JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Анализы захвата D-петли (DLC) и расширения D-петли (DLE) используют принцип бесконтактного лигирования вместе с количественной ПЦР для количественной оценки образования D-петли, расширения D-петли и образования продукта в месте индуцируемого двухцепочечного разрыва в Saccharomyces cerevisiae.

Аннотация

Повреждение ДНК, включая двухцепочечные разрывы ДНК и межцепочечные поперечные связи, возникающие во время фаз S и G2 клеточного цикла, могут быть восстановлены гомологичной рекомбинацией (HR). Кроме того, HR представляет собой важный механизм спасения репликационной вилки после остановки или коллапса. Регуляция многих обратимых и необратимых ступеней этого сложного пути способствует его верности. Физический анализ промежуточных рекомбинационных веществ, образующихся при ЧСС, позволяет охарактеризовать эти элементы управления различными нуклеопротеиновыми факторами и их интеракторами. Хотя существуют хорошо зарекомендовавшие себя методы анализа конкретных событий и промежуточных продуктов в пути рекомбинации, обнаружение образования и расширения D-петли, двух критических шагов в этом пути, до недавнего времени оказывалось сложной задачей. Здесь описаны эффективные методы обнаружения ключевых событий в пути HR, а именно формирование двухцепочечного разрыва ДНК, формирование D-петли, расширение D-петли и образование продуктов посредством индуцированной разрывом репликации (BIR) в Saccharomyces cerevisiae . Эти анализы обнаруживают соответствующие им промежуточные продукты рекомбинации и продукты с высокой чувствительностью и не зависят от клеточной жизнеспособности. Обнаружение D-контуров, расширения D-петли и продукта BIR основано на бесконтактном лигировании. Вместе эти анализы позволяют изучать кинетику ЧСС на уровне популяции, чтобы точно рассмотреть функции белков и регуляторов HR на значительных этапах пути.

Введение

Гомологичная рекомбинация (HR) является высокоточным механизмом репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB), межцепочечных поперечных связей и разрывов ssDNA, а также путем толерантности к повреждению ДНК. HR отличается от подверженных ошибкам путей восстановления / толерантности повреждения ДНК, таких как негомологичное конечное соединение (NHEJ) и синтез транслезии, тем, что он использует неповрежденную, гомологичную дуплексную ДНК в качестве донора для шаблона события восстановления. Кроме того, многие из ключевых промежуточных звеньев в пути HR являются обратимыми, что позволяет точно регулировать отдельные этапы пути. Во время фаз S, G2 и M клеточного цикла HR конкурирует с NHEJ за ремонт двухсторонних DSB1. Кроме того, HR имеет важное значение для репликации ДНК для восстановления повреждений ДНК, связанных с репликацией, включая пробелы ssDNA и односторонние DSB, а также в качестве механизма шунтирования поражения ДНК2.

Критическим промежуточным звеном в пути HR является петля смещения, или D-петля (рисунок 1). После концевой резекции центральная рекомбиназа в реакции, Rad51, загружается на вновь резецированную ssDNA разрушенной молекулы, образуя спиральную нить2. Затем Rad51 проводит гомологический поиск для идентификации подходящего гомологичного донора, обычно сестринской хроматиды в соматических клетках. D-петля образуется, когда нить Rad51-ssDNA вторгается в гомологичную дуплексную ДНК, что приводит к спариванию основания Уотсона-Крика сломанной нити с комплементарной нитью донора, вытесняя противоположную донорскую нить. Расширение 3'-го конца сломанной цепи ДНК-полимеразой заменяет основания, которые были потеряны во время события повреждения ДНК, и способствует разрешению расширенного промежуточного D-петли в продукт dsDNA посредством синтез-зависимого отжига цепи (SDSA), двойного соединения Холлидей (dHJ) или подпутей HR, индуцированной разрывом репликации (BIR).

Анализы, которые физически контролируют промежуточные продукты в пути HR, позволяют анализировать генетические требования для каждого этапа (т. Е. Анализ пути). Образование DSB, резекция конца, dHJ, пузырьки репликации BIR и продукты HR легко наблюдаются южным пятном 3,4,5,6,7. Тем не менее, Южное блоттинг не сообщает о зарождающихся и расширенных D-петлях, и, таким образом, альтернативный метод надежного измерения этих суставных молекул требует 4,8,9. Одной из широко используемых стратегий для анализа зарождающегося образования D-петли является хроматин-иммунопреципитация (ChIP) Rad51 в сочетании с количественной ПЦР (qPCR)10,11. Однако связь Rad51 с dsDNA, измеренная с помощью ChIP-qPCR, не зависит от гомологии последовательностей и фактора аксессуара Rad51 Rad5410,11. Напротив, заметный сигнал с использованием представленного здесь метода анализа D-петли, называемого анализом захвата D-петли (DLC), зависит от образования DSB, гомологии последовательности, Rad51 и вспомогательных белков Rad51 Rad52 и Rad548. Вывод о том, что образование D-петли Saccharomyces cerevisiae Rad51 зависит от Rad54 in vivo, согласуется с многочисленными экспериментами по восстановлению in vitro, указывающими на то, что Rad54 необходим для поиска гомологий и формирования D-петли почкованием дрожжей Rad51 8,12,13,14,15.

Современные подходы к измерению расширения D-контура, главным образом с помощью полуколичественной ПЦР, также проблематичны. Типичный анализ на основе ПЦР для обнаружения расширения D-петли усиливает уникальную последовательность, возникающую в результате рекомбинации между местом разрыва и эктопическим донором и последующего рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК через праймер выше по течению от области гомологии на сломанной цепи и другой праймер ниже по течению от области гомологии на донорской цепи. Используя этот метод, для обнаружения рекомбинационно-ассоциированного синтеза ДНК требуется несущественный фактор процессности Pol δ Pol3216. Этот вывод противоречит наблюдению, что делеция POL32 оказывает лишь умеренное влияние на конверсию генов in vivo17. Более того, эти анализы на основе ПЦР не могут временно разрешить расширение D-петли и образование продукта BIR, предполагая, что сигнал является результатом продуктов dsDNA, а не промежуточных продуктов ssDNA 17,18,19. Недавно для устранения этих расхождений был разработан анализ расширения D-loop (DLE). Анализ DLE количественно оценивает рекомбинационно-ассоциированный синтез ДНК на участке ~ 400 пар оснований (bp) ниже начального 3' вторгающегося конца9. С помощью этого метода удлинение D-петли не зависит от Pol32 и обнаруживается в течение 4 ч после индукции DSB, тогда как продукты BIR впервые наблюдаются через 6 ч. Действительно, в недавней публикации из лабораторий Габера и Малковой отмечалось, что использование этого метода получения геномной ДНК исключительно приводит к сохранению сдНК 9,20.

Здесь подробно описаны анализы DLC и DLE. Эти анализы основаны на бесконтактном лигировании для обнаружения зарождающихся и расширенных D-петель у S. cerevisiae (рисунок 2)8,9. Продукты BIR могут быть количественно определены с использованием этой же системы анализа. Для обоих анализов образование DSB в месте разреза эндонуклеазы HO, расположенном в локусе URA3 на хромосоме (Chr.) V, индуцируется экспрессией эндонуклеазы HO под контролем галактозно-индуцируемого промотора. Rad51-опосредованная инвазия цепей ДНК приводит к зарождающемуся образованию D-петли на месте эктопического донора, расположенного в локусе LYS2 на Chr. II. Поскольку правая сторона DSB не имеет гомологии для донора, восстановление с помощью SDSA и формирования dHJ невозможно. Первоначальное восстановление DSB методом BIR возможно, но образование жизнеспособных продуктов тормозится присутствием центромеры21. Эта преднамеренная конструкция предотвращает продуктивное восстановление DSB, тем самым избегая возобновления роста клетками с восстановленными DBS, которые в противном случае могли бы обогнать культуру во время анализа курса времени.

В анализе DLC псораленовое сшивание двух нитей гетеродуплексной ДНК в D-петле сохраняет промежуточный рекомбинационный продукт. После восстановления сайта рестрикционного фермента на разрушенной (резецированной) цепи и пищеварения сшивание позволяет переливировать уникальные последовательности выше по течению от гомологичных разрушенных и донорских ДНК. Используя qPCR, уровень химерной молекулы ДНК, присутствующей в каждом образце, количественно оценивается. В анализе DLE сшивание не требуется, и восстановление сайта фермента рестрикции и пищеварение с последующим внутримолекулярным лигированием вместо этого связывают 5'-образный конец разрушенной молекулы с недавно расширенным 3'-концом. Опять же, qPCR используется для количественной оценки относительных количеств этого химерного продукта в каждом образце. При отсутствии восстановления сайта рестрикционного фермента анализ DLE сообщает об относительных уровнях продукта BIR (dsDNA), который образуется после расширения D-петли.

Показаны репрезентативные результаты для каждого анализа с использованием штамма дикого типа, и читатели ссылаются на Piazza et al.8 и Piazza et al.9 для использования этих анализов для анализа рекомбинационных мутантов 8,9. Цель этого вклада состоит в том, чтобы позволить другим лабораториям принять анализы DLC и DLE, и поддержка для них предоставляется по запросу.

протокол

1. Предварительный рост, индукция DSB и сбор проб

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавки всех сред с 0,01% аденина рекомендуются для штаммов Ade-.

  1. Удалите соответствующие гаплоидные штаммы (см. Таблицу 1) на дрожжевом пептоне декстрозы аденина (YPDA) (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы, 2% агара, 0,001% аденина) и расти в течение 2 дней при 30 °C.
  2. Используйте одну колонию для инокуляции 5 мл YPDA в стеклянной культуральной трубке объемом 15 мл. Выращивать культуры до насыщения при 30 °C с встряхиванием или ротацией для аэрации.
  3. Анализ DLC: Подготовьте 5-кратный раствор псоралена (0,5 мг/мл триокссалена в 200-стойком этаноле) в вытяжном шкафу, растворив псорален в конической трубке объемом 50 мл, обернутой в алюминиевую фольгу на ночь при комнатной температуре с непрерывным встряхиванием или инверсией. Запечатайте винтовую крышку прозрачной пленкой для предотвращения испарения. Не готовьте более 7 мл 5-кратного раствора псоралена на коническую трубку объемом 50 мл для обеспечения надлежащего растворения псоралена.
  4. На следующий день используйте 5 мл выращенной за ночь культуры YPDA для прививки 50-100 мл YEP-лактата (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% мас./мас. лактата, 0,001% аденина) в колбе соответствующего размера (почкование дрожжей оптимально растет в колбе, которая составляет не менее 5x объема культуры) до OD600 ~ 0,03.
  5. Выращивайте культуру в течение ~16 ч при 30 °C с встряхиванием при 220 об/мин. Через ~16 ч измерьте OD600 культуры, и он должен быть ~0,5-0,8. Не используйте недоросли или заросшие культуры.
  6. Для каждой точки времени соберите соответствующий объем клеток в коническую трубку и поместите на лед. Как правило, это 1 х 108 клеток (приблизительно 7,5 мл культуры при OD600 1,0 для гаплоидного штамма дикого типа) для анализа DLC и 5 х 107 клеток (приблизительно 2,5 мл культуры при OD600 1,0) для анализа DLE.
  7. Для обеспечения точности значений OD600 подготовьте разбавления 1:5 для культур с OD600≥0,2, чтобы показания OD оставались на уровне 0,2 или ниже. Для штаммов дикого типа оптимальные временные точки для анализа DLC составляют от 2 ч до 6 ч, а оптимальные временные точки для анализа DLE - от 4 ч до 8 ч (см. Рисунок 3 и Рисунок 4).
  8. Анализ DLC
    1. Перед каждой временной точкой приготовьте достаточное количество 1x раствора псоралена (0,1 мг/мл триокссалена, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 50 мМ ЭДТА рН 8,0, 20% этанола) в вытяжной вытяжке для всех образцов в конической трубке объемом 50 мл, обернутой в фольгу. Оставьте на RT.
    2. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу в 2,5 мл 1x раствора псоралена в вытяжке и переложить на чашку Петри размером 60 мм x 15 мм. Альтернативно, повторно суспендировать гранулу в 2,5 мл раствора TE1 (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 50 мМ EDTA pH 8,0) для контроля без сшивания.
    3. Сшивайте образцы. Для Сшивки УФ-излучения с длинноволновыми (365 нм) лампами расположите чашки Петри на 1-2 см ниже источника ультрафиолетового света со снятой крышкой поверх пластиковой или плексигласовой пластины, которая была предварительно охлаждена при -20 °C. Для УФ-светового короба поместите чашки Петри непосредственно на источник ультрафиолетового света. Обжаривайте образцы в течение 10 мин с легким встряхиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется устанавливать источник ультрафиолетового света на орбитальный шейкер, установленный на ~50 об/мин.
    4. В вытяжном шкафу перенесите образец в новую пробирку объемом 15 мл. Промыть чашку Петри 2,5 мл раствора TE1 и добавить его в пробирку. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C, правильно утилизируйте супернатант и храните гранулы при -20 °C. Образцы можно хранить до 1 недели, прежде чем перейти к следующему этапу.
  9. Анализ DLE
    1. Центрифугируйте образцы при 2 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Промыть ячейку гранулы в 2,5 мл холодного раствора TE1 перед повторением отжима и хранением гранул при −20 °C. Образцы могут храниться до 1 недели, прежде чем перейти к следующему шагу.
  10. Для отбора проб через 0 ч соберите образцы до добавления 20% галактозы. Для последующих временных точек индуцируют образование DSB путем добавления 20% галактозы в культуры до конечной концентрации 2%. Собрать оставшиеся образцы, как описано выше, гранулировать и заморозить относительно времени после индукции DSB (т.е. 4-часовой образец собирают через 4 ч после добавления 20% галактозы).

2. Клеточная сферопластировка, лизис и восстановление места рестрикции

  1. Разморозьте образцы на льду. Разогрейте сухую ванну до 30 °C.
  2. Повторно суспендировать образцы в 1 мл сферопластирующего буфера (0,4 М сорбита, 0,4 М ККл, 40 мМ буфера фосфата натрия рН 7,2, 0,5 мМ MgCl2) и перенести в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  3. Добавьте 3,5 мкл раствора зимолиазы (2% глюкозы, 50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 5 мг/мл зимолиазы 100T; 17,5 мкг/мл конечной концентрации зимолиазы). Аккуратно перемешайте постукиванием или инверсией. Инкубировать при 30 °C в течение 15 мин, а затем поместить на лед. Во время 15-минутной инкубации получают жидкий азот или сухой лед.
  4. Центрифуга в течение 3 мин при 2 500 х г при 4 °C и поместите образцы на лед. Промывайте образцы 3 раза в 1 мл буфера сферопластирования. Центрифугируйте образцы в течение 3 мин при 2 500 х г при 4 °C.
  5. Повторно суспендировать образцы в 1 мл холодного 1x рестрикционного ферментного буфера (50 мМ ацетата калия, 20 мМ трисацетата, 10 мМ ацетата магния, 100 мкг/мл BSA pH ~8,0 при RT) и центрифуги в течение 3 мин при 16 000 х г при 4 °C. Поместите образцы на лед. Повторите стирку 1x.
  6. Повторное суспендирование образцов в 1 мл холодного 1x рестрикционного ферментного буфера. Разделите образец (по 0,5 мл каждая) на две микроцентрифужные трубки по 1,5 мл. Центрифугируйте образцы в течение 3 мин при 16 000 х г при 4 °C.
  7. Повторно суспендировать одну пробирку из каждого образца в 180 мкл 1,4-кратного буфера фермента рестрикции с гибридизирующими олиго (см. Таблицу 2) и одну трубку в 180 мкл 1,4-кратного буфера фермента рестрикции без гибридизации олиго. Каждое гибридизирующее олиго повторно суспендируют в 1x TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА рН 8,0) и используют в конечной концентрации 7 нМ. 1x TE заменяет гибридизирующиеся олиго в 1,4x рестрикционном ферментном буфере без гибридизации олиго.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридизирующие олиго должны храниться при температуре −20°С в небольших аликвотах при рабочем разбавлении. Концентрация гибридизирующих олиго может потребовать оптимизации; см. Обсуждение.
  8. Заморозьте образцы в жидком азоте или сухом льду/этаноле и храните при температуре −80 °C. Образцы могут храниться на этом этапе в течение нескольких месяцев.

3. Переваривание фермента рестрикции и внутримолекулярное лигирование

  1. Разморозьте образцы на льду. Разогрейте одну сухую ванну до 65 °C, а другую до 37 °C.
  2. Пипетка 36 мкл образца в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл на льду. Своевременно вернуть оставшийся образец на −80 °C на хранение.
  3. Добавьте 4 мкл 1% SDS (конечная концентрация 0,1%) и перемешайте, осторожно постукивая по боковой стороне трубки. Инкубировать при 65 °C в течение 15 мин с легким постукиванием каждые 5 мин. Поместите образцы на лед сразу после инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это лечение SDS способствует денатурации ДНК-ассоциированных белков, солюбилизации ядерной оболочки и доступности хроматина до переваривания фермента рестрикции и внутримолекулярной стадии лигирования.
  4. Добавьте 4,5 мкл 10% тритона X-100 (1% конечной концентрации) и перемешайте путем пипетки. Добавляют 20-50 ЕД фермента рестрикции (EcoRI-HF или HindIII-HF) к каждому образцу и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч с мягким перемешиванием каждые 20-30 мин. В течение этого времени разогрейте сухую ванну до 55 °C и установите водяную баню до 16 °C.
  5. Добавьте 8,6 мкл 10% SDS (1,5% конечной концентрации) к каждому образцу и перемешайте путем пипетки и нарезания резьбы. Инкубировать при 55 °C в течение 10 мин. Добавьте 80 мкл 10% тритона X-100 (6% конечной концентрации) к каждому образцу и перемешайте путем пипетки.
  6. Добавьте 660 мкл 1x лигационного буфера без АТФ (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 2,5 мкг/мл BSA) + 1 мМ АТФ рН 8,0 + T4 ДНК-лигазы (8 ЕД/образец) к каждому образцу и перемешайте путем мягкой инверсии. Инкубировать при 16 °C в течение 1,5 ч с инверсией каждые 30 мин. Поместите образцы на лед сразу после инкубации.

4. Очистка ДНК

  1. Разогрейте одну сухую ванну до 65 °C, а другую до 37 °C. Добавьте 1 мкл 10 мг/мл протеиназы K (приготовленной в 1x TE pH 8,0) к каждому образцу (конечная концентрация 12,5 мкг/мл). Инкубировать при 65 °C в течение 30 мин и помещать образцы на лед сразу после инкубации до тех пор, пока они не остынут.
  2. Перенесите образцы в пробирки по 2 мл. Работая в вытяжном шкафу, добавьте равный объем (~800 мкл) фенола/хлороформа/изоамилового спирта (P/C/IA; рН 8,0) к каждому образцу. Вращайте образцы в течение ~30 с и центрифугируйте образцы в течение 5-10 мин при 16 000 х г в микроцентрифуге.
  3. Осторожно удалите 600 мкл верхней фазы каждого образца в новую пробирку объемом 1,5 мл. Правильно утилизируйте нижнюю фазу и трубки по 2 мл.
  4. Осаждение ДНК путем добавления 1/10 объема 3 М ацетата натрия pH 5,2 (~ 60 мкл) к каждому образцу, а затем 1 объем изопропанола (~ 660 мкл). Инвертируйте образцы 5x-10x и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
  5. Поместите образцы на лед в течение 2 мин, а затем центрифугируйте образцы при 16 500 х г в течение 15 мин при 4 °C в микроцентрифуге. Верните образцы в лед, вылейте супернатант и слейте трубку на бумажное полотенце.
  6. Промыть гранулу ДНК 200 мкл 70% этанола. Центрифугу при 16 500 х г в течение 3 мин при 4 °C, поместите образцы обратно на лед, вылейте супернатант и удалите остаточный спирт пипеткой. Высушите образцы с открытыми крышками трубок при 37 °C в течение 15-20 мин.
  7. Повторное суспендирование гранул ДНК в 50 мкл 1x TE путем вихря. Инкубировать при RT в течение 30 мин, вихрь, а затем инкубировать при 37 °C в сухой ванне в течение 30 мин. Снова вихрьте образцы, а затем поместите их на лед. Образцы могут храниться на этом этапе при температуре −20 °C в течение нескольких месяцев, но желательно немедленно приступить к этапу декроссинга (только DLC) и qPCR.

5. Разворот перекрестных ссылок Psoralen (только для анализа DLC)

  1. Пипетка 9 мкл очищенной ДНК в ПЦР-трубку на льду. Добавьте 1 мкл 1 М КОН (конечная концентрация 0,1 М). Инкубируйте образцы при 90 °C в течение 30 мин в термоциклере.
  2. Добавьте 19,73 мкл раствора ацетата натрия (0,1 М ацетата натрия, 9,6 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1,0 мМ ЭДТА рН 8,0). Образцы могут храниться на этой стадии при −20 °C в течение нескольких месяцев, но желательно немедленно перейти к этапу qPCR.

6. Количественная ПЦР, контроль и анализ

  1. Используя 2 мкл очищенной ДНК, с сшиванием или без него, настраивают реакцию qPCR объемом 20 мкл в соответствии с инструкциями производителя. Настройте каждую реакцию в двух экземплярах. Для анализов DLC и DLE существует пять контрольных реакций и одна реакция количественной оценки DLC / DLE, или в общей сложности шесть реакций на образец, выполняемых в двух экземплярах. Дополнительная таблица S1 и дополнительная таблица S2 предоставляют шаблон для настройки этих реакций и анализа, а последовательности праймеров qPCR перечислены в таблице 3.
  2. Условия циклирования qPCR должны быть оптимизированы для каждого комплекта qPCR.
    1. Используйте следующие условия DLC qPCR, в зависимости от используемых комплектов qPCR: начальная денатурация (95 °C в течение 3 минут); 50 раундов усиления (95 °C за 15 с, 61 °C за 25 с, 72 °C за 15 с при однократном захвате); анализ кривой плавления (95 °C в течение 5 с, 65 °C в течение 1 мин, 97 °C с непрерывным сбором); и охлаждение (37 °C в течение 30 с).
    2. Используйте следующие условия qPCR для анализа DLE: начальная денатурация (95 °C в течение 5 мин); 50 раундов усиления (95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 15 с при однократном захвате); анализ кривой плавления (95 °C в течение 5 с, 65 °C в течение 1 мин, 97 °C с непрерывным сбором); и охлаждение (37 °C в течение 30 с). Обратите внимание, что может потребоваться оптимизация для различных машин/комплектов qPCR.
  3. Анализ DLC
    1. Элементы управления: см. список букварей qPCR в таблице 3. Карта сайтов связывания грунтовки показана на рисунке S1. Для получения дополнительных файлов последовательностей для соответствующих геномных признаков и ампликонов проверьте файлы редактора плазмид (ApE); Дополнительные файлы последовательностей 1-5.
      1. Геномная ДНК в ARG4: Используйте olWDH1760/olWDH1761 для амплификации dsDNA, расположенной в ARG4. Используйте эту реакцию в качестве регулятора нагрузки и нормализуйте все другие реакции, кроме реакции сигнала DLC на этот контроль.
      2. Эффективность внутримолекулярного лигирования при DAP2: Используйте фрагмент 1,904 bp, созданный сбраживанием EcoRI для внутримолекулярной перевязки параллельно с DLC-лигированием. Усиление через этот лигационный переход сообщает об эффективности внутримолекулярного лигирования и служит контролем, для которого нормализуется сигнал DLC.
      3. Индукция DSB: используйте olWDH1766/olWDH1767 для усиления области, охватывающей индуцированный DSB.
      4. Сшивание и резекция Psoralen: используйте olWDH2019/olWDH2020 для усиления уникальной области PhiX после сайта распознавания EcoRI. Без разворота сшивки используйте отношение ssDNA (без сшивания) к ARG4 (сшитая dsDNA) для определения эффективности сшивания. При развороте сшивки резекция приведет к прогрессирующему снижению от 1 до 0,5 сигнала относительно ARG4.
      5. ЭкоР Восстановление и резка сайта распознавания I: используйте olWDH1768/olWDH1764 для усиления области, которая охватывает восстановленный сайт распознавания EcoRI выше по течению ОТ DSB на резецированной нити. olWDH1769/olWDH1763 усиливают область, которая охватывает сайт фермента рестрикции EcoRI в DAP2. Выполните расщепление EcoRI на этом участке для использования в качестве внутримолекулярного контроля лигирования.
    2. Сигнал DLC: Используйте olWDH1764/olWDH1765 для амплификации химерной молекулы ДНК, созданной внутримолекулярным перевязкой резецированной (вторгающейся) нити и донора.
    3. Анализ: Рассчитайте среднее и стандартное отклонение значений Cp для каждой из повторяющихся реакций. Используйте значения геномной ДНК ARG4 qPCR Cp в качестве ссылки для нормализации всех других контрольных qPCR. Нормализуйте сигнал DLC для внутримолекулярного контроля лигирования при DAP2. На рисунке 3 показаны типичные значения сигналов DLC через 2 ч.
  4. Анализ DLE
    1. Элементы управления: см. список букварей qPCR в таблице 3. Карта сайтов связывания грунтовки показана на рисунке S1. Для получения дополнительных файлов последовательностей для соответствующих геномных признаков и ампликонов проверьте файлы редактора плазмид (ApE) (Дополнительные файлы последовательностей 1-5).
      1. Геномная ДНК в ARG4: см. раздел 6.3.1.1.
      2. Эффективность внутримолекулярного лигирования при YLR050C: Используйте сбраживание HindIII для создания фрагмента 765 bp, который будет подвергаться внутримолекулярной перевязке параллельно с лигированием DLE. Амплификация через этот лигационный переход сообщает об эффективности внутримолекулярного лигирования и служит контролем, для которого нормализуется сигнал DLE.
      3. Вводный инструктаж ОРС: см. раздел 6.3.1.3.
      4. Задний Восстановление и резка сайта распознавания III: Используйте olWDH2010/olWDH2012 и olWDH2009/2011 для усиления области, которая охватывает участки фермента рестрикции HindIII на сломанной цепи, где она была резецирована и расширена, соответственно.
    2. Сигнал DLE: Используйте olWDH2009/olWDH2010 для амплификации химерной молекулы ДНК, созданной внутримолекулярным перевязкой резецированного конца вторгающейся нити вверх по течению от DSB до недавно расширенного конца вниз по течению DSB.
    3. Анализ: Рассчитайте среднее и стандартное отклонение значений Cp для каждой из повторяющихся реакций. Используйте значения геномной ДНК ARG4 qPCR Cp в качестве ссылки для нормализации всех других контрольных qPCR. Нормализуйте сигнал DLE для внутримолекулярного контроля лигирования при YLR050C. Типичные значения сигнала DLE через 6 ч указаны на рисунке 4 и в предыдущих публикациях9.

Результаты

Анализ DLC
Анализ DLC обнаруживает как зарождающиеся, так и расширенные D-петли, образованные вторжением специфического для сайта DSB в одного донора (рисунок 2). Сшивка псоралена физически связывает разорванную цепь и донора через гетеродуплексную ДНК в D-пет...

Обсуждение

Представленные анализы позволяют обнаруживать зарождающиеся и расширенные D-петли (DLC-анализ), расширение D-петли (анализ DLE) и образование продукта BIR (анализ DLE без гибридизации олигонуклеотидов) с использованием бесконтактного лигирования и qPCR. ChIP-qPCR Rad51 для сайтов, удаленных от DSB, ране?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа в лаборатории Хейера поддерживается грантами GM58015 и GM137751 W.-D.H. Исследования в лаборатории Piazza поддерживаются Европейским исследовательским советом (ERC-StG 3D-loop, большое соглашение 851006). D.R. поддерживается T32CA108459 и Фондом А.. Джаннини. Мы благодарим Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) за то, что он поделился результатами анализа DLC / DLE и за дополнительную проверку изменений в анализах, которые подробно описаны в этом протоколе.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottomSuggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shakerSuggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrupSigma-AldrichL1375For media preparation
AgarFisherBP1423500For media preparation
Bacto peptoneBD Difco211840For media preparation
Bacto yeast extractBD Difco212750For media preparation
D-(+)-glucoseBD Difco0155-17-4For media preparation
TrioxsalenSigma-AldrichT6137For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100TUS BiologicalZ1004For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HFNew England BiolabsR3101Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HFNew England BiolabsR3104Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1Sigma-AldrichP2069DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480Roche5015278001qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, whiteRoche472969200196-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super MixBioRad1725271qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master MixRoche4707516001qPCR kit used by the authors

Ссылки

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187DRad51

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены