사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

요약

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

초록

세포주기의 S 및 G2 단계에서 발생하는 DNA 이중 가닥 절단 및 가닥 간 교차 결합을 포함한 DNA 손상은 상동 재조합 (HR)에 의해 복구 될 수 있습니다. 또한 HR은 정지 또는 붕괴 후 복제 포크 구조의 중요한 메커니즘을 나타냅니다. 이 복잡한 경로의 많은 가역적 및 비가역적 단계의 조절은 충실도를 촉진합니다. HR 중에 형성된 재조합 중간체의 물리적 분석은 다양한 핵 단백질 인자 및 그 상호 작용자에 의한 이러한 제어의 특성화를 가능하게합니다. 재조합 경로에서 특정 사건과 중간체를 분석하는 잘 확립된 방법이 있지만, 이 경로의 두 가지 중요한 단계인 D-루프 형성 및 확장의 검출은 최근까지 어려운 것으로 판명되었습니다. 여기에서는 HR 경로에서 주요 사건, 즉 DNA 이중 가닥 절단 형성, D-루프 형성, D-루프 확장 및 사카로마이세스 세레비시아에서 절단 유도 복제(BIR)를 통한 생성물 형성을 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 관련 재조합 중간체 및 고감도의 생성물을 검출하며 세포 생존력과 무관합니다. D-루프, D-루프 확장 및 BIR 제품의 검출은 근접 결찰을 기반으로 합니다. 함께, 이러한 분석은 인구 수준에서 HR의 동역학을 연구하여 경로의 중요한 단계에서 HR 단백질 및 조절자의 기능을 미세하게 다룰 수 있습니다.

서문

상동 재조합(HR)은 DNA 이중 가닥 절단(DSB), 가닥 간 교차 링크 및 ssDNA 갭의 복구에 대한 고충실도 메커니즘이자 DNA 손상 내성 경로입니다. HR은 손상되지 않은 상동 말단 접합(NHEJ) 및 전이 합성과 같은 DNA 손상 복구/내성에 대한 오류가 발생하기 쉬운 경로와 다르며, 손상되지 않은 상동 이중 DNA를 기증자로 사용하여 복구 이벤트를 주형화합니다. 또한 HR 경로의 많은 주요 중간체는 가역적이므로 개별 경로 단계를 정교하게 조절할 수 있습니다. 세포 주기의 S, G2 및 M 단계 동안 HR은 2단^DSB1의 수리를 위해 NHEJ와 경쟁합니다. 또한, HR은 ssDNA 갭 및 일방적 DSB를 포함한 복제 관련 DNA 손상의 복구를 위한 DNA 복제에 필수적이며, DNA^{병변 우회의} 메커니즘으로서 2.

HR 경로의 중요한 중간은 변위 루프 또는 D 루프입니다(그림 1). 말단 절제술 후, 반응의 중심 재조합 효소 인 Rad51은 부서진 분자의 새로 절제 된 ssDNA에로드되어 나선형 필라멘트²를 형성합니다. 그런 다음 Rad51은 적절한 상동 공여체, 일반적으로 체세포에서 자매 염색분체를 확인하기 위해 상동성 검색을 수행합니다. D- 루프는 Rad51-ssDNA 필라멘트가 상동 이중 DNA를 침범 할 때 형성되며, 이는 부러진 가닥과 기증자의 상보적인 가닥의 Watson-Crick 염기 쌍으로 이어져 반대쪽 기증자 가닥을 대체합니다. DNA 중합효소에 의한 파손된 가닥의 3' 말단의 확장은 DNA 손상 이벤트 동안 손실된 염기를 대체하고 합성 의존성 가닥 어닐링(SDSA), 이중 할러데이 접합(dHJ) 또는 파손 유도 복제(BIR) HR 하위 경로를 통해 확장된 D-루프 중간체의 dsDNA 생성물로의 분해를 촉진합니다.

HR 경로에서 중간체를 물리적으로 모니터링하는 분석은 각 단계에 대한 유전 적 요구 사항의 분석 (즉, 경로 분석)을 허용합니다. DSB 형성, 말단 절제술, dHJ, BIR 복제 버블 및 HR 생성물은 서던 블로팅 3,4,5,6,7에 의해 쉽게 관찰된다. 그러나 서던 블로팅은 초기 및 확장 D-루프에 대해 보고하지 못하므로 이러한 관절 분자를 안정적으로 측정하기 위한 대체^{방법이 필요합니다4,8,9}. 초기 D-루프 형성을 분석하기 위해 널리 사용되는 전략 중 하나는 정량적 PCR(qPCR)^10,11과 결합된 Rad51의 염색질 면역침전(ChIP)입니다. 그러나, ChIP-qPCR에 의해 측정된 dsDNA와의 Rad51 연관성은 서열 상동성 및 Rad51 부속 인자^{Rad54 10,11}과 무관하다. 대조적으로, D-루프 캡처(DLC) 분석이라고 하는 여기에 제시된 D-루프 분석 방법을 사용하는 상당한 신호는 DSB 형성, 서열 상동성, Rad51 및 Rad51 부속 단백질 Rad52 및 Rad54⁸에 따라 달라집니다. 사카로마이세스 세레비시아에 Rad51-촉진된 D-루프 형성이 생체내 Rad54에 의존한다는 발견은 Rad54가 출아 효모 Rad51에 의한 상동성 검색 및 D-루프 형성에 필요하다는 것을 나타내는 수많은 시험관내 재구성 실험 8,12,13,14,15와 일치한다.

주로 반정량적 PCR을 통해 D-루프 확장을 측정하는 현재의 접근 방식도 마찬가지로 문제가 있습니다. D-루프 확장을 검출하기 위한 전형적인 PCR 기반 분석은 끊어진 가닥에 대한 상동성 영역의 상류에 있는 프라이머와 공여자 가닥에 대한 상동성 영역의 또 다른 프라이머 하류를 통해 절단 부위와 이소성 공여체 사이의 재조합 및 후속 재조합 관련 DNA 합성으로 인한 고유한 서열을 증폭합니다. 이 방법을 사용하여, 재조합 관련 DNA 합성의 검출은 필수적이지 않은 Pol δ 공정성 인자 Pol32¹⁶을 필요로 한다. 이 발견은 POL32 결실이 생체 내^유전자 전환에 경미한 효과 만 갖는다는 관찰과 충돌합니다. 더욱이, 이러한 PCR 기반 분석은 D- 루프 확장 및 BIR 생성물 형성을 일시적으로 해결하지 못하며, 이는 신호가 ssDNA 중간체^17,18,19가 아닌 dsDNA 산물에서 발생한다는 것을 시사한다. D-루프 확장(DLE) 분석은 이러한 불일치를 해결하기 위해 최근에 개발되었습니다. DLE 분석은 초기 3' 침범 말단⁹의 하류에 ~400 염기쌍(bp) 부위에서 재조합 관련 DNA 합성을 정량화합니다. 이 방법에 의해, D-루프 확장은 Pol32와 독립적이며 DSB 유도 후 4시간 이내에 검출될 수 있는 반면, BIR 생성물은 6h에서 처음 관찰된다. 실제로 Haber 및 Malkova 실험실의 최근 간행물에 따르면 이 게놈 DNA 준비 방법을 사용하면 ssDNA 보존 ^9,20이 발생합니다.

여기서, DLC 및 DLE 분석이 상세히 설명된다. 이러한 분석은 근접 결찰에 의존하여 S. cerevisiae에서 초기 및 확장 D- 루프를 감지합니다 (그림 2)^8,9. BIR 제품은 이와 동일한 분석 시스템을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 두 검정 모두에서, 염색체 상의 URA3 유전자좌 (Chr.) V에 위치한 HO 엔도뉴클레아제 절단 부위에서의 DSB 형성은 갈락토스-유도성 프로모터의 조절하에 HO 엔도뉴클레아제의 발현에 의해 유도된다. Rad51 매개 DNA 가닥 침습은 Chr. II의 LYS2 유전자좌에 위치한 이소성 기증자 부위에서 초기 D- 루프 형성을 유도합니다. DSB의 오른쪽은 기증자와의 상동성이 부족하기 때문에 SDSA 및 dHJ 형성을 통한 복구가 불가능합니다. BIR에 의한 DSB의 초기 수리는 가능하지만, 생존 가능한 생성물의 형성은 중심체(²¹)의 존재에 의해 억제된다. 이러한 의도적인 설계는 생산적인 DSB 복구를 방지하여 시간 경과 분석 중에 배양을 추월할 수 있는 복구된 DBS가 있는 세포에 의한 성장 재개를 방지합니다.

DLC 분석에서, D- 루프 내의 헤테로 듀플렉스 DNA의 두 가닥의 소 랄렌 가교는 재조합 중간체를 보존한다. 파손된(절제된) 가닥 및 소화에 대한 제한 효소 부위 복원 후, 가교결합은 상동 파괴 및 공여자 DNA의 상류에서 고유한 서열의 결찰을 허용합니다. qPCR을 사용하여 각 샘플에 존재하는 키메라 DNA 분자의 수준을 정량화합니다. DLE 분석에서, 가교결합은 필요하지 않으며, 제한 효소 부위 복원 및 소화에 이어 분자내 결찰은 대신 부서진 분자의 5' 말단을 새로 확장된 3' 말단에 연결시킨다. 다시 말하지만, qPCR은 각 샘플에서 이 키메라 산물의 상대적인 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 제한 효소 부위 복원이 없는 경우, DLE 분석은 D-루프 확장 후 형성되는 BIR(dsDNA) 생성물의 상대적 수준에 대해 보고합니다.

야생형 균주를 사용한 각각의 분석에 대한 대표적인 결과가 도시되어 있으며, 독자는 재조합 돌연변이체 ^8,9의 분석을 위한 이들 분석의 사용에 대해 Piazza et ^al.8 및 Piazza et ^al.9에 참조된다. 이 기여의 목적은 다른 실험실에서 DLC 및 DLE 분석을 채택할 수 있도록 하는 것이며 요청 시 지원이 제공됩니다.

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프로토콜

1. 사전 성장, DSB 유도 및 샘플 수집

참고: Ade- 균주의 경우 모든 배지에 0.01% 아데닌을 보충하는 것이 좋습니다.

1. 효모 펩톤 덱스트로스 아데닌(YPDA)(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당, 2% 한천, 0.001% 아데닌)에 적절한 반수체 균주( 표 1 참조)를 제거하고 30°C에서 2일 동안 성장시킵니다.
2. 단일 콜로니를 사용하여 15mL 유리 배양 튜브에 5mL의 YPDA를 접종합니다. 폭기를 위해 흔들거나 회전하여 30°C에서 포화 상태로 배양물을 성장시킵니다.
3. DLC 분석: 알루미늄 호일로 싸인 50mL 원추형 튜브에 소랄렌을 용해시켜 흄 후드에서 5x 소랄렌 원액 용액(200프루프 에탄올 중 0.5mg/mL 트리옥살렌)을 연속 흔들거나 반전시키면서 실온에서 밤새 준비합니다. 증발을 방지하기 위해 투명 필름으로 나사 상단을 밀봉하십시오. 소랄렌의 적절한 용해를 보장하기 위해 7mL 원추형 튜브당 50x 소랄렌 원액을 준비하지 마십시오.
4. 다음날, 5mL의 YPDA에서 하룻밤 배양물을 사용하여 적절한 크기의 플라스크에 50-100mL의 YEP-젖산염(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% w/w 젖산염, 0.001% 아데닌)을 접종합니다(신진 효모는 배양 부피의 최소 5배인 플라스크에서 최적으로 자랍니다) ~0.03의 OD₆₀₀ 으로.
5. 220rpm에서 진탕하면서 30°C에서 ~16시간 동안 배양물을 성장시킵니다. ~16시간 후 배양물의 OD₆₀₀ 을 측정하고 ~0.5-0.8이어야 합니다. 덜 자란 문화나 자란 문화를 사용하지 마십시오.
6. 각 시점마다 원추형 튜브에 적절한 양의 세포를 모으고 얼음 위에 놓습니다. 전형적으로, 이는 DLC 분석을 위한 1 x 10⁸ 세포 (반수체 야생형 균주의 경우 OD 600 1.0에서 배양물의 대략 7.5 mL)이고, DLE 분석을 위한 5 x 10⁷ 세포 (_OD600 1.0에서의 배양물의 대략 2.5 mL)이다.
7. OD₆₀₀ 값의 정확성을 보장하기 위해 OD 판독값이 0.2 이하로 유지되도록 OD₆₀₀≥0.2가 있는 배양에 대해 1:5 희석을 준비합니다. 야생형 균주의 경우 DLC 분석을 위한 최적의 시점은 2시간에서 6시간 사이이고 DLE 분석을 위한 최적의 시점은 4시간에서 8시간 사이입니다(그림 3 및 그림 4 참조).
8. DLC 분석
   1. 각 시점 전에 호일로 싸인 50mL 원뿔형 튜브의 모든 샘플에 대해 흄 후드에 충분한 1x 소랄렌 용액(0.1mg/mL 트리옥살렌, 50mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0, 20% 에탄올)을 준비합니다. RT에서 출발하십시오.
   2. 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 흄 후드의 1x 소랄렌 용액 2.5mL에 재현탁하고 60mm x 15mm 페트리 접시에 옮깁니다. 대안적으로, 가교결합이 없는 제어를 위해 2.5mL의 TE1 용액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0)에 펠릿을 재현탁시킨다.
   3. 샘플을 교차 연결합니다. 장파(365nm) 전구에 맞는 UV 가교제의 경우 -20°C에서 사전 냉각된 플라스틱 또는 플렉시 유리 판 위에 뚜껑을 제거한 상태에서 UV 광원 아래 1-2cm 페트리 접시를 놓습니다. UV 라이트 박스의 경우 페트리 접시를 UV 광원 바로 위에 놓습니다. 부드럽게 흔들어 샘플을 10분 동안 노출시킵니다.
      알림: ~50rpm으로 설정된 궤도 셰이커 위에 UV 광원을 설정하는 것이 좋습니다.
   4. 흄 후드에서 샘플을 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 페트리 접시를 2.5mL의 TE1 용액으로 헹구고 이것을 튜브에 첨가하십시오. 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 적절하게 폐기하고, 펠릿을 -20°C에서 보관한다. 샘플은 다음 단계로 이동하기 전에 최대 1주일 동안 보관할 수 있다.
9. DLE 분석
   1. 샘플을 2,500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 스핀을 반복하고 펠릿을 -20 ° C에서 보관하기 전에 2.5mL의 차가운 TE1 용액에서 세포 펠릿을 세척하십시오. 샘플은 다음 단계로 이동하기 전에 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
10. 0 h에서 샘플 수집을 위해, 20% 갈락토오스를 첨가하기 전에 샘플을 수집한다. 후속 시점의 경우 20%의 갈락토오스를 배양물에 첨가하여 최종 농도 2%로 DSB 형성을 유도합니다. 전술한 바와 같이 나머지 샘플을 수집하고, 펠렛을 DSB 유도 후 시간을 기준으로 동결시킨다(즉, 4시간 샘플은 20% 갈락토스를 첨가한 후 4시간 수집된다).

2. 세포 구로 성형, 용해 및 제한 부위 복원

1. 얼음에서 샘플을 해동하십시오. 건조 수조를 30°C로 예열합니다.
2. 샘플을 1mL의 스페로플라스팅 완충액(0.4M 소르비톨, 0.4M KCl, 40mM 인산나트륨 완충액 pH 7.2, 0.5mM_MgCl2)에 재현탁하고 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.
3. 3.5 μL의 자이몰리아제 용액(2% 포도당, 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 5 mg/mL 자이몰리아제 100T, 17.5 μg/mL 자이몰리아제 최종 농도)을 추가합니다. 두드리거나 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 30°C에서 15분 동안 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 15 분 배양 중에 액체 질소 또는 드라이 아이스를 얻습니다.
4. 4°C에서 2,500 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 샘플을 1mL의 스페로플라스팅 완충액에서 3회 세척합니다. 샘플을 4°C에서 2,500 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
5. 샘플을 차가운 1x 제한 효소 완충액 (50mM 칼륨 아세테이트, 20mM 트리스-아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 100μg/mL BSA pH ~8.0 RT에서)에 재현탁하고 3°C에서 16,000x g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 세척을 1 회 반복하십시오.
6. 차가운 1x 제한 효소 버퍼 1mL에 샘플을 재현탁합니다. 시료(각각 0.5mL)를 두 개의 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. 샘플을 4°C에서 16,000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
7. 혼성화 올리고가 있는 1.4x 제한 효소 버퍼 180μL에 각 샘플의 튜브 하나를 재현탁하고( 표 2 참조) 하이브리디징 올리고가 없는 180μL의 1.4x 제한 효소 버퍼에 하나의 튜브를 재현탁합니다. 각각의 혼성화 올리고는 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0)에 재현탁시키고, 7 nM의 최종 농도로 사용한다. 1x TE는 혼성화 올리고 없이 1.4x 제한 효소 완충액에서 혼성화 올리고를 대체합니다.
   참고: 혼성화 올리고는 작업 희석에서 작은 분취량으로 -20°C에서 보관해야 합니다. 혼성화 올리고의 농도는 최적화를 필요로 할 수 있고; 토론을 참조하십시오.
8. 샘플을 액체 질소 또는 드라이 아이스 / 에탄올에 스냅 동결하고 -80 ° C에서 보관하십시오. 샘플은이 단계에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

3. 제한 효소 소화 및 분자 내 결찰

1. 얼음에서 샘플을 해동하십시오. 하나의 건조 수조를 65 ° C로, 다른 건조조를 37 ° C로 예열하십시오.
2. 시료 36μL를 얼음 위의 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 보관을 위해 나머지 샘플을 즉시 -80 ° C로 되돌립니다.
3. 4 μL의 1% SDS(0.1% 최종 농도)를 추가하고 튜브 측면을 가볍게 두드려 혼합합니다. 65 ° C에서 15 분 동안 배양하고 5 분마다 부드럽게 두드리십시오. 배양 직후 얼음 위에 샘플을 놓습니다.
   참고: 이 SDS 처리는 제한 효소 분해 및 분자 내 결찰 단계에 앞서 DNA 관련 단백질의 변성, 핵 외피의 가용화 및 염색질 접근성을 촉진합니다.
4. 4.5μL의 10% Triton X-100(1% 최종 농도)을 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 각 샘플에 20-50U의 제한 효소(EcoRI-HF 또는 HindIII-HF)를 추가하고 37-20분마다 부드러운 교반과 함께 30°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이 시간 동안, 건조 수조를 55°C로 예열하고 수조를 16°C로 미리 설정한다.
5. 각 샘플에 8.6μL의 10% SDS(1.5% 최종 농도)를 추가하고 피펫팅 및 태핑으로 혼합합니다. 55°C에서 10분 동안 배양합니다. 각 샘플에 10% Triton X-100(최종 농도 6%)을 80μL씩 넣고 피펫팅으로 혼합합니다.
6. ATP (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2.5 μg / mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA 리가 아제 (8 U / 샘플)가없는 660 μL의 1x 결찰 완충액을 각 샘플에 추가하고 부드러운 반전으로 혼합합니다. 16 ° C에서 1.5 시간 동안 30 분마다 반전시킵니다. 배양 직후 샘플을 얼음 위에 놓습니다.

4. DNA 정제

1. 하나의 건조 수조를 65 ° C로, 다른 건조조를 37 ° C로 예열하십시오. 각 샘플(12.5μg/mL 최종 농도)에 10mg/mL 프로테이나제 K(1x TE pH 8.0에서 준비)를 1μL를 추가합니다. 65°C에서 30분 동안 배양하고 배양 직후 냉각될 때까지 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
2. 샘플을 2mL 튜브로 옮깁니다. 흄 후드에서 작업하면서 각 샘플에 동일한 부피(~800μL)의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(P/C/IA, pH 8.0)을 추가합니다. 샘플을 ~ 30 초 동안 와류시키고 미세 원심 분리기에서 5 x g에서 10-16,000 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
3. 각 샘플의 상부 단계 600μL를 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 제거합니다. 하부 상과 2mL 튜브를 적절하게 폐기하십시오.
4. 각 샘플에 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 pH 5.2(~60μL)를 추가한 다음 1부피의 이소프로판올(~660μL)을 추가하여 DNA를 침전시킵니다. 샘플을 5x-10x 뒤집고 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
5. 샘플을 얼음 위에 2분 동안 놓은 다음, 샘플을 미세 원심분리기에서 4°C에서 15분 동안 16,500 x g 로 원심분리합니다. 샘플을 얼음으로 되돌리고 상청액을 붓고 종이 타월로 튜브를 배출하십시오.
6. DNA 펠릿을 200 μL의 70% 에탄올로 세척한다. 4°C에서 3분 동안 16,500 x g 로 원심분리하고 샘플을 얼음 위에 다시 놓고 상청액을 붓고 피펫으로 잔류 알코올을 제거합니다. 튜브의 캡을 열어 37 ° C에서 15-20 분 동안 샘플을 건조시킵니다.
7. 볼텍싱을 통해 DNA 펠릿을 50μL의 1x TE에 재현탁시킵니다. RT에서 30분 동안 와류하고, 이어서 37°C에서 건조 수조에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 다시 소용돌이 한 다음 얼음 위에 놓습니다. 샘플은 이 단계에서 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있지만 가교(DLC만 해당) 및 qPCR 단계를 위해 즉시 진행하는 것이 좋습니다.

5. 소랄렌 가교 반전(DLC 분석에만 해당)

1. 정제된 DNA 9μL를 얼음 위의 PCR 튜브에 피펫팅합니다. 1 M KOH (0.1 M 최종 농도)의 1 μL를 첨가한다. 샘플을 열순환기에서 30분 동안 90°C에서 배양합니다.
2. 19.73 μL의 아세트산나트륨 용액(0.1 M 아세트산나트륨, 9.6 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0)을 첨가한다. 샘플은 이 단계에서 -20°C에서 수개월 동안 보관할 수 있지만 즉시 qPCR 단계로 진행하는 것이 좋습니다.

6. 정량적 PCR, 대조군 및 분석

1. 가교 결합 유무에 관계없이 2μL의 정제된 DNA를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 20μL qPCR 반응을 설정합니다. 각 반응을 개별적으로 설정합니다. DLC 및 DLE 분석 모두에 대해 5개의 제어 반응과 1개의 DLC/DLE 정량 반응 또는 샘플당 총 6개의 반응이 중복으로 실행됩니다. 보충 표 S1 및 보충 표 S2 는 이러한 반응 및 분석을 설정하기 위한 주형을 제공하며, qPCR 프라이머의 서열은 표 3에 열거되어 있다.
2. qPCR 사이클링 조건은 각 qPCR 키트에 대해 최적화되어야 합니다.
   1. 사용된 qPCR 키트에 따라 다음 DLC qPCR 조건을 사용하십시오: 초기 변성(3분 동안 95°C); 50 라운드의 증폭 (단일 획득으로 15 초 동안 95 ° C, 25 초 동안 61 ° C, 15 초 동안 72 ° C); 용융 곡선 분석 (5 초 동안 95 ° C, 1 분 동안 65 ° C, 연속 획득시 97 ° C); 및 냉각 (30 초 동안 37 ° C).
   2. DLE 분석에 대해 다음의 qPCR 조건을 사용하십시오: 초기 변성 (5분 동안 95°C); 50 라운드의 증폭 (단일 획득으로 15 초 동안 95 ° C, 30 초 동안 60 ° C, 15 초 동안 72 ° C); 용융 곡선 분석 (5 초 동안 95 ° C, 1 분 동안 65 ° C, 연속 획득시 97 ° C); 및 냉각 (30 초 동안 37 ° C). 다른 qPCR 기계/키트에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
3. DLC 분석
   1. 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 A 플라스미드 편집기(ApE) 파일을 확인하십시오. 보충 시퀀스 파일 1-5.
      1. ARG4의 게놈 DNA: olWDH1760/olWDH1761을 사용하여 ARG4에 있는 dsDNA를 증폭합니다. 이 반응을 부하 제어로 사용하고 이 제어에 대한 DLC 신호 반응을 제외한 다른 모든 반응을 정규화합니다.
      2. DAP2에서의 분자 내 결찰 효율: DLC 결찰과 병행하여 분자 내 결찰을 위해 EcoRI 분해에 의해 생성된 1,904bp 단편을 사용합니다. 이 결찰 접합부를 통한 증폭은 분자 내 결찰 효율에 대해 보고하고 DLC 신호가 정규화되는 제어 역할을 합니다.
      3. DSB 유도: olWDH1766/olWDH1767을 사용하여 유도된 DSB에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다.
      4. 소랄렌 가교 및 절제술: olWDH2019/olWDH2020을 사용하여 EcoRI 인식 부위의 다운스트림에서 고유한 PhiX 영역을 증폭합니다. 가교링크 반전 없이, ARG4 (가교결합된 dsDNA)에 대한 ssDNA(가교결합 없음)의 비율을 사용하여 가교 효율을 결정한다. 가교 링크 반전을 사용하면 절제술은 ARG4에 대한 신호의 1에서 0.5로 점진적으로 감소합니다.
      5. 에코 R I 인식 부위 복원 및 절단: olWDH1768/olWDH1764를 사용하여 절제된 가닥에서 DSB 상류의 복원된 EcoRI 인식 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다. olWDH1769/olWDH1763은 DAP2의 EcoRI 제한 효소 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다. 이 부위에서 EcoRI 절단을 수행하여 분자 내 결찰 제어로 사용합니다.
   2. DLC 신호: olWDH1764/olWDH1765를 사용하여 절제된(침습) 가닥과 기증자의 분자 내 결찰에 의해 생성된 키메라 DNA 분자를 증폭합니다.
   3. 분석: 각 중복 반응에 대한 Cp 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. ARG4 게놈 DNA qPCR Cp 값을 참조로 사용하여 다른 모든 대조군 qPCR을 정규화합니다. DLC 신호를 DAP2의 분자 내 결찰 제어로 정규화합니다. 2h에서의 일반적인 DLC 신호 값은 그림 3 을 참조하십시오.
4. DLE 분석
   1. 대조군: 표 3의 qPCR 프라이머 목록을 참조하십시오. 프라이머 결합 부위의 맵이 도 S1에 도시되어 있다. 관련 게놈 특징 및 앰플리콘에 대한 보충 서열 파일은 플라스미드 편집기(ApE) 파일(보충 서열 파일 1-5)을 확인하십시오.
      1. ARG4의 게놈 DNA : 섹션 6.3.1.1을 참조하십시오.
      2. YLR050C에서의 분자 내 결찰 효율 : HindIII 분해를 사용하여 DLE 결찰과 병행하여 분자 내 결찰을 겪을 765 bp 단편을 만듭니다. 이 결찰 접합부를 통한 증폭은 분자 내 결찰 효율을 보고하고 DLE 신호가 정규화되는 제어 역할을 합니다.
      3. DSB 유도: 섹션 6.3.1.3을 참조하십시오.
      4. 뒷 III 인식 부위 복원 및 절단: olWDH2010/olWDH2012 및 olWDH2009/2011을 사용하여 각각 절제 및 확장된 끊어진 가닥의 HindIII 제한 효소 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭합니다.
   2. DLE 신호: olWDH2009/olWDH2010을 사용하여 DSB 상류의 침입 가닥의 절제된 말단을 DSB의 새로 확장된 하류로 분자 내 결찰하여 생성된 키메라 DNA 분자를 증폭합니다.
   3. 분석: 각 중복 반응에 대한 Cp 값의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. ARG4 게놈 DNA qPCR Cp 값을 참조로 사용하여 다른 모든 대조군 qPCR을 정규화합니다. DLE 신호를 YLR050C에서 분자내 결찰 대조군으로 정규화합니다. 6h에서의 전형적인 DLE 신호 값은 도 4 및 이전 간행물⁹에 보고되어 있다.

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결과

DLC 분석
DLC 분석은 부위별 DSB가 단일 기증자로 침입하여 형성된 초기 및 확장 D-루프를 모두 감지합니다(그림 2). 소랄렌 가교결합은 D-루프 내의 헤테로듀플렉스 DNA를 통해 끊어진 가닥과 기증자를 물리적으로 연결합니다. 절단된 절단 가닥에 긴 혼성화 올리고를 사용한 제한 효소 부위 복원은 제한 효소 절단을 허용한 다음, 파손된 가닥을 근위 공여체?...

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토론

제시된 분석은 근접 결찰 및 qPCR을 사용하여 초기 및 확장 D-루프(DLC 분석), D-루프 확장(DLE 분석) 및 BIR 생성물 형성(혼성화 올리고뉴클레오티드가 없는 DLE 분석)의 검출을 허용합니다. DSB로부터 멀리 떨어진 부위에 대한 Rad51의 ChIP-qPCR은 이전에 Rad51 매개 상동성 검색 및 D 루프 형성을 위한 프록시로서 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 ChIP-qPCR 신호는 Rad51-관련 인자 Rad54뿐만 아니라 중단 부위와 잠재?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors