Détection d’intermédiaires de recombinaison homologues par ligature de proximité et PCR quantitative chez Saccharomyces cerevisiae

Résumé

Les tests de capture de la boucle D (DLC) et d’extension de la boucle D (DLE) utilisent le principe de la ligature de proximité ainsi que la PCR quantitative pour quantifier la formation de la boucle D, l’extension de la boucle D et la formation de produits sur le site d’une rupture double brin inductible chez Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

Les dommages à l’ADN, y compris les cassures double brin de l’ADN et les liaisons croisées inter-brins, subis pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire peuvent être réparés par recombinaison homologue (HR). En outre, HR représente un mécanisme important de sauvetage de la fourche de réplication après un décrochage ou un effondrement. La régulation des nombreuses étapes réversibles et irréversibles de ce parcours complexe favorise sa fidélité. L’analyse physique des intermédiaires de recombinaison formés au cours de la HR permet de caractériser ces contrôles par divers facteurs nucléoprotéiques et leurs interacteurs. Bien qu’il existe des méthodes bien établies pour tester des événements spécifiques et des intermédiaires dans la voie de recombinaison, la détection de la formation et de l’extension de la boucle D, deux étapes critiques de cette voie, s’est avérée difficile jusqu’à récemment. Ici, des méthodes efficaces pour détecter les événements clés dans la voie HR, à savoir la formation de cassures double brin d’ADN, la formation de boucles D, l’extension de boucle D et la formation de produits par réplication induite par rupture (BIR) chez Saccharomyces cerevisiae sont décrites. Ces tests détectent leurs intermédiaires de recombinaison pertinents et leurs produits avec une sensibilité élevée et sont indépendants de la viabilité cellulaire. La détection des boucles D, de l’extension de la boucle D et du produit BIR est basée sur la ligature de proximité. Ensemble, ces tests permettent d’étudier la cinétique de HR au niveau de la population pour aborder finement les fonctions des protéines HR et des régulateurs à des étapes significatives de la voie.

Introduction

La recombinaison homologue (HR) est un mécanisme haute fidélité de réparation des cassures double brin de l’ADN (DSB), des liaisons croisées inter-brins et des lacunes de l’ADNs, ainsi qu’une voie de tolérance aux dommages de l’ADN. HR diffère des voies sujettes aux erreurs pour la réparation / tolérance aux dommages de l’ADN, telles que la jonction terminale non homologue (NHEJ) et la synthèse de translésion, en ce sens qu’elle utilise un ADN duplex homologue intact comme donneur pour modéliser l’événement de réparation. De plus, bon nombre des intermédiaires clés de la voie RH sont réversibles, ce qui permet une régulation exquise des étapes individuelles de la voie. Pendant les phases S, G2 et M du cycle cellulaire, HR est en concurrence avec NHEJ pour la réparation des DSB¹ à deux extrémités. En outre, la HR est essentielle à la réplication de l’ADN pour la réparation des dommages à l’ADN associés à la réplication, y compris les lacunes de l’ADNss et les DSB unilatérales, et en tant que mécanisme de pontage des lésions de l’ADN².

Un intermédiaire critique dans la voie HR est la boucle de déplacement, ou boucle D (Figure 1). Après la résection finale, la recombinase centrale dans la réaction, Rad51, se charge sur l’ADNss nouvellement réséqué de la molécule brisée, formant un filament hélicoïdal². Rad51 effectue ensuite une recherche d’homologie pour identifier un donneur homologue approprié, généralement la chromatide sœur dans les cellules somatiques. La boucle D est formée lorsque le filament Rad51-ssDNA envahit un ADN duplex homologue, ce qui conduit à l’appariement de la base Watson-Crick du brin brisé avec le brin complémentaire du donneur, déplaçant le brin donneur opposé. L’extension de l’extrémité 3' du brin brisé par une ADN polymérase remplace les bases qui ont été perdues lors de l’événement de dommages à l’ADN et favorise la résolution de l’intermédiaire de la boucle D étendue en un produit d’ADNds par le recuit du brin dépendant de la synthèse (SDSA), la jonction double Holliday (dHJ) ou les sous-voies HR de réplication induite par rupture (BIR).

Les tests qui surveillent physiquement les intermédiaires dans la voie HR permettent d’analyser les besoins génétiques pour chaque étape (c.-à-d. l’analyse de la voie). La formation de DSB, la résection terminale, les dHJ, les bulles de réplication BIR et les produits HR sont facilement observés par transfert de Southern 3,4,5,6,7. Pourtant, le transfert de Southern ne rend pas compte des boucles D naissantes et étendues et, par conséquent, une méthode alternative pour mesurer de manière fiable ces molécules articulaires est nécessaire ^4,8,9. Une stratégie largement utilisée pour analyser la formation naissante de boucles D est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de Rad51 couplée à la PCR quantitative (qPCR)^10,11. Cependant, l’association Rad51 avec l’ADNds telle que mesurée par ChIP-qPCR est indépendante de l’homologie de séquence et du facteur accessoire Rad51 Rad54^10,11. En revanche, un signal appréciable utilisant la méthode d’analyse de boucle D présentée ici, appelée test de capture de boucle D (DLC), dépend de la formation de DSB, de l’homologie de séquence, de Rad51 et des protéines accessoires Rad51 Rad52 et Rad54⁸. La découverte que la formation de la boucle D favorisée par Saccharomyces cerevisiae Rad51 dépend de Rad54 in vivo est en accord avec de nombreuses expériences de reconstitution in vitro indiquant que Rad54 est nécessaire pour la recherche d’homologie et la formation de boucles D par la levure bourgeonnante Rad51 8,12,13,14,15.

Les approches actuelles de mesure de l’extension de la boucle D, principalement par PCR semi-quantitative, sont tout aussi problématiques. Un test typique basé sur la PCR pour détecter l’extension de la boucle D amplifie une séquence unique, résultant de la recombinaison entre un site de rupture et un donneur ectopique et de la synthèse ultérieure de l’ADN associée à la recombinaison, via une amorce en amont de la région d’homologie sur le brin brisé et une autre amorce en aval de la région d’homologie sur le brin donneur. En utilisant cette méthode, la détection de la synthèse d’ADN associée à la recombinaison nécessite le facteur de processivité non essentiel Pol δ Pol32¹⁶. Cette découverte est en contradiction avec l’observation selon laquelle la délétion de POL32 n’a qu’un effet léger sur la conversion génique in vivo¹⁷. De plus, ces tests basés sur la PCR ne parviennent pas à résoudre temporellement l’extension de la boucle D et la formation de produits BIR, ce qui suggère que le signal résulte de produits ADNds plutôt que d’intermédiaires de l’ADNss^17,18,19. Le test d’extension de la boucle D (DLE) a récemment été développé pour corriger ces divergences. Le test DLE quantifie la synthèse d’ADN associée à la recombinaison sur un site ~400 paires de bases (pb) en aval de l’extrémité^{initiale envahissante 3' 9}. Par cette méthode, l’extension de la boucle D est indépendante de Pol32 et est détectable dans les 4 h suivant l’induction DSB, tandis que les produits BIR sont observés pour la première fois à 6 h. En effet, une publication récente des laboratoires Haber et Malkova a noté que l’utilisation de cette méthode de préparation de l’ADN génomique aboutit singulièrement à la préservation de l’ADNss ^9,20.

Ici, les tests DLC et DLE sont décrits en détail. Ces tests reposent sur la ligature de proximité pour détecter les boucles D naissantes et étendues chez S. cerevisiae (Figure 2)^8,9. Les produits BIR peuvent être quantifiés à l’aide de ce même système de dosage. Pour les deux essais, la formation de DSB à un site de coupe de l’endonucléase HO situé au locus URA3 sur le chromosome (Chr.) V est induite par l’expression de l’endonucléase HO sous le contrôle d’un promoteur inductible par le galactose. L’invasion de brins d’ADN médiée par Rad51 conduit à la formation naissante d’une boucle D sur le site d’un donneur ectopique situé au locus LYS2 sur Chr. II. Comme le côté droit du DSB n’a pas d’homologie avec le donneur, la réparation via SDSA et la formation de dHJ n’est pas réalisable. La réparation initiale du DSB par BIR est possible, mais la formation de produits viables est inhibée par la présence du centromère²¹. Cette conception délibérée empêche la réparation productive du DSB, évitant ainsi la reprise de la croissance par les cellules avec des DBS réparés, qui pourraient autrement dépasser la culture pendant l’analyse du cours du temps.

Dans le test DLC, la réticulation psoralène des deux brins de l’ADN hétéroduplex dans la boucle D préserve l’intermédiaire de recombinaison. Après la restauration du site enzymatique de restriction sur le brin brisé (réséqué) et la digestion, la réticulation permet la ligature des séquences uniques en amont de l’ADN homologue brisé et donneur. À l’aide de la qPCR, le niveau de molécule d’ADN chimérique présente dans chaque échantillon est quantifié. Dans le test DLE, la réticulation n’est pas nécessaire, et la restauration du site enzymatique de restriction et la digestion suivies d’une ligature intramoléculaire relient plutôt l’extrémité 5' de la molécule cassée à l’extrémité 3' nouvellement étendue. Encore une fois, la qPCR est utilisée pour quantifier les quantités relatives de ce produit chimérique dans chaque échantillon. En l’absence de restauration du site enzymatique de restriction, le test DLE rend compte des niveaux relatifs du produit BIR (ADNds) qui se forme après l’extension de la boucle D.

Des résultats représentatifs pour chaque essai utilisant une souche de type sauvage sont présentés, et les lecteurs sont invités à se reporter à Piazza et al.8 et Piazza et al.9 pour l’utilisation de ces essais pour l’analyse des mutants de recombinaison ^8,9. L’objectif de cette contribution est de permettre à d’autres laboratoires d’adopter les tests DLC et DLE, et un soutien est disponible sur demande.

Protocole

1. Pré-croissance, induction DSB et prélèvement d’échantillons

REMARQUE: La supplémentation de tous les milieux avec 0,01% d’adénine est recommandée pour les souches Ade-.

1. Étaler les souches haploïdes appropriées (voir tableau 1) sur peptone de levure dextrose adénine (YPDA) (extrait de levure 1%, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar-agar, 0,001% adénine) et cultiver pendant 2 jours à 30 ° C.
2. Utiliser une seule colonie pour inoculer 5 mL de YPDA dans un tube de culture en verre de 15 mL. Cultiver les cultures jusqu’à saturation à 30 °C en agitant ou en rotation pour l’aération.
3. Dosage DLC : Préparer la solution mère de psoralène 5x (0,5 mg/mL de trioxsalène dans de l’éthanol 200-proof) dans une hotte en dissolvant le psoralène dans un tube conique de 50 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium pendant la nuit à température ambiante avec agitation ou inversion continue. Scellez le bouchon à vis avec un film transparent pour empêcher l’évaporation. Ne pas préparer plus de 7 mL de 5x solution mère de psoralène par tube conique de 50 ml pour assurer une dissolution adéquate du psoralène.
4. Le lendemain, utiliser 5 mL de la culture de nuit du YPDA cultivé pour inoculer 50 à 100 mL de YEP-lactate (extrait de levure à 1 %, 2 % de peptone, 2 % p/p de lactate, 0,001 % d’adénine) dans une fiole de taille appropriée (la levure bourgeonnante pousse de façon optimale dans un flacon d’au moins 5 fois le volume de la culture) à une DO₆₀₀ de ~0,03.
5. Cultiver la culture pendant ~16 h à 30 °C en agitant à 220 tr/min. Après ~16 h, mesurez le OD₆₀₀ de la culture et il devrait être ~0,5-0,8. N’utilisez pas de cultures sous-envahies ou envahies par la végétation.
6. Pour chaque point temporel, recueillir le volume approprié de cellules dans un tube conique et placer sur de la glace. En règle générale, il s’agit de 1 x 10⁸ cellules (environ 7,5 mL de culture à OD 600 1,0 pour une souche haploïde de type sauvage) pour le test DLC et de 5 x 10⁷ cellules (environ 2,5 mL de culture à OD₆₀₀ 1,0) pour le test DLLE.
7. Pour garantir l’exactitude des valeurs de DO 600, préparer des dilutions 1:5 pour les cultures ayant une DO₆₀₀≥0,2 afin de maintenir la lecture de la DO à 0,2 ou moins. Pour les souches de type sauvage, les points de temps optimaux pour l’analyse DLC sont compris entre 2 h et 6 h, et les points de temps optimaux pour l’analyse DLE sont compris entre 4 h et 8 h (voir Figure 3 et Figure 4).
8. Dosage DLC
   1. Avant chaque point temporel, préparer suffisamment de 1x solution de psoralène (0,1 mg/mL de trioxsalen, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM d’EDTA pH 8,0, 20 % d’éthanol) dans une hotte pour tous les échantillons dans un tube conique de 50 ml enveloppé dans une feuille d’aluminium. Partir à RT.
   2. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez la pastille en suspension dans 2,5 mL de 1x solution de psoralène dans une hotte et transférez-la dans une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm. Vous pouvez également remettre la pastille en suspension dans 2,5 mL de solution TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) pour un contrôle sans réticulation.
   3. Réticulez les échantillons. Pour un agent de réticulation UV adapté aux ampoules à ondes longues (365 nm), placez les boîtes de Petri à 1-2 cm sous la source de lumière UV avec le couvercle retiré sur une plaque en plastique ou en plexiglas qui a été pré-refroidie à -20 ° C. Pour une boîte de lumière UV, placez les boîtes de Petri directement sur la source de lumière UV. Exposer les échantillons pendant 10 min en secouant doucement.
      REMARQUE: Il est recommandé de régler la source de lumière UV sur un agitateur orbital réglé à ~ 50 tr / min.
   4. Dans une hotte, transférer l’échantillon dans un nouveau tube de 15 mL. Rincer la boîte de Petri avec 2,5 ml de solution TE1 et l’ajouter au tube. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C, éliminer correctement le surnageant et conserver la pastille à −20 °C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine avant de passer à l’étape suivante.
9. Dosage DLE
   1. Centrifuger les échantillons à 2 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Laver la pastille de la cellule dans 2,5 mL de solution TE1 froide avant de répéter l’essorage et de stocker les pastilles à −20 °C. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à 1 semaine avant de passer à l’étape suivante.
10. Pour le prélèvement d’échantillons à 0 h, prélever les échantillons avant l’ajout de 20% de galactose. Pour les points temporels suivants, induire la formation de DSB en ajoutant 20% de galactose aux cultures jusqu’à une concentration finale de 2%. Prélever les échantillons restants comme décrit ci-dessus, la pastille et la congeler par rapport au temps suivant l’induction du DSB (c.-à-d. que l’échantillon de 4 heures est prélevé 4 heures après l’ajout de 20 % de galactose).

2. Sphéroplastie cellulaire, lyse et restauration du site de restriction

1. Décongeler les échantillons sur la glace. Préchauffer un bain sec à 30 °C.
2. Resuspendre les échantillons dans 1 mL de tampon de sphérosablage (0,4 M de sorbitol, 0,4 M de KCl, 40 mM de tampon de phosphate de sodium pH 7,2, 0,5 mM de MgCl₂) et transférer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
3. Ajouter 3,5 μL de solution de zymolyase (glucose à 2 %, 50 mM de Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/mL de zymolyase 100T; concentration finale de 17,5 μg/mL de zymolyase). Mélanger doucement en tapotant ou en inversant. Incuber à 30 °C pendant 15 min, puis déposer sur la glace. Pendant les 15 minutes d’incubation, obtenir de l’azote liquide ou de la glace sèche.
4. Centrifuger pendant 3 min à 2 500 x g à 4 °C et déposer les échantillons sur de la glace. Lavez les échantillons 3x dans 1 mL de tampon de pulvérisation. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 2 500 x g à 4 °C.
5. Resuspendre les échantillons dans 1 mL de tampon enzymatique de restriction 1x froid (50 mM d’acétate de potassium, 20 mM de tris-acétate, 10 mM d’acétate de magnésium, 100 μg/mL de BSA pH ~8,0 à TA) et centrifuger pendant 3 min à 16 000 x g à 4 °C. Placez les échantillons sur de la glace. Répétez le lavage 1x.
6. Remettez les échantillons en suspension dans 1 mL de tampon enzymatique de restriction 1x froid. Diviser l’échantillon (0,5 mL chacun) en deux tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Centrifuger les échantillons pendant 3 min à 16 000 x g à 4 °C.
7. Resuspendre un tube de chaque échantillon dans 180 μL de tampon enzymatique de restriction 1,4x avec oligos hybridants (voir tableau 2) et un tube dans 180 μL de tampon enzymatique de restriction 1,4x sans oligos hybridants. Chaque oligo hybridant est remis en suspension dans 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) et utilisé à une concentration finale de 7 nM. Le 1x TE remplace les oligos hybridants dans le tampon enzymatique de restriction 1.4x sans oligos hybridants.
   NOTA: Les oligos hybridants doivent être conservés à −20 °C dans de petites aliquotes à la dilution de travail. La concentration des oligos hybridants peut nécessiter une optimisation; voir Discussion.
8. Congeler les échantillons dans de l’azote liquide ou de la glace sèche/éthanol et les conserver à −80 °C. Les échantillons peuvent être stockés à ce stade pendant plusieurs mois.

3. Digestion enzymatique de restriction et ligature intramoléculaire

1. Décongeler les échantillons sur la glace. Préchauffer un bain sec à 65 °C et un autre à 37 °C.
2. Pipet 36 μL de l’échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL sur glace. Remettre rapidement l’échantillon restant à −80 °C pour l’entreposage.
3. Ajouter 4 μL de SDS à 1 % (concentration finale de 0,1 %) et mélanger en tapotant doucement le côté du tube. Incuber à 65 °C pendant 15 min en tapotant doucement toutes les 5 minutes. Placer les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation.
   REMARQUE: Ce traitement SDS favorise la dénaturation des protéines associées à l’ADN, la solubilisation de l’enveloppe nucléaire et l’accessibilité de la chromatine avant les étapes de digestion enzymatique de restriction et de ligature intramoléculaire.
4. Ajouter 4,5 μL de Triton X-100 à 10 % (concentration finale de 1 %) et mélanger par pipetage. Ajouter 20-50 U d’enzyme de restriction (EcoRI-HF ou HindIII-HF) à chaque échantillon et incuber à 37 °C pendant 1 h en agitant doucement toutes les 20-30 min. Pendant ce temps, préchauffez un bain sec à 55 °C et préréglez un bain-marie à 16 °C.
5. Ajouter 8,6 μL de SDS à 10 % (concentration finale de 1,5 %) à chaque échantillon et mélanger par pipetage et taraudage. Incuber à 55 °C pendant 10 min. Ajouter 80 μL de Triton X-100 à 10 % (concentration finale de 6 %) à chaque échantillon et mélanger par pipetage.
6. Ajouter 660 μL de tampon de ligature 1x sans ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 ADN ligase (8 U/échantillon) à chaque échantillon et mélanger par inversion douce. Incuber à 16 °C pendant 1,5 h avec inversion toutes les 30 min. Placez les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation.

4. Purification de l’ADN

1. Préchauffer un bain sec à 65 °C et un autre à 37 °C. Ajouter 1 μL de 10 mg/mL de protéinase K (préparée dans 1x TE pH 8,0) à chaque échantillon (concentration finale de 12,5 μg/mL). Incuber à 65 °C pendant 30 min et placer les échantillons sur de la glace immédiatement après l’incubation jusqu’à refroidissement.
2. Transférer les échantillons dans des tubes de 2 mL. En travaillant dans une hotte, ajouter un volume égal (~800 μL) de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (P/C/IA; PH 8,0) à chaque échantillon. Vortex les échantillons pendant ~30 s et centrifuger les échantillons pendant 5-10 min à 16 000 x g dans une microcentrifugeuse.
3. Prélever délicatement 600 μL de la phase supérieure de chaque échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL. Éliminez correctement la phase inférieure et les tubes de 2 mL.
4. Précipiter l’ADN en ajoutant un volume 1/10 d’acétate de sodium 3 M pH 5,2 (~60 μL) à chaque échantillon, suivi de 1 volume d’isopropanol (~660 μL). Retourner les échantillons 5x-10x et incuber à TA pendant 30 min.
5. Placer les échantillons sur de la glace pendant 2 min, puis centrifuger les échantillons à 16 500 x g pendant 15 min à 4 °C dans une microcentrifugeuse. Remettre les échantillons dans la glace, verser le surnageant et égoutter le tube sur une serviette en papier.
6. Lavez la pastille d’ADN avec 200 μL d’éthanol à 70%. Centrifuger à 16 500 x g pendant 3 min à 4 °C, remettre les échantillons sur de la glace, verser le surnageant et retirer l’alcool résiduel à l’aide d’une pipette. Sécher les échantillons avec les bouchons des tubes ouverts à 37 °C pendant 15-20 min.
7. Remettez en suspension les pastilles d’ADN dans 50 μL de 1x TE par vortex. Incuber à TA pendant 30 min, vortex, puis incuber à 37 °C dans un bain sec pendant 30 min. Vortex les échantillons à nouveau, puis placez-les sur de la glace. Les échantillons peuvent être conservés à ce stade à -20 °C pendant plusieurs mois, mais il est conseillé de procéder immédiatement pour les étapes de réticulation (DLC uniquement) et de qPCR.

5. Inversion de réticulation du psoralène (pour le dosage DLC uniquement)

1. Piper 9 μL d’ADN purifié dans un tube de PCR sur glace. Ajouter 1 μL de 1 M KOH (concentration finale de 0,1 M). Incuber les échantillons à 90 °C pendant 30 min dans un thermocycleur.
2. Ajouter 19,73 μL de solution d’acétate de sodium (0,1 M d’acétate de sodium, 9,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM d’EDTA pH 8,0). Les échantillons peuvent être conservés à ce stade à -20 °C pendant plusieurs mois, mais il est conseillé de passer immédiatement à l’étape qPCR.

6. PCR quantitative, contrôles et analyse

1. En utilisant 2 μL d’ADN purifié, avec ou sans réticulation, mettre en place une réaction qPCR de 20 μL selon les instructions du fabricant. Configurez chaque réaction en double. Pour les tests DLC et DLLE, il y a cinq réactions de contrôle et une réaction de quantification DLC/DLLE, soit un total de six réactions par échantillon, exécutées en double. Le tableau supplémentaire S1 et le tableau supplémentaire S2 fournissent un modèle pour la mise en place de ces réactions et analyses, et les séquences des amorces qPCR sont énumérées dans le tableau 3.
2. Les conditions de cycle qPCR doivent être optimisées pour chaque kit qPCR.
   1. Utilisez les conditions de qPCR DLC suivantes, en fonction des kits qPCR utilisés : dénaturation initiale (95 °C pendant 3 min) ; 50 tours d’amplification (95 °C pendant 15 s, 61 °C pendant 25 s, 72 °C pendant 15 s avec une seule acquisition); analyse de la courbe de fusion (95 °C pendant 5 s, 65 °C pendant 1 min, 97 °C avec acquisition continue); et refroidissement (37 °C pendant 30 s).
   2. Utiliser les conditions qPCR suivantes pour le test DLE : dénaturation initiale (95 °C pendant 5 min) ; 50 tours d’amplification (95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 15 s avec une seule acquisition); analyse de la courbe de fusion (95 °C pendant 5 s, 65 °C pendant 1 min, 97 °C avec acquisition continue); et refroidissement (37 °C pendant 30 s). Notez qu’une optimisation pour différents machines/kits qPCR peut être nécessaire.
3. Dosage DLC
   1. Contrôles : Voir la liste des amorces qPCR dans le tableau 3. Une carte des sites de liaison de l’amorce est présentée à la figure S1. Pour les fichiers de séquence supplémentaires pour les caractéristiques génomiques et les amplicons pertinents, consultez les fichiers A plasmid Editor (ApE); Fichiers de séquences supplémentaires 1 à 5.
      1. ADN génomique à ARG4: Utilisez olWDH1760 / olWDH1761 pour amplifier l’ADNds situé à ARG4. Utilisez cette réaction comme contrôle de charge et normalisez toutes les autres réactions à l’exception de la réaction du signal DLC à ce contrôle.
      2. Efficacité de la ligature intramoléculaire au niveau DAP2 : Utilisez le fragment de 1 904 pb créé par la digestion EcoRI pour la ligature intramoléculaire en parallèle avec la ligature DLC. L’amplification à travers cette jonction de ligature rend compte de l’efficacité de la ligature intramoléculaire et sert de contrôle auquel le signal DLC est normalisé.
      3. Induction DSB : Utilisez olWDH1766/olWDH1767 pour amplifier une région qui couvre le DSB induit.
      4. Réticulation et résection du psoralène : Utilisez olWDH2019/olWDH2020 pour amplifier la région unique de PhiX en aval du site de reconnaissance EcoRI. Sans inversion de réticulation, utilisez le rapport de l’ADNss (pas de réticulation) sur ARG4 (ADNds réticulé) pour déterminer l’efficacité de réticulation. Avec l’inversion de la réticulation, la résection entraînera une diminution progressive de 1 à 0,5 du signal par rapport à ARG4.
      5. EcoR Restauration et découpe du site de reconnaissance I : Utiliser olWDH1768/olWDH1764 pour amplifier une région qui s’étend sur le site de reconnaissance EcoRI restauré en amont du DSB sur le brin réséqué. olWDH1769/olWDH1763 amplifient une région qui s’étend sur le site de l’enzyme de restriction EcoRI au niveau de DAP2. Effectuer le clivage EcoRI à ce site pour l’utiliser comme contrôle de ligature intramoléculaire.
   2. Signal DLC: Utilisez olWDH1764 / olWDH1765 pour amplifier la molécule d’ADN chimérique créée par ligature intramoléculaire du brin réséqué (envahissant) et du donneur.
   3. Analyse : Calculez la moyenne et l’écart-type des valeurs Cp pour chacune des réactions en double. Utilisez les valeurs de cp qPCR de l’ADN génomique ARG4 comme référence pour normaliser toutes les autres qPCR de contrôle. Normaliser le signal DLC au contrôle de ligature intramoléculaire au niveau DAP2. Voir la figure 3 pour connaître les valeurs typiques du signal DLC à 2 h.
4. Dosage DLE
   1. Contrôles : Voir la liste des amorces qPCR dans le tableau 3. Une carte des sites de liaison de l’amorce est présentée à la figure S1. Pour les fichiers de séquences supplémentaires pour les caractéristiques génomiques et les amplicons pertinents, consultez les fichiers de l’éditeur de plasmide A (ApE) (fichiers de séquence supplémentaires 1 à 5).
      1. ADN génomique à ARG4 : Voir rubrique 6.3.1.1.
      2. Efficacité de la ligature intramoléculaire à YLR050C: Utilisez la digestion HindIII pour créer un fragment de 765 pb qui subira une ligature intramoléculaire parallèlement à la ligature DLE. L’amplification à travers cette jonction de ligature rend compte de l’efficacité de la ligature intramoléculaire et sert de contrôle auquel le signal DLE est normalisé.
      3. Induction DSB: Voir section 6.3.1.3.
      4. Biche Restauration et coupe du site de reconnaissance III : Utiliser olWDH2010/olWDH2012 et olWDH2009/2011 pour amplifier une région qui s’étend sur les sites de l’enzyme de restriction HindIII sur le brin brisé où elle a été réséquée et étendue, respectivement.
   2. Signal DLE: Utilisez olWDH2009 / olWDH2010 pour amplifier la molécule d’ADN chimérique créée par ligature intramoléculaire de l’extrémité réséquée du brin envahissant en amont du DSB jusqu’à l’extrémité nouvellement étendue en aval du DSB.
   3. Analyse : Calculez la moyenne et l’écart-type des valeurs Cp pour chacune des réactions en double. Utilisez les valeurs de cp qPCR de l’ADN génomique ARG4 comme référence pour normaliser toutes les autres qPCR de contrôle. Normaliser le signal DLE au contrôle de ligature intramoléculaire à YLR050C. Les valeurs typiques du signal DLE à 6 h sont rapportées dans la figure 4 et les publications précédentes⁹.

Résultats

Dosage DLC
Le test DLC détecte à la fois les boucles D naissantes et étendues formées par l’invasion d’un DSB spécifique au site en un seul donneur (Figure 2). La réticulation psoralène relie physiquement le brin brisé et le donneur via l’ADN hétéroduplex dans la boucle D. La restauration du site enzymatique de restriction avec un long oligo hybridant sur le brin réséqué de la rupture permet un clivage de l’enzyme de restriction, suivi d’un...

Discussion

Les tests présentés permettent de détecter les boucles D naissantes et étendues (test DLC), l’extension de la boucle D (test DLLE) et la formation de produits BIR (test DLE sans oligonucléotides hybridants) en utilisant la ligature de proximité et la qPCR. ChIP-qPCR de Rad51 vers des sites éloignés du DSB a déjà été utilisé comme proxy pour la recherche d’homologie médiée par Rad51 et la formation de boucles D. Cependant, ce signal ChIP-qPCR est indépendant de l’homologie de séquence entre le site ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors