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摘要

D环捕获（DLC）和D环延伸（DLE）测定利用邻近连接原理与定量PCR一起量化酿 酒酵母中诱导双链断裂部位的D环形成，D环延伸和产物形成。

摘要

在细胞周期的S期和G2期发生的DNA损伤，包括DNA双链断裂和链间交联，可以通过同源重组（HR）进行修复。此外，HR是停滞或崩溃后复制分叉救援的重要机制。对这种复杂途径的许多可逆和不可逆步骤的调节促进了其保真度。对HR期间形成的重组中间体的物理分析能够通过各种核蛋白因子及其相互作用物来表征这些对照。尽管有成熟的方法来分析重组途径中的特定事件和中间体，但直到最近，检测D环形成和延伸（该途径中的两个关键步骤）已被证明具有挑战性。本文描述了检测酿酒酵母中HR途径中关键事件的有效方法，即DNA双链断裂形成，D环形成，D环延伸以及通过断裂诱导复制（BIR）形成产物。这些检测以高灵敏度检测其相关的重组中间体和产物，并且与细胞活力无关。D 环、D 环延伸和 BIR 产物的检测基于邻近连接。总之，这些测定允许在群体水平上研究HR的动力学，以精细解决HR蛋白和调节因子在途径中重要步骤的功能。

引言

同源重组（HR）是修复DNA双链断裂（DSB）、链间交联和ssDNA间隙的高保真机制，也是DNA损伤耐受性的途径。HR不同于容易出错的DNA损伤修复/耐受途径，例如非同源末端连接（NHEJ）和跨病变合成，因为它利用完整的同源双链DNA作为供体来模板修复事件。此外，HR途径中的许多关键中间体是可逆的，可以对各个途径步骤进行精细调节。在细胞周期的S，G2和M阶段，HR与NHEJ竞争修复两端DSB1。此外，HR对于DNA复制至关重要，用于修复与复制相关的DNA损伤，包括ssDNA间隙和单侧DSB，以及作为DNA损伤旁路的机制2。

HR通路中的一个关键中间体是位移环或D环（图1）。末端切除后，反应中的中心重组酶Rad51加载到新切除的破碎分子的ssDNA上，形成螺旋丝2。然后，Rad51进行同源搜索以鉴定合适的同源供体，通常是体细胞中的姐妹染色单体。当Rad51-ssDNA细丝侵入同源双链DNA时，形成D环，这导致断裂链与供体互补链的Watson-Crick碱基配对，取代相反的供体链。通过DNA聚合酶延伸断裂链的3'端，取代在DNA损伤事件中丢失的碱基，并通过合成依赖性链退火（SDSA），双霍利迪连接（dHJ）或断裂诱导复制（BIR）HR亚途径促进延伸的D环中间体分解为dsDNA产物。

物理监测HR途径中间体的测定允许分析每个步骤的遗传要求（即途径分析）。通过 Southern 印迹3，4，5，6，7 很容易观察到 DSB 形成、末端切除、dHJ、BIR 复制气泡和 HR 产物。然而，Southern 印迹未能报告新生和扩展的 D 环，因此，需要一种可靠地测量这些关节分子的替代方法4，8，9。分析新生D环形成的一种广泛使用的策略是Rad51的染色质免疫沉淀（ChIP）与定量PCR（qPCR）10，11相结合。然而，通过 ChIP-qPCR 测量的 Rad51 与 dsDNA 的关联与序列同源性和 Rad51 附属因子 Rad5410，11 无关。相反，使用此处介绍的D环分析方法（称为D环捕获（DLC）测定）的可观信号取决于DSB形成，序列同源性，Rad51以及Rad51辅助蛋白Rad52和Rad548。酿酒酵母Rad51促进的D环形成依赖于体内Rad54的发现与许多体外重建实验一致，表明Rad54是出芽酵母Rad518，12，13，14，15的同源搜索和D环形成所必需的。

目前测量D环延伸的方法，主要是通过半定量PCR，也存在类似的问题。用于检测 D 环延伸的典型基于 PCR 的测定通过断裂链上同源区域上游的引物和供体链上同源区域下游的另一个引物扩增由断裂位点和异位供体供体之间的重组以及随后的重组相关 DNA 合成产生的独特序列。使用这种方法，重组相关DNA合成的检测需要非必需的Pol δ合成能力因子Pol3216。这一发现与POL32缺失对体内基因转化仅有轻微影响的观察结果相矛盾17。此外，这些基于PCR的测定无法暂时解析D环延伸和BIR产物形成，这表明信号来自dsDNA产物而不是ssDNA中间体17，18，19。最近开发了D环延伸（DLE）测定来解决这些差异。DLE测定定量了初始3'入侵端9下游~400个碱基对（bp）位点的重组相关DNA合成。通过这种方法，D环延伸与Pol32无关，并且在DSB诱导后4小时内可检测到，而BIR产物在6小时首次观察到。事实上，Haber和Malkova实验室最近的一篇出版物指出，使用这种方法制备基因组DNA可以单独导致ssDNA保存9，20。

在这里，详细介绍了DLC和DLE测定。这些测定依靠邻近连接来检测 酿酒酵母 中的新生和扩展的D环（图2）8，9。BIR产物可以使用相同的检测系统进行定量。对于这两种测定，位于染色体（Chr.） V上 URA3 位点的HO核酸内切酶切割位点的DSB形成是由半乳糖诱导启动子控制下的HO核酸内切酶表达诱导的。Rad51介导的DNA链侵袭导致位于Chr.II上 LYS2 位点的异位供体部位形成新生的D环。由于DSB的右侧与供体缺乏同源性，因此通过SDSA和dHJ形成 进行 修复是不可行的。通过BIR对DSB进行初始修复是可能的，但是着丝粒21的存在抑制了活产物的形成。这种故意的设计阻止了生产性的DSB修复，从而避免了具有修复DBS的细胞恢复生长，否则可能会在时间过程分析期间超过培养物。

在DLC测定中，补骨脂素交联D环内两条异质双链DNA的补骨脂素交联保留了重组中间体。在断裂（切除）链上的限制性内切酶位点恢复和消化后，交联允许连接同源断裂和供体DNA上游的独特序列。使用qPCR，可以量化每个样品中存在的嵌合DNA分子的水平。在DLE测定中，不需要交联，限制性内切酶位点恢复和消化，然后进行分子内连接，而是将破碎分子的5'端连接到新延伸的3'端。同样，qPCR用于量化每个样品中这种嵌合产物的相对量。在没有限制性内切酶位点恢复的情况下，DLE测定报告D环延伸后形成的BIR（dsDNA）产物的相对水平。

显示了使用野生型菌株的每种测定的代表性结果，并且读者参考Piazza等人8和Piazza等人9，以使用这些测定分析重组突变体8，9。这项贡献的目的是使其他实验室能够采用DLC和DLE检测，并可根据要求提供支持。

研究方案

1. 预生长、DSB 诱导和样品采集

注意:建议所有培养基补充0.01%腺嘌呤用于腺苷菌株。

  1. 在酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，0.001%腺嘌呤）上划出适当的单倍体菌株（见 表1），并在30°C下生长2天。
  2. 使用单个菌落在 15 mL 玻璃培养管中接种 5 mL YPDA。将培养物培养至30°C饱和，振荡或旋转进行曝气。
  3. DLC 测定:将补骨脂素溶解在用铝箔包裹的 50 mL 锥形管中过夜，在室温下连续振荡或倒置，在通风橱中制备 5x 补骨脂素储备溶液（0.5 mg/mL 三氧杂素在 200 证明乙醇中）。用透明薄膜密封螺丝顶部以防止蒸发。每 50 mL 锥形管中不要制备超过 7 mL 的 5x 补骨脂素储备溶液，以确保补骨脂素正确溶解。
  4. 第二天，使用 5 mL 生长的过夜培养物将 50-100 mL YEP-乳酸（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% w/w 乳酸、0.001% 腺嘌呤）接种在适当大小的烧瓶中（出芽酵母在至少是培养物体积 5 倍的烧瓶中生长最佳）至 OD600 为 ~0.03。
  5. 在30°C下以220rpm振荡培养物~16小时。~16小时后，测量培养物的OD600 ，应为~0.5-0.8。不要使用生长不足或过度生长的培养物。
  6. 对于每个时间点，在锥形管中收集适当体积的细胞并放在冰上。通常，DLC 测定为 1 x 108 个细胞（对于单倍体野生型菌株，在 OD 600 1.0 下培养约 7.5 mL），对于 DLE 测定，这是 5 x 107 个细胞（在 OD600 1.0 下约 2.5 mL 培养）。
  7. 为确保OD 600值的准确性，请为OD600≥0.2的培养物准备1:5稀释液，以保持OD读数在0.2或更低。对于野生型菌株，DLC分析的最佳时间点在2小时至6小时之间，DLE分析的最佳时间点为4小时至8小时（见图3和图4）。
  8. 类金刚石检测
    1. 在每个时间点之前，在通风橱中制备足够的1x补骨脂素溶液（0.1mg / mL三氧杂草素，50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0，20%乙醇）用于用箔纸包裹的50 mL锥形管中的所有样品。离开RT。
    2. 将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟。 将沉淀重悬于通风橱中的 2.5 mL 1x 补骨脂素溶液中，并转移到 60 mm x 15 mm 培养皿中。或者，将沉淀重悬于 2.5 mL TE1 溶液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0）中，用于无交联对照。
    3. 交联样品。对于适合长波（365nm）灯泡的UV交联剂，将培养皿放置在UV光源下方1-2cm处，盖子取下在-20°C下预冷的塑料或有机玻璃板上。对于紫外线灯箱，将培养皿直接放在紫外线光源上。将样品暴露10分钟，轻轻摇动。
      注意:建议将紫外光源设置在设置为 ~50 rpm 的轨道振动台上。
    4. 在通风橱中，将样品转移到新的 15 mL 管中。用 2.5 mL TE1 溶液冲洗培养皿并将其添加到试管中。将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟，妥善处理上清液，并将沉淀储存在-20°C.样品可以储存长达1周，然后再进行下一步。
  9. DLE 检测
    1. 将样品在4°C下以2，500× g 离心5分钟。 在2.5mL冷TE1溶液中洗涤细胞沉淀，然后重复旋转并将沉淀储存在-20°C。 样品可以储存长达 1 周，然后再进入下一步。
  10. 对于0小时的样品收集，在加入20%半乳糖之前收集样品。对于随后的时间点，通过在培养物中加入 20% 半乳糖至终浓度为 2% 来诱导 DSB 形成。如上所述收集剩余的样品，沉淀，并相对于DSB诱导后的时间冷冻（即，在加入20%半乳糖后4小时收集4小时样品）。

2. 细胞球体、裂解和限制性位点恢复

  1. 将样品在冰上解冻。将干浴预热至30°C。
  2. 将样品重悬于 1 mL 球状缓冲液（0.4 M 山梨糖醇、0.4 M KCl、40 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.2、0.5 mM MgCl2）中，并转移到 1.5 mL 微量离心管中。
  3. 加入 3.5 μL 酶解酶溶液（2% 葡萄糖，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mg/mL 酶解酶 100T;17.5 μg/mL 酶解酶终浓度）。通过敲击或倒置轻轻混合。在30°C孵育15分钟，然后放在冰上。在15分钟孵育期间，获得液氮或干冰。
  4. 在4°C下以2，500× g 离心3分钟，并将样品放在冰上。在 1 mL 球状喷涂缓冲液中洗涤样品 3 次。将样品在4°C下以2，500× g 离心3分钟。
  5. 将样品重悬于1mL冷的1x限制性内切酶缓冲液（50mM乙酸钾，20mM乙酸三酯，10mM乙酸镁，室温下100μg/ mL BSA pH ~8.0）中，并在4°C下以16，000× g 离心3分钟。 将样品放在冰上。重复洗涤1次。
  6. 将样品重悬于 1 mL 冷 1x 限制性内切酶缓冲液中。将样品（每个 0.5 mL）拆分到两个 1.5 mL 微量离心管中。将样品在4°C下以16，000× g 离心3分钟。
  7. 将每个样品中的一根试管重悬于180 μL 1.4x限制性内切酶缓冲液中，含杂交寡核苷酸（见 表2），将一管重悬于180 μL 1.4x限制性内切酶缓冲液中，不杂交寡核苷酸。将每个杂交寡核苷酸重悬于1x TE（10mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0）中，并以7 nM的终浓度使用。1x TE 取代 1.4x 限制性内切酶缓冲液中的杂交寡核苷酸，无需杂交寡核苷酸。
    注意:杂交寡核苷酸必须在工作稀释液下以小等分试样储存在-20°C。杂交寡核苷酸的浓度可能需要优化;请参阅讨论。
  8. 将样品快速冷冻在液氮或干冰/乙醇中并储存在-80°C。 样品可以在此阶段储存数月。

3. 限制性内切酶消化和分子内连接

  1. 将样品在冰上解冻。将一个干浴预热至65°C，将另一个预热至37°C。
  2. 将 36 μL 样品移液到冰上新的 1.5 mL 微量离心管中。立即将剩余样品返回-80°C储存。
  3. 加入 4 μL 1% SDS（0.1% 终浓度），轻轻敲击试管侧面进行混合。在65°C孵育15分钟，每5分钟轻轻敲击一次。孵育后立即将样品放在冰上。
    注意:这种SDS处理在限制性内切酶解和分子内连接步骤之前促进DNA相关蛋白的变性，核包膜的溶解以及染色质的可及性。
  4. 加入 4.5 μL 10% Triton X-100（1% 终浓度）并通过移液混合。向每个样品中加入20-50U限制性内切酶（EcoRI-HF或 HindIII-HF），并在37°C下孵育1小时，每20-30分钟轻轻搅拌一次。在此期间，将干浴预热至55°C，并将水浴预设为16°C。
  5. 向每个样品中加入 8.6 μL 10% SDS（1.5% 终浓度），并通过移液和敲击混合。在55°C孵育10分钟。向每个样品中加入 80 μL 10% Triton X-100（6% 终浓度），并通过移液混合。
  6. 向每个样品中加入 660 μL 不含 ATP 的 1x 连接缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM MgCl2、10 mM DTT、2.5 μg/mL BSA）+ 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA 连接酶（8 U/样品），并通过温和倒置混合。在16°C孵育1.5小时，每30分钟倒置一次。孵育后立即将样品放在冰上。

4. 脱氧核糖核酸纯化

  1. 将一个干浴预热至65°C，将另一个预热至37°C。 向每个样品（12.5 μg/mL 终浓度）中加入 1 μL 10 mg/mL 蛋白酶 K（在 1x TE pH 8.0 中制备）。在65°C孵育30分钟，并在孵育后立即将样品置于冰上，直到它们冷却。
  2. 将样品转移到 2 mL 管中。在通风橱中工作，向每个样品中加入等体积（~800μL）的苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/IA;PH 8.0）。涡旋样品~30秒，并在微量离心机中以16，000× g 离心样品5-10分钟。
  3. 小心地将每个样品的 600 μL 上相取出到新的 1.5 mL 管中。正确处理下相和 2 mL 管。
  4. 通过向每个样品中加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠 pH 5.2 （~60 μL），然后加入 1 体积的异丙醇 （~660 μL） 来沉淀 DNA。将样品倒置5x-10x并在室温下孵育30分钟。
  5. 将样品放在冰上2分钟，然后在微量离心机中以16，500× g 离心15分钟。将样品放回冰中，倒出上清液，然后用纸巾排干试管。
  6. 用 200 μL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。在4°C下以16，500× g 离心3分钟，将样品放回冰上，倒出上清液，然后用移液管除去残留的酒精。用管盖在37°C下打开15-20分钟干燥样品。
  7. 通过涡旋将 DNA 沉淀重悬于 50 μL 的 1x TE 中。在室温下孵育30分钟，涡旋，然后在37°C下在干浴中孵育30分钟。再次涡旋样品，然后将它们放在冰上。样品可以在该阶段在-20°C下储存数月，但建议立即进行去交联（仅限DLC）和qPCR步骤。

5. 补骨脂素交联逆转（仅适用于DLC测定）

  1. 将 9 μL 纯化的 DNA 移液到冰上的 PCR 管中。加入 1 μL 1 M KOH（0.1 M 终浓度）。将样品在90°C下在热循环仪中孵育30分钟。
  2. 加入 19.73 μL 乙酸钠溶液（0.1 M 乙酸钠、9.6 mM Tris-HCl pH 8.0、1.0 mM EDTA pH 8.0）。样品可以在该阶段在-20°C下储存数月，但建议立即进行qPCR步骤。

6. 定量 PCR、对照和分析

  1. 使用2 μL纯化的DNA，有或没有交联，根据制造商的说明建立20 μL qPCR反应。将每个反应一式两份设置。对于DLC和DLE测定，有五个对照反应和一个DLC/DLE定量反应，或每个样品总共六个反应，一式两份运行。补充表 S1和补充 表 S2 提供了设置这些反应和分析的模板，qPCR引物的序列列于 表3中。
  2. 需要针对每个 qPCR 试剂盒优化 qPCR 循环条件。
    1. 使用以下DLC qPCR条件，具体取决于所使用的qPCR试剂盒:初始变性（95°C3分钟）;50轮扩增（单次采集95°C15秒，61°C25秒，72°C15秒）;熔解曲线分析（95°C5秒，65°C1分钟，97°C连续采集）;和冷却（37°C30秒）。
    2. 使用以下qPCR条件进行DLE测定:初始变性（95°C5分钟）;50轮扩增（单次采集95°C15秒，60°C30秒，72°C15秒）;熔解曲线分析（95°C5秒，65°C1分钟，97°C连续采集）;和冷却（37°C30秒）。请注意，可能需要针对不同的qPCR机器/试剂盒进行优化。
  3. 类金刚石检测
    1. 对照:参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看 A 质粒编辑器 （ApE） 文件; 补充序列文件 1-5。
      1. ARG4 的基因组 DNA:使用 olWDH1760/olWDH1761 扩增位于 ARG4 的 dsDNA。将此反应用作加载控件，并规范化除 DLC 信号对此控件的 DLC 信号反应之外的所有其他反应。
      2. DAP2 的分子内连接效率:使用 EcoRI 消化产生的 1，904 bp 片段与 DLC 连接并行进行分子内连接。该连接结的扩增报告分子内连接效率，并作为DLC信号归一化的控制。
      3. DSB 感应:使用 olWDH1766/olWDH1767 放大跨越感应 DSB 的区域。
      4. 补骨脂素交联和切除:使用 olWDH2019/olWDH2020 扩增 EcoRI 识别位点下游的独特 PhiX 区域。在没有交联逆转的情况下，使用ssDNA（无交联）与 ARG4 （交联dsDNA）的比率来确定交联效率。通过交联逆转，切除将导致相对于 ARG4的信号从1逐渐降低到0.5。
      5. 生态I 识别位点恢复和切割:使用 olWDH1768/olWDH1764 在切除的链上放大跨越 DSB 上游恢复的 EcoRI 识别位点的区域。olWDH1769/olWDH1763 扩增跨越 DAP2 处 EcoRI 限制性内切酶位点的区域。在该位点进行EcoRI切割以用作分子内连接对照。
    2. DLC 信号:使用 olWDH1764/olWDH1765 扩增由切除（入侵）链和供体的分子内连接产生的嵌合 DNA 分子。
    3. 分析:计算每个重复反应的Cp值的平均值和标准偏差。使用 ARG4 基因组 DNA qPCR Cp 值作为参考，对所有其他对照 qPCR 进行标准化。将 DLC 信号标准化为 DAP2 的分子内连接对照。有关 2 小时时的典型 DLC 信号值，请参见 图 3 。
  4. DLE 检测
    1. 对照:参见 表3中的qPCR引物列表。引物结合位点图如图 S1所示。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查看质粒编辑器（ApE）文件（补充序列文件1-5）。
      1. ARG4的基因组DNA:见第6.3.1.1节。
      2. YLR050C的分子内连接效率:使用HindIII酶切产生765 bp片段，该片段将与DLE连接平行进行分子内连接。该连接结的扩增报告分子内连接效率，并用作 DLE 信号归一化的对照。
      3. DSB感应:见第6.3.1.3节。
      4. 后III识别位点恢复和切割:使用olWDH2010 / olWDH2012和olWDH2009/2011扩增跨越断裂链上 HindIII限制性内切酶位点的区域，该区域分别被切除和延伸。
    2. DLE信号:使用olWDH2009 / olWDH2010扩增由DSB上游入侵链的切除端的分子内连接到DSB下游新延伸端产生的嵌合DNA分子。
    3. 分析:计算每个重复反应的Cp值的平均值和标准偏差。使用 ARG4 基因组 DNA qPCR Cp 值作为参考，对所有其他对照 qPCR 进行标准化。将 DLE 信号标准化为 YLR050C 的分子内连接对照。6 小时时的典型 DLE 信号值如图 4 和之前的出版物9 中报告。

结果

类金刚石检测
DLC测定可检测由位点特异性DSB侵入单个供体而形成的新生和扩展D环（图2）。补骨脂素交联通过D环内的异质双链DNA 物理 连接断裂的链和供体。在断裂的切除链上使用长杂交寡核苷酸进行限制性内切酶位点恢复，允许限制性内切酶切割，然后将断裂链连接到近端供体以形成通过qPCR定量的嵌合产物。值得注意的是，DLC 信号取决于补骨脂素交...

讨论

所提供的检测方法允许使用邻近连接和qPCR检测新生和扩展的D环（DLC测定），D环延伸（DLE测定）和BIR产物形成（无杂交寡核苷酸的DLE测定）。Rad51 的 ChIP-qPCR 到远离 DSB 的位点之前已被用作 Rad51 介导的同源搜索和 D 环形成的代理。然而，该 ChIP-qPCR 信号与断裂位点和潜在供体之间的序列同源性以及 Rad51 相关因子 Rad54 无关，因此更可能代表 Rad51-ssDNA 细丝与 dsDNA 之间的瞬时关联，而不是 D 环中间体

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

Heyer实验室的工作得到了W.-D.H.的GM58015和GM137751赠款的支持。Piazza实验室的研究得到了欧洲研究委员会（ERC-StG 3D-loop，大协议851006）的支持。D.R.得到了T32CA108459和AP Giannini基金会的支持。我们感谢Shih-Hsun Hung（Heyer实验室）分享他的DLC / DLE检测结果，并额外验证了本协议中详述的检测更改。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottomSuggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shakerSuggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrupSigma-AldrichL1375For media preparation
AgarFisherBP1423500For media preparation
Bacto peptoneBD Difco211840For media preparation
Bacto yeast extractBD Difco212750For media preparation
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4For media preparation
TrioxsalenSigma-AldrichT6137For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, whiteRoche472969200196-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR kit used by the authors

参考文献

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
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