JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

נזק לדנ"א, כולל שברים דו-גדיליים בדנ"א וקישורים צולבים בין גדילים, שנגרם במהלך שלבי S ו-G2 של מחזור התא, ניתן לתיקון על-ידי רקומבינציה הומולוגית (HR). בנוסף, HR מייצג מנגנון חשוב של חילוץ מזלג שכפול לאחר עיכוב או קריסה. הסדרת הצעדים הרבים ההפיכים והבלתי הפיכים של מסלול מורכב זה מקדמת את נאמנותו. הניתוח הפיזיקלי של מתווכי הרקומבינציה שנוצרו במהלך HR מאפשר לאפיין בקרות אלה על ידי גורמי נוקלאופרוטאין שונים והאינטראקטורים שלהם. למרות שישנן שיטות מבוססות היטב לבחון אירועים ומתווכים ספציפיים במסלול הרקומבינציה, זיהוי היווצרות והרחבה של לולאת D, שני שלבים קריטיים במסלול זה, התגלה כמאתגר עד לאחרונה. כאן מתוארות שיטות יעילות לאיתור אירועי מפתח במסלול HR, כלומר היווצרות שבירה דו-גדילית של DNA, היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באמצעות שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR) ב- Saccharomyces cerevisiae . מבחנים אלה מזהים את חומרי הביניים והמוצרים הרקומבינציה הרלוונטיים שלהם ברגישות גבוהה ואינם תלויים בכדאיות התאית. הזיהוי של לולאות D, הרחבת D-loop ומוצר ה- BIR מבוסס על קשירת קרבה. יחד, מבחנים אלה מאפשרים לחקור את הקינטיקה של HR ברמת האוכלוסייה כדי לטפל בעדינות בתפקודים של חלבוני משאבי אנוש ורגולטורים בשלבים משמעותיים במסלול.

Introduction

רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מנגנון בעל נאמנות גבוהה של תיקון שברים דו-גדיליים בדנ"א (DSBs), קישורים צולבים בין גדילים ופערי ssDNA, כמו גם מסלול לעמידות בפני נזקי DNA. HR שונה ממסלולים מועדים לשגיאות לתיקון/סובלנות נזקי DNA, כגון צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) וסינתזת טרנסלציה, בכך שהוא משתמש בדנ"א דופלקס שלם והומולוגי כתורם לעיצוב אירוע התיקון. יתר על כן, רבים מהמתווכים המרכזיים במסלול משאבי אנוש הם הפיכים, ומאפשרים ויסות מעולה של שלבי המסלול הבודדים. במהלך שלבי S, G2 ו-M של מחזור התא, HR מתחרה עם NHEJ על תיקון ה-DSBs1 הדו-קצוות. בנוסף, HR חיוני לשכפול דנ"א לתיקון נזקי דנ"א הקשורים לשכפול, כולל פערי ssDNA ו- DSBs חד-צדדיים, וכמנגנון של מעקף נגע DNA2.

אמצעי ביניים קריטי במסלול משאבי אנוש הוא לולאת התזוזה, או לולאת D (איור 1). לאחר כריתת הסוף, הרקומבינאז המרכזי בתגובה, Rad51, נטען על ה-ssDNA החדש של המולקולה השבורה, ויוצר נימה סלילית2. לאחר מכן Rad51 מבצע חיפוש הומולוגי כדי לזהות תורם הומולוגי מתאים, בדרך כלל כרומטיד האחות בתאים סומטיים. לולאת D נוצרת כאשר נימה Rad51-ssDNA פולשת לדנ"א דופלקס הומולוגי, מה שמוביל לזיווג בסיס ווטסון-קריק של הגדיל השבור עם הגדיל המשלים של התורם, תוך הזזת גדיל התורם הנגדי. הרחבה של קצה ה-3' של הגדיל השבור על ידי פולימראז דנ"א מחליפה את הבסיסים שאבדו במהלך אירוע הנזק לדנ"א ומקדמת את הרזולוציה של ביניים לולאת D המורחבת למכפלת dsDNA באמצעות חישול גדיל תלוי סינתזה (SDSA), צומת הולידיי כפול (dHJ), או תת-מסלולי HR של שכפול המושרה על ידי שבירה (BIR).

בדיקות המנטרות פיזית את המתווכים במסלול משאבי אנוש מאפשרות ניתוח של הדרישות הגנטיות לכל שלב (כלומר, ניתוח מסלול). היווצרות DSB, כריתת קצה, dHJs, בועות שכפול BIR ומוצרי HR נצפים בקלות על ידי כתם דרומי 3,4,5,6,7. עם זאת, כתם דרומי אינו מדווח על לולאות D מתהוות ומורחבות, ולכן נדרשתשיטה חלופית למדידה אמינה של מולקולות מפרקים אלה 4,8,9. אסטרטגיה נפוצה אחת לניתוח היווצרות לולאת D מתהווה היא כרומטין-מיצוי חיסוני (ChIP) של Rad51 בשילוב עם PCR כמותי (qPCR)10,11. עם זאת, הקשר של Rad51 עם dsDNA כפי שנמדד על ידי ChIP-qPCR אינו תלוי בהומולוגיה של רצף ובגורם האביזרים Rad51 Rad5410,11. לעומת זאת, אות ניכר המשתמש בשיטה של ניתוח לולאת D המוצגת כאן, הנקראת בדיקת לכידת לולאת D (DLC), תלוי בהיווצרות DSB, הומולוגיה של רצף, Rad51, וחלבוני העזר Rad51 Rad52 ו- Rad548. הממצא כי Saccharomyces cerevisiae Rad51-מקודם D-loop היווצרות תלויה ב- Rad54 in vivo עולה בקנה אחד עם ניסויים רבים בשחזור חוץ גופי המצביעים על כך ש- Rad54 נדרש לחיפוש הומולוגי ויצירת לולאת D על ידי ניצני שמרים Rad51 8,12,13,14,15.

הגישות הנוכחיות למדידת הארכת לולאת D, בעיקר באמצעות PCR כמותי למחצה, הן בעייתיות באופן דומה. בדיקה טיפוסית מבוססת PCR לאיתור הארכת D-loop מגבירה רצף ייחודי, הנובע מרקומבינציה בין אתר הפסקה לתורם חוץ רחמי ומסינתזת הדנ"א הקשורה לרקומבינציה שלאחר מכן, באמצעות פריימר במעלה הזרם של אזור ההומולוגיה על הגדיל השבור ופריימר נוסף במורד הזרם של אזור ההומולוגיה על גדיל התורם. באמצעות שיטה זו, זיהוי של סינתזת DNA הקשורה לרקומבינציה דורש את גורם העיבוד הלא חיוני של Pol δ Pol3216. ממצא זה סותר את התצפית כי למחיקה של POL32 יש השפעה קלה בלבד על המרת גנים in vivo17. יתר על כן, בדיקות מבוססות PCR אלה אינן מצליחות לפתור באופן זמני את הרחבת לולאת D ואת היווצרות המוצר של BIR, מה שמרמז על כך שהאות נובע ממוצרי dsDNA ולא מתווך ssDNA17,18,19. בדיקת הרחבת D-loop (DLE) פותחה לאחרונה כדי לטפל בפערים אלה. בדיקת ה-DLE מכמתת סינתזת דנ"א הקשורה לרקומבינציה באתר של ~400 זוגות בסיסים (bp) במורד הזרם של הקצה הפולש הראשוני 3'9. בשיטה זו, הרחבת D-loop אינה תלויה ב-Pol32 וניתנת לזיהוי תוך 4 שעות לאחר אינדוקציה של DSB, בעוד שתוצרי BIR נצפים לראשונה ב-6 שעות. ואכן, פרסום שפורסם לאחרונה במעבדות הבר ומלקובה ציין כי שימוש בשיטה זו של הכנת דנ"א גנומי מביא לשימור ssDNA 9,20.

כאן, מבחני DLC ו- DLE מתוארים בפירוט. מבחנים אלה מסתמכים על קשירת קרבה כדי לזהות לולאות D מתהוות ומורחבות ב-S. cerevisiae (איור 2)8,9. ניתן לכמת מוצרי BIR באמצעות אותה מערכת בדיקה. עבור שני המבחנים, היווצרות DSB באתר חיתוך אנדונוקלאז HO הממוקם בלוקוס URA3 על כרומוזום (Chr.) V מושרית על ידי הביטוי של אנדונוקלאז HO תחת שליטתו של מקדם גלקטוז הניתן להשרה. פלישת גדילי דנ"א בתיווך Rad51 מובילה להיווצרות לולאת D מתהווה באתר של תורם חוץ רחמי הממוקם במוקד LYS2 ב- Chr. II. מכיוון שהצד הימני של ה- DSB חסר הומולוגיה לתורם, תיקון באמצעות SDSA ו- dHJ אינו אפשרי. תיקון ראשוני של DSB על ידי BIR אפשרי, אבל היווצרות של מוצרים קיימא מעוכב על ידי נוכחות של centromere21. תכנון מכוון זה מונע תיקון DSB פרודוקטיבי, ובכך מונע את חידוש הצמיחה על ידי תאים עם DBSs מתוקנים, אשר אחרת יכול לעקוף את התרבית במהלך ניתוח מהלך הזמן.

במבחן DLC, קישור צולב פסורלן של שני הגדילים של הדנ"א ההטרודופלקס בתוך לולאת D משמר את ביניים הרקומבינציה. לאחר שיקום אתר אנזים ההגבלה על הגדיל השבור (שנכרת) והעיכול, הקישור הצולב מאפשר קשירת הרצפים הייחודיים במעלה הזרם של הדנ"א ההומולוגי השבור והתורם. באמצעות qPCR, ניתן לכמת את רמת מולקולת הדנ"א הכימרית הקיימת בכל דגימה. במבחן DLE, אין צורך בקישור צולב, ושיקום ועיכול אתר אנזים ההגבלה ואחריו קשירה תוך-מולקולרית מקשרים במקום זאת את קצה 5' של המולקולה השבורה לקצה החדש של 3'. שוב, qPCR משמש לכימות הכמויות היחסיות של מוצר כימרי זה בכל דגימה. בהיעדר שחזור אתר אנזים הגבלה, בדיקת ה-DLE מדווחת על הרמות היחסיות של תוצר ה-BIR (dsDNA) שנוצר בעקבות הארכת לולאת D.

מוצגות תוצאות מייצגות עבור כל בדיקה המשתמשת בזן מסוג פראי, והקוראים מופנים לפיאצה et al.8 ולפיאצה ואחרים לשימוש במבחנים אלה לניתוח מוטציות רקומבינציה 8,9. מטרת תרומה זו היא לאפשר למעבדות אחרות לאמץ את מבחני DLC ו- DLE, ותמיכה בהם זמינה על פי בקשה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. טרום צמיחה, אינדוקציה DSB ואיסוף דגימות

הערה: תוספת של כל סוגי החיידקים עם 0.01% אדנין מומלצת לזני Ade.

  1. יש לפזר את זני ההפלואידים המתאימים (ראו טבלה 1) על דקסטרוז אדנין של פפטון שמרים (YPDA) (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז, 2% אגר, 0.001% אדנין) ולגדול במשך יומיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
  2. השתמש במושבה אחת כדי לחסן 5 מ"ל של YPDA בצינור תרבית זכוכית של 15 מ"ל. לגדל תרביות לרוויה ב-30°C עם רעידות או סיבוב לאוורור.
  3. בדיקת DLC: הכן את תמיסת מלאי הפסורלן 5x (טריוקסאלן 0.5 מ"ג/מ"ל באתנול עמיד בפני 200) בקולט אדים על ידי המסת פסורלן בצינור חרוטי של 50 מ"ל עטוף בנייר אלומיניום למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם טלטול או היפוך מתמשכים. אטמו את החלק העליון של הברגה עם סרט שקוף למניעת אידוי. אין להכין יותר מ-7 מ"ל של תמיסת מלאי פסורלן 5x לכל צינור חרוטי של 50 מ"ל כדי להבטיח פירוק תקין של הפסורלן.
  4. למחרת, השתמש ב-5 מ"ל של תרבית YPDA שגדלה במהלך הלילה כדי לחסן 50-100 מ"ל של YEP-לקטט (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% עם לקטט, 0.001% אדנין) בבקבוקון בגודל מתאים (שמרים ניצנים גדלים בצורה אופטימלית בבקבוקון שנפחו לפחות פי 5 מהתרבית)ל-OD 600 של ~0.03.
  5. הגדל את התרבית במשך ~ 16 שעות ב- 30 ° C עם רעידות ב- 220 סל"ד. לאחר ~ 16 שעות, למדוד את OD600 של התרבות וזה צריך להיות ~ 0.5-0.8. אין להשתמש בתרבויות הנמצאות מתחת לתרביות או מגודלות.
  6. עבור כל נקודת זמן, לאסוף את הנפח המתאים של תאים בצינור חרוטי ומניחים על קרח. בדרך כלל, מדובר ב-1 x 108 תאים (כ-7.5 מ"ל של תרבית ב-OD 600 1.0 עבור זן פראי הפלואידי) עבור בדיקת DLC ו-5 x 107 תאים (כ-2.5 מ"ל של תרבית ב-OD600 1.0) עבור בדיקת DLE.
  7. כדי להבטיח את הדיוק של ערכי OD 600, הכן דילולים של 1:5 עבור תרבויות עם OD600≥0.2 כדי לשמור על קריאת OD ברמה של 0.2 ומטה. עבור זנים מסוג בר, נקודות הזמן האופטימליות לניתוח DLC הן בין 2 שעות ל-6 שעות, ונקודות הזמן האופטימליות לניתוח DLE הן בין 4 שעות ל-8 שעות (ראו איור 3 ואיור 4).
  8. בדיקת DLC
    1. לפני כל נקודת זמן, הכינו מספיק תמיסת פסורלן 1x (0.1 מ"ג/מ"ל טריוקסאלן, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 20% אתנול) במכסה אדים עבור כל הדגימות בצינור חרוטי של 50 מ"ל עטוף בנייר כסף. עזוב ב- RT.
    2. צנטריפוגה את הדגימות ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש לתלות את הכדור ב-2.5 מ"ל של תמיסת פסורלן 1x במכסה אדים ולהעביר לצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ. לחלופין, השהה את הכדור ב- 2.5 מ"ל של תמיסת TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0) לקבלת שליטה ללא הצלבה.
    3. קשר בין הדוגמאות. לקבלת צליבה UV המתאימה לנורות בגלים ארוכים (365 ננומטר), מקם את צלחות הפטרי 1-2 ס"מ מתחת למקור אור ה- UV כאשר המכסה הוסר על גבי צלחת פלסטיק או פרספקס שעברה קירור מראש ב- −20° C. לקבלת קופסת אור UV, הניחו את צלחות הפטרי ישירות על גבי מקור האור האולטרה-סגול. חושפים את הדגימות למשך 10 דקות עם ניעור עדין.
      הערה: מומלץ לכוון את מקור האור UV על גבי שייקר מסלולי שנקבע על ~50 סל"ד.
    4. במכסה אדים, העבירו את הדגימה לצינור חדש של 15 מ"ל. שטפו את צלחת הפטרי עם תמיסת TE1 של 2.5 מ"ל והוסיפו אותה לצינור. צנטריפוגה של הדגימות ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך כראוי את supernatant, ולאחסן את הכדור ב −20° C. דגימות ניתן לאחסן עד 1 שבוע לפני המעבר לשלב הבא.
  9. בדיקת DLE
    1. צנטריפוגה את הדגימות ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שטפו את גלולת התא ב-2.5 מ"ל של תמיסת TE1 קרה לפני שתחזרו על הספין ותאחסנו את הכדורים בטמפרטורה של 20°C-. ניתן לאחסן דוגמאות עד שבוע לפני המעבר לשלב הבא.
  10. לאיסוף דגימות בשעה 0 שעות, אספו את הדגימות לפני תוספת של 20% גלקטוז. עבור נקודות זמן עוקבות, השרה היווצרות DSB על ידי הוספת 20% גלקטוז לתרביות לריכוז סופי של 2%. לאסוף את הדגימות הנותרות כפי שתואר לעיל, גלולה, ולהקפיא יחסית לזמן שלאחר אינדוקציה DSB (כלומר, הדגימה 4 שעות נאספת 4 שעות לאחר תוספת של 20% גלקטוז).

2. התפשטות תאים, תזה ושיקום אתר הגבלה

  1. הפשירו את הדגימות על הקרח. מחממים אמבטיה יבשה ל-30 מעלות צלזיוס.
  2. יש להשהות את הדגימות ב-1 מ"ל של חיץ ספרופלסט (0.4 M סורביטול, 0.4 M KCl, 40 mM חיץ נתרן פוספט pH 7.2, 0.5 mM MgCl2) ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  3. הוסף 3.5 μL של תמיסת זימוליאז (2% גלוקוז, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ"ג/מ"ל זימוליאז 100T; 17.5 מיקרוגרם / מ"ל זימוליאז ריכוז סופי). ערבבו בעדינות על ידי הקשה או היפוך. דוגרים ב-30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז מניחים על קרח. במהלך הדגירה של 15 דקות, להשיג חנקן נוזלי או קרח יבש.
  4. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 2,500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ומניחים את הדגימות על קרח. לשטוף את הדגימות 3x ב 1 מ"ל של חיץ spheroplasting. צנטריפוגה את הדגימות במשך 3 דקות ב 2,500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. יש להשהות את הדגימות ב-1 מ"ל של מאגר אנזימי הגבלה קר 1x (50 mM אשלגן אצטט, 20 mM טריס-אצטט, 10 mM מגנזיום אצטט, 100 מיקרוגרם/מ"ל BSA pH ~8.0 ב-RT) וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב-16,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס. מניחים את הדוגמאות על קרח. יש לחזור על הכביסה 1x.
  6. יש להשעות את הדגימות ב-1 מ"ל של מאגר אנזים הגבלה קר 1x. פצל את הדגימה (0.5 מ"ל כל אחד) לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימות במשך 3 דקות ב 16,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. יש להשעות שפופרת אחת מכל דגימה ב-180 μL של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 עם אוליגוס היברידיים (ראו טבלה 2) וצינור אחד ב-180 μL של מאגר אנזימי הגבלה פי 1.4 ללא הכלאה של אוליגוס. כל אוליגו היברידי עובר החייאה ב-1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) ומשמש בריכוז סופי של 7 ננומטר. ה-TE 1x מחליף את האוליגוס ההיברידיים במאגר אנזימי ההגבלה 1.4x ללא הכלאה של אוליגוס.
    הערה: יש לאחסן את האוליגוס ההיברידיים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס ב-aliquots קטנים בעת דילול העבודה. ריכוז האוליגוס ההיברידיים עשוי לדרוש אופטימיזציה; ראה דיון.
  8. הצמד מקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי או קרח יבש / אתנול ואחסן בטמפרטורה של −80 °C. דוגמאות ניתן לאחסן בשלב זה במשך מספר חודשים.

3. הגבלת עיכול אנזים וקשירת תוך מולקולרית

  1. הפשירו את הדגימות על הקרח. מחממים אמבטיה יבשה אחת ל-65 מעלות צלזיוס ואחרת ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. Pipet 36 μL של הדגימה לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל על קרח. החזר מיד את הדגימה הנותרת ל- −80 °C לאחסון.
  3. הוסף 4 μL של 1% SDS (ריכוז סופי של 0.1%) וערבב על ידי הקשה עדינה על צד הצינור. יש לדגור בטמפרטורה של 65°C למשך 15 דקות בהקשה עדינה כל 5 דקות. הניחו דגימות על קרח מיד לאחר הדגירה.
    הערה: טיפול SDS זה מקדם דנטורציה של חלבונים הקשורים לדנ"א, סולוביזציה של מעטפת הגרעין ונגישות לכרומטין לפני עיכול אנזים ההגבלה ושלבי הקשירה התוך-מולקולרית.
  4. מוסיפים 4.5 מיקרון של 10% טריטון X-100 (1% ריכוז סופי) ומערבבים בפיפט. יש להוסיף 20-50 U של אנזים הגבלה (EcoRI-HF או HindIII-HF) לכל דגימה ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת עם תסיסה עדינה כל 20-30 דקות. במהלך תקופה זו, לחמם מראש אמבטיה יבשה ל 55 מעלות צלזיוס ולהגדיר מראש אמבט מים ל 16 מעלות צלזיוס.
  5. הוסף 8.6 μL של 10% SDS (1.5% ריכוז סופי) לכל דגימה וערבב על ידי pipetting והקשה. דגירה ב-55°C למשך 10 דקות. מוסיפים 80 μL של 10% Triton X-100 (6% ריכוז סופי) לכל דגימה ומערבבים על ידי פיפט.
  6. הוסף 660 μL של מאגר קשירה 1x ללא ATP (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2.5 מיקרוגרם / מ"ל BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA ליגאז (8 U / דגימה) לכל דגימה וערבב על ידי היפוך עדין. דגירה ב-16°C למשך שעה וחצי עם היפוך כל 30 דקות. מניחים את הדגימות על קרח מיד לאחר הדגירה.

4. טיהור DNA

  1. מחממים אמבטיה יבשה אחת ל-65 מעלות צלזיוס ואחרת ל-37 מעלות צלזיוס. יש להוסיף 1 μL של 10 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K (מוכן ב-1x TE pH 8.0) לכל דגימה (ריכוז סופי של 12.5 מיקרוגרם/מ"ל). דוגרים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ומניחים את הדגימות על קרח מיד לאחר הדגירה עד שהן מתקררות.
  2. העבר את הדגימות לצינורות 2 מ"ל. עבודה על מכסה אדים, להוסיף נפח שווה (~ 800 μL) של פנול / כלורופורם / אלכוהול איזואמיל (P / C / IA; pH 8.0) לכל דגימה. מערבלים את הדגימות עבור ~30 שניות וצנטריפוגות את הדגימות במשך 5-10 דקות ב 16,000 x גרם במיקרוצנטריפוגה.
  3. הסר בזהירות 600 μL של השלב העליון של כל דגימה לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל. יש להשליך כראוי את השלב התחתון ואת צינורות 2 מ"ל.
  4. זרז את הדנ"א על ידי הוספת נפח של 1/10 של 3 M נתרן אצטט pH 5.2 (~ 60 μL) לכל דגימה, ואחריו נפח אחד של איזופרופנול (~ 660 μL). הפוך את הדגימות 5x-10x ודגירה ב- RT במשך 30 דקות.
  5. מניחים את הדגימות על קרח למשך 2 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות של הדגימות ב 16,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס במיקרוצנטריפוגה. החזירו את הדגימות לקרח, שפכו את הסופרנטנט ורוקנו את הצינור על מגבת נייר.
  6. לשטוף את גלולת DNA עם 200 μL של 70% אתנול. צנטריפוגה ב 16,500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, מניחים את הדגימות בחזרה על קרח, לשפוך את supernatant, ולהסיר את שאריות אלכוהול עם פיפה. יבש את הדגימות עם כובעי הצינורות פתוחים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות.
  7. השהה את כדורי הדנ"א ב-50 μL של 1x TE על ידי מערבולת. דגירה ב-RT למשך 30 דקות, מערבולת, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט יבש למשך 30 דקות. מערבבים את הדגימות שוב, ולאחר מכן מניחים אותם על קרח. ניתן לאחסן דגימות בשלב זה בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים, אך מומלץ להמשיך באופן מיידי לשלבי ההסרה (DLC בלבד) ו- qPCR.

5. היפוך קישורים צולבים של Psoralen (עבור בדיקת DLC בלבד)

  1. Pipet 9 μL של דנ"א מטוהר לתוך צינור PCR על קרח. הוסף 1 μL של 1 M KOH (ריכוז סופי של 0.1 M). דגירה של הדגימות ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתרמו-ציקלר.
  2. הוסף 19.73 μL של תמיסת נתרן אצטט (0.1 M נתרן אצטט, 9.6 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0). ניתן לאחסן דגימות בשלב זה ב- −20 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים, אך מומלץ להמשיך מיד לשלב qPCR.

6. PCR כמותי, בקרות וניתוח

  1. באמצעות 2 μL של דנ"א מטוהר, עם או בלי crosslinking, להגדיר תגובת qPCR 20 μL על פי הוראות היצרן. הגדר כל תגובה בשכפול. הן עבור מבחני DLC והן עבור מבחני DLE, ישנן חמש תגובות בקרה ותגובת כימות DLC/DLE אחת, או בסך הכל שש תגובות לכל דגימה, המופעלות בשכפול. טבלה משלימה S1 וטבלה משלימה S2 מספקות תבנית להגדרת תגובות וניתוחים אלה, והרצפים של פריימרים qPCR מפורטים בטבלה 3.
  2. יש למטב את תנאי הרכיבה של qPCR עבור כל ערכת qPCR.
    1. השתמש בתנאי DLC qPCR הבאים, בהתאם לערכות qPCR המשמשות: דנטורציה ראשונית (95 °C למשך 3 דקות); 50 סיבובים של הגברה (95 °C עבור 15 שניות, 61 °C עבור 25 שניות, 72 °C עבור 15 שניות עם רכישה אחת); ניתוח עקומת התכה (95 °C למשך 5 שניות, 65 °C למשך דקה אחת, 97 °C עם רכישה מתמשכת); וקירור (37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות).
    2. השתמש בתנאי qPCR הבאים עבור בדיקת DLE: דנטורציה ראשונית (95 °C למשך 5 דקות); 50 סבבי הגברה (95 ° C עבור 15 שניות, 60 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 15 שניות עם רכישה אחת); ניתוח עקומת התכה (95 °C למשך 5 שניות, 65 °C למשך דקה אחת, 97 °C עם רכישה מתמשכת); וקירור (37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות). שים לב שייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה עבור מכונות/ערכות qPCR שונות.
  3. בדיקת DLC
    1. פקדים: עיין ברשימת פריימרים qPCR בטבלה 3. מפה של אתרי קשירת הפריימר מוצגת באיור S1. עבור קבצי רצף משלימים עבור התכונות הגנומיות והאמפליקונים הרלוונטיים, בדוק את קבצי עורך הפלסמיד (ApE); קבצי רצף משלימים 1-5.
      1. דנ"א גנומי ב-ARG4: השתמש ב-olWDH1760/olWDH1761 כדי להגביר את ה-dsDNA הממוקם ב-ARG4. השתמש בתגובה זו כבקרת טעינה ונרמל את כל התגובות האחרות למעט תגובת האות DLC לפקד זה.
      2. יעילות קשירה תוך-מולקולרית ב-DAP2: השתמש במקטע 1,904 bp שנוצר על-ידי עיכול EcoRI עבור קשירה תוך-מולקולרית במקביל לקשירת DLC. הגברה על פני צומת קשירה זה מדווחת על יעילות הקשירה התוך-מולקולרית ומשמשת כבקרה שאליה מנורמל אות ה- DLC.
      3. אינדוקציה של DSB: השתמש ב-olWDH1766/olWDH1767 כדי להגביר אזור שמשתרע על פני ה-DSB המושרה.
      4. קישור צלב וכריתה של Psoralen: השתמש ב- olWDH2019/olWDH2020 כדי להגביר את אזור PhiX הייחודי במורד הזרם של אתר הזיהוי EcoRI. ללא היפוך קישורים צולבים, השתמש ביחס של ה- ssDNA (ללא קישור צולב) על פני ARG4 (crosslinked dsDNA) כדי לקבוע את יעילות ההצלבה. עם היפוך קישורים צולבים, כריתה תוביל לירידה הדרגתית מ-1 ל-0.5 מהאות ביחס ל-ARG4.
      5. אקור אני מזהה שחזור וחיתוך אתר: השתמש ב- olWDH1768/olWDH1764 כדי להגביר אזור המשתרע על פני אתר הזיהוי המשוחזר EcoRI במעלה הזרם של ה- DSB על הגדיל שנכרת. olWDH1769/olWDH1763 מגביר אזור המשתרע על פני אתר אנזים ההגבלה EcoRI ב-DAP2. בצע מחשוף EcoRI באתר זה כדי להשתמש בו כבקרת קשירה תוך-מולקולרית.
    2. אות DLC: השתמש ב-olWDH1764/olWDH1765 כדי להגביר את מולקולת הדנ"א הכימרית שנוצרת על-ידי קשירה תוך-מולקולרית של הגדיל שנכרת (פולש) ושל התורם.
    3. ניתוח: חישוב הממוצע וסטיית התקן של ערכי Cp עבור כל אחת מהתגובות הכפולות. השתמש בערכי ה- qPCR Cp של הדנ"א הגנומי ARG4 כהפניה לנרמול כל שאר qPCR הבקרה. נרמל את אות ה- DLC לבקרת הקשירה התוך-מולקולרית ב - DAP2. ראה איור 3 עבור ערכי אות DLC טיפוסיים ב- 2 שעות.
  4. בדיקת DLE
    1. פקדים: עיין ברשימת פריימרים qPCR בטבלה 3. מפה של אתרי קשירת הפריימר מוצגת באיור S1. עבור קבצי רצף משלימים עבור התכונות הגנומיות והאמפליקונים הרלוונטיים, בדוק את קבצי עורך פלסמיד (ApE) (קבצי רצף משלימים 1-5).
      1. דנ"א גנומי ב-ARG4: ראה סעיף 6.3.1.1.
      2. יעילות קשירה תוך-מולקולרית ב - YLR050C: השתמש בעיכול HindIII כדי ליצור מקטע של 765 bp שיעבור קשירה תוך-מולקולרית במקביל לקשירת DLE. הגברה על פני צומת קשירה זו מדווחת על יעילות הקשירה התוך-מולקולרית ומשמשת כבקרה שאליה מנורמל אות ה-DLE.
      3. אינדוקציה DSB: ראה סעיף 6.3.1.3.
      4. הינד שיקום וחיתוך אתר זיהוי III: השתמש ב- olWDH2010/olWDH2012 ו- olWDH2009/2011 כדי להגביר אזור המשתרע על אתרי אנזים ההגבלה HindIII על הגדיל השבור שבו הוא נכרת והורחב, בהתאמה.
    2. אות DLE: השתמש באות olWDH2009/olWDH2010 כדי להגביר את מולקולת הדנ"א הכימרית שנוצרת על-ידי קשירה תוך-מולקולרית של הקצה הנכרת של הגדיל הפולש במעלה הזרם של ה-DSB לקצה החדש שהורחב במורד הזרם של ה-DSB.
    3. ניתוח: חישוב הממוצע וסטיית התקן של ערכי Cp עבור כל אחת מהתגובות הכפולות. השתמש בערכי ה- qPCR Cp של הדנ"א הגנומי ARG4 כהפניה לנרמול כל שאר qPCR הבקרה. נרמל את אות ה-DLE לבקרת הקשירה התוך-מולקולרית ב-YLR050C. ערכי אות DLE אופייניים ב-6 שעות מדווחים באיור 4 ובפרסומים קודמים9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדיקת DLC
בדיקת DLC מזהה הן לולאות D מתהוות והן לולאות D מורחבות שנוצרו על-ידי פלישה של DSB ספציפי לאתר לתורם יחיד (איור 2). Psoralen crosslinking מקשר פיזית את הגדיל השבור ואת התורם באמצעות הדנ"א ההטרודופלקס בתוך לולאת D. שיקום אתר אנזים ההגבלה עם אוליגו ארוך והכלאה על גדיל ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

המבחנים המוצגים מאפשרים זיהוי של לולאות D מתהוות ומורחבות (בדיקת DLC), הרחבת לולאת D (בדיקת DLE) ויצירת מוצר BIR (בדיקת DLE ללא אוליגונוקלאוטידים היברידיים) באמצעות קשירת קרבה ו- qPCR. ChIP-qPCR של Rad51 לאתרים מרוחקים מה-DSB שימש בעבר כפרוקסי לחיפוש הומולוגיה בתיווך Rad51 ויצירת לולאת D. עם זאת, אות ChIP-qPCR זה אינו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

העבודה במעבדת הייר נתמכת על ידי מענקים GM58015 ו- GM137751 ל- W.-D.H. המחקר במעבדת פיאצה נתמך על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-StG 3D-loop, הסכם גדול 851006). D.R. נתמך על ידי T32CA108459 וקרן א.פ. ג'יאניני. אנו מודים ל-Shih-Hsun Hung (מעבדת הייר) על שיתוף תוצאות בדיקת DLC/DLE שלו ועל אימות השינויים במבחנים המפורטים בפרוטוקול זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottomSuggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shakerSuggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrupSigma-AldrichL1375For media preparation
AgarFisherBP1423500For media preparation
Bacto peptoneBD Difco211840For media preparation
Bacto yeast extractBD Difco212750For media preparation
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4For media preparation
TrioxsalenSigma-AldrichT6137For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, whiteRoche472969200196-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR kit used by the authors

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195(2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187DRad51

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved