ARG4: Ver sección 6.3.1.1.
      2. Eficiencia de la ligadura intramolecular en YLR050C: Utilice la digestión HindIII para crear un fragmento de 765 pb que se someterá a la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLE. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLE.
      3. Inducción del OSD: Véase la sección 6.3.1.3.
      4. Cierva III restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH2010/olWDH2012 y olWDH2009/2011 para amplificar una región que abarca los sitios de enzimas de restricción HindIII en la hebra rota donde se ha resecado y extendido, respectivamente.
   2. Señal DLE: Utilice olWDH2009/olWDH2010 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular del extremo resecado de la hebra invasora aguas arriba del DSB al extremo recién extendido aguas abajo del DSB.
   3. Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLE al control de ligadura intramolecular en YLR050C. Los valores típicos de la señal DLE a las 6 h se informan en la Figura 4 y en publicaciones anteriores⁹.

Resultados

Ensayo DLC
El ensayo DLC detecta bucles D nacientes y extendidos formados por la invasión de un DSB específico del sitio en un solo donante (Figura 2). La reticulación del psoraleno une físicamente la hebra rota y el donante a través del ADN heterodúplex dentro del bucle D. La restauración del sitio de la enzima de restricción con un oligo hibridante largo en la hebra resecada de la ruptura permite la escisión de la enzima de restricción, seguida de la ...

Discusión

Los ensayos presentados permiten la detección de bucles D nacientes y extendidos (ensayo DLC), extensión de bucle D (ensayo DLE) y formación de productos BIR (ensayo DLE sin oligonucleótidos hibridantes) utilizando ligadura de proximidad y qPCR. La ChIP-qPCR de Rad51 a sitios distantes del DSB se ha utilizado previamente como un proxy para la búsqueda de homología mediada por Rad51 y la formación de bucle D. Sin embargo, esta señal ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia entre el sitio de ruptura...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors