Saccharomyces cerevisiae'de Proximity Ligation ve Kantitatif PCR ile Homolog Rekombinasyon Ara Ürünlerinin Saptanması

Özet

D-döngü yakalama (DLC) ve D-döngü uzatma (DLE) testleri, Saccharomyces cerevisiae'de indüklenebilir çift sarmallı bir kırılma yerinde D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve ürün oluşumunu ölçmek için kantitatif PCR ile birlikte yakınlık ligasyonu prensibini kullanır.

Özet

Hücre döngüsünün S ve G2 fazları sırasında ortaya çıkan DNA çift sarmallı kırılmalar ve iplikler arası çapraz bağlantılar da dahil olmak üzere DNA hasarı, homolog rekombinasyon (HR) ile onarılabilir. Ek olarak, İK, durma veya çökme sonrasında önemli bir çoğaltma çatalı kurtarma mekanizmasını temsil eder. Bu karmaşık yolun birçok geri dönüşümlü ve geri dönüşümsüz adımının düzenlenmesi, sadakatini arttırır. İK sırasında oluşan rekombinasyon ara ürünlerinin fiziksel analizi, bu kontrollerin çeşitli nükleoprotein faktörleri ve interaktörleri tarafından karakterize edilmesini sağlar. Rekombinasyon yolundaki spesifik olayları ve ara ürünleri analiz etmek için iyi kurulmuş yöntemler olmasına rağmen, bu yoldaki iki kritik adım olan D-döngü oluşumunun ve genişlemesinin tespiti yakın zamana kadar zor olmuştur. Burada, HR yolundaki anahtar olayları, yani DNA çift sarmallı kopma oluşumunu, D-döngü oluşumunu, D-döngü uzantısını ve Saccharomyces cerevisiae'de kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) yoluyla ürünlerin oluşumunu tespit etmek için etkili yöntemler açıklanmaktadır. Bu analizler, ilgili rekombinasyon ara ürünlerini ve yüksek hassasiyetli ürünleri tespit eder ve hücresel canlılıktan bağımsızdır. D-döngülerinin, D-döngü uzantısının ve BIR ürününün algılanması, yakınlık ligasyonuna dayanır. Birlikte, bu analizler, İK proteinlerinin ve düzenleyicilerinin işlevlerini yoldaki önemli adımlarda ince bir şekilde ele almak için popülasyon düzeyinde İK'nın kinetiğinin incelenmesine izin verir.

Giriş

Homolog rekombinasyon (HR), DNA çift sarmallı kırılmaların (DSB'ler), iplikler arası çapraz bağlantıların ve ssDNA boşluklarının onarımının yüksek doğrulukta bir mekanizmasının yanı sıra DNA hasar toleransı için bir yoldur. HR, homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ve translezyon sentezi gibi DNA hasarı onarımı / toleransı için hataya eğilimli yollardan farklıdır, çünkü onarım olayını şablonlamak için donör olarak sağlam, homolog bir dupleks DNA kullanır. Dahası, İK yolundaki anahtar ara ürünlerin çoğu geri dönüşümlüdür ve bireysel yol adımlarının mükemmel bir şekilde düzenlenmesine izin verir. Hücre döngüsünün S, G2 ve M fazları sırasında İK, iki uçlu DSB'lerin^onarımı için NHEJ ile rekabet eder 1. Ek olarak, HR, ssDNA boşlukları ve tek taraflı DSB'ler de dahil olmak üzere replikasyonla ilişkili DNA hasarının onarımı için ve DNA lezyonu bypass^2'nin bir mekanizması olarak DNA replikasyonu için gereklidir.

HR yolundaki kritik bir ara madde, yer değiştirme döngüsü veya D-döngüsüdür (Şekil 1). Son rezeksiyonu takiben, reaksiyondaki merkezi rekombinaz, Rad51, kırık molekülün yeni rezeke edilmiş ssDNA'sına yüklenir ve sarmal bir filament² oluşturur. Rad51 daha sonra uygun bir homolog donörü, tipik olarak somatik hücrelerdeki kardeş kromatidini tanımlamak için bir homoloji araştırması yapar. D-döngüsü, Rad51-ssDNA filamenti homolog bir dubleks DNA'yı istila ettiğinde oluşur, bu da kırık ipliğin Watson-Crick baz eşleşmesine donörün tamamlayıcı ipliği ile eşleştirilmesine yol açar ve karşı donör ipliğinin yerini alır. Kırık ipliğin 3' ucunun bir DNA polimeraz ile uzatılması, DNA hasarı olayı sırasında kaybedilen bazların yerini alır ve genişletilmiş D-döngü ara ürününün senteze bağımlı iplik tavlama (SDSA), çift Holliday kavşağı (dHJ) veya kırılmaya bağlı replikasyon (BIR) HR alt yolları yoluyla bir dsDNA ürününe çözünürlüğünü teşvik eder.

İK yolundaki ara ürünleri fiziksel olarak izleyen testler, her adım için genetik gereksinimlerin analizine izin verir (yani, yol analizi). DSB oluşumu, uç rezeksiyon, dHJ'ler, BIR replikasyon kabarcıkları ve HR ürünleri, Güney lekelenmesi ^3,4,5,6,7 ile kolayca gözlenir. Bununla birlikte, Güney lekelenmesi yeni ortaya çıkan ve genişlemiş D-döngüleri hakkında rapor vermekte başarısız olmaktadır ve bu nedenle, bu eklem moleküllerini güvenilir bir şekilde ölçmek için alternatif bir yöntem gereklidir ^4,8,9. Gelişmekte olan D-döngü oluşumunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir strateji, Rad51'in kromatin-immünopresipitasyonu (ChIP) ve kantitatif PCR (qPCR) ^10,11'dir. Bununla birlikte, ChIP-qPCR ile ölçülen dsDNA ile Rad51 ilişkisi, dizi homolojisinden ve Rad51 aksesuar faktörü Rad54^{10,11'den bağımsızdır.} Buna karşılık, burada sunulan D-döngü analizi yöntemini kullanan ve D-döngü yakalama (DLC) testi olarak adlandırılan kayda değer bir sinyal, DSB oluşumuna, dizi homolojisine, Rad51'e ve Rad51 aksesuar proteinleri Rad52 ve Rad54^8'e bağlıdır. Saccharomyces cerevisiae Rad51-terfi eden D-döngü oluşumunun Rad54'e in vivo olarak bağlı olduğu bulgusu, Rad54'ün tomurcuklanan maya Rad51^{8,12,13,14,15} ile homoloji araştırması ve D-döngü oluşumu için gerekli olduğunu gösteren çok sayıda in vitro sulandırma deneyi ile ^uyumludur.

D-döngü uzantısını ölçmeye yönelik mevcut yaklaşımlar, öncelikle yarı kantitatif PCR yoluyla, benzer şekilde sorunludur. D-döngü uzantısını tespit etmek için tipik bir PCR tabanlı tahlil, bir kırılma bölgesi ile ektopik bir donör arasındaki rekombinasyondan ve müteakip rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinden kaynaklanan, kırık iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin bir primer yukarı akışı ve donör iplikçik üzerindeki homoloji bölgesinin aşağı yönünde başka bir primer yoluyla benzersiz bir diziyi güçlendirir. Bu yöntemi kullanarak, rekombinasyonla ilişkili DNA sentezinin tespiti, gerekli olmayan Pol δ işlemsellik faktörü Pol32^16'yı gerektirir. Bu bulgu, POL32 delesyonunun in vivo¹⁷ gen transformasyonu üzerinde sadece hafif bir etkiye sahip olduğu gözlemiyle çelişmektedir. Dahası, bu PCR tabanlı analizler D-döngü uzantısını ve BIR ürün oluşumunu geçici olarak çözmekte başarısız olur, bu da sinyalin ssDNA yerine dsDNA ürünlerinden kaynaklandığını düşündürmektedir^17,18,19. D-döngü uzantısı (DLE) testi yakın zamanda bu tutarsızlıkları gidermek için geliştirilmiştir. DLE testi, ilk 3' istilacı uç^9'un aşağı yönünde ~ 400 baz çifti (bp) bir bölgede rekombinasyonla ilişkili DNA sentezini ölçer. Bu yöntemle, D-döngü uzantısı Pol32'den bağımsızdır ve DSB indüksiyonundan sonraki 4 saat içinde tespit edilebilirken, BIR ürünleri ilk olarak 6 saatte gözlenir. Nitekim, Haber ve Malkova laboratuvarlarından yeni bir yayın, genomik DNA'nın bu hazırlama yönteminin kullanılmasının tekil olarak ssDNA'nın korunmasıyla sonuçlandığını belirtmiştir ^9,20.

Burada, DLC ve DLE testleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu analizler, S. cerevisiae'de yeni ortaya çıkan ve uzatılmış D-döngülerini tespit etmek için yakınlık ligasyonuna dayanır (Şekil 2)^8,9. BIR ürünleri aynı tahlil sistemi kullanılarak ölçülebilir. Her iki tahlil için, kromozom (Chr.) V üzerindeki URA3 lokusunda bulunan bir HO endonükleaz kesim bölgesinde DSB oluşumu, galaktoz ile indüklenebilir bir promotörün kontrolü altında HO endonükleazın ekspresyonu ile indüklenir. Rad51 aracılı DNA iplikçik invazyonu, Chr. II'deki LYS2 lokusunda bulunan ektopik bir donörün yerinde yeni ortaya çıkan D-döngü oluşumuna yol açar. DSB'nin sağ tarafında donöre homoloji bulunmadığından, SDSA ve dHJ oluşumu yoluyla onarım mümkün değildir. DSB'nin BIR ile ilk onarımı mümkündür, ancak canlı ürünlerin oluşumu sentromer^21'in varlığı ile engellenir. Bu kasıtlı tasarım, üretken DSB onarımını önler, böylece onarılmış DBS'lere sahip hücreler tarafından büyümenin yeniden başlamasını önler, aksi takdirde zaman seyri analizi sırasında kültürü geçebilir.

DLC tahlilinde, D-döngüsü içindeki heterodupleks DNA'nın iki ipliğinin psoralen çapraz bağlanması, rekombinasyon ara maddesini korur. Kırık (rezeke edilmiş) iplikçik ve sindirim üzerinde kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunu takiben, çapraz bağlama, homolog kırık ve donör DNA'ların yukarı yönündeki benzersiz dizilerin bağlanmasına izin verir. qPCR kullanılarak, her numunede bulunan kimerik DNA molekülünün seviyesi ölçülür. DLE testinde, çapraz bağlama gerekli değildir ve kısıtlama enzim bölgesi restorasyonu ve sindirimi ve ardından intramoleküler ligasyon bunun yerine kırık molekülün 5' ucunu yeni genişletilmiş 3' ucuna bağlar. Yine, qPCR, her numunedeki bu kimerik ürünün nispi miktarlarını ölçmek için kullanılır. Kısıtlama enzim bölgesi restorasyonunun yokluğunda, DLE testi, D-döngü uzantısını takiben oluşan BIR (dsDNA) ürününün göreceli seviyelerini rapor eder.

Vahşi tip bir suş kullanan her tahlil için temsili sonuçlar gösterilir ve okuyucular, rekombinasyon mutantlarının ^{analizi için} bu testlerin ^{kullanımı için Piazza} ve ark.8 ve Piazza ve ark.9'a yönlendirilir ^8,9. Bu katkının amacı, diğer laboratuvarların DLC ve DLE tahlillerini benimsemelerini sağlamaktır ve talep üzerine bunlara destek sağlanmaktadır.

Protokol

1. Büyüme öncesi, DSB indüksiyonu ve numune toplama

NOT: Ade suşları için tüm ortamların %0,01 adenin ile desteklenmesi önerilir.

1. Maya pepton dekstroz adenin (YPDA) (% 1 maya ekstresi,% 2 pepon,% 2 glikoz,% 2 agar,% 0.001 adenin) üzerindeki uygun haploid suşları (bakınız Tablo 1) çizin ve 30 ° C'de 2 gün boyunca büyüyün.
2. 15 mL'lik bir cam kültür tüpünde 5 mL YPDA'yı aşılamak için tek bir koloni kullanın. Havalandırma için sallama veya dönme ile kültürleri 30 ° C'de doygunluğa kadar büyütün.
3. DLC testi: 5x psoralen stok çözeltisini (200 geçirmez etanolde 0,5 mg/mL trioksalen) bir duman davlumbazında, psoralen'i oda sıcaklığında gece boyunca sürekli çalkalama veya ters çevirme ile alüminyum folyoya sarılmış 50 mL'lik bir konik tüp içinde çözerek hazırlayın. Buharlaşmayı önlemek için vidalı üst kısmı şeffaf bir filmle kapatın. Psoralen uygun çözünmesini sağlamak için 50 mL konik tüp başına 7 mL'den fazla 5x psoralen stok çözeltisi hazırlamayın.
4. Ertesi gün, uygun büyüklükte bir şişede (tomurcuklanan maya, kültürün hacminin en az 5 katı olan bir şişede en uygun şekilde büyür) 50-100 mL YEP-laktat (% 1 maya ekstresi,% 2 pepton,% 2 w laktat,% 0.001 adenin) aşılamak için gece kültüründe yetiştirilen YPDA'nın 5 mL'sini kullanın. ~ 0.03'lük bir OD_600'e .
5. Kültürü 30 ° C'de ~ 16 saat boyunca 220 rpm'de sallayarak büyütün. ~ 16 saatten sonra, kültürün OD_600'ünü ölçün ve ~ 0.5-0.8 olmalıdır. Az veya aşırı büyümüş kültürleri kullanmayın.
6. Her zaman noktası için, uygun hücre hacmini konik bir tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Tipik olarak, bu, DLC testi için 1 x 10⁸ hücre (bir haploid vahşi tip suş için OD 600 1.0'da yaklaşık^7.5 mL kültür) ve DLE testi için 5 x 10 7 hücredir (OD₆₀₀ 1.0'da yaklaşık 2.5 mL kültür).
7. OD₆₀₀ değerlerinin doğruluğunu sağlamak için, OD okumasını 0,2 veya altında tutmak üzere OD₆₀₀≥0,2 olan kültürler için 1:5 seyreltmeler hazırlayın. Vahşi tip suşlar için, DLC analizi için en uygun zaman noktaları 2 saat ile 6 saat arasındadır ve DLE analizi için en uygun zaman noktaları 4 saat ile 8 saat arasındadır (bkz. Şekil 3 ve Şekil 4).
8. DLC testi
   1. Her zaman noktasından önce, folyoya sarılı 50 mL'lik konik bir tüp içindeki tüm numuneler için bir duman davlumbazında yeterli miktarda 1x psoralen çözeltisi (0.1 mg / mL trioksalen, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0,% 20 etanol) hazırlayın. RT'de bırakın.
   2. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Peleti bir duman davlumbazında 2,5 mL 1x psoralen çözeltisinde yeniden askıya alın ve 60 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına aktarın. Alternatif olarak, çapraz bağlamasız bir kontrol için peleti 2,5 mL TE1 çözeltisinde (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) yeniden askıya alın.
   3. Örnekleri çapraz bağlayın. Uzun dalga (365 nm) ampullerle uyumlu bir UV çapraz bağlayıcı için, Petri kaplarını UV ışık kaynağının 1-2 cm altına yerleştirin ve kapak -20 ° C'de önceden soğutulmuş plastik veya pleksiglas bir plakanın üzerine çıkarılmış olarak yerleştirin. Bir UV ışık kutusu için, Petri kaplarını doğrudan UV ışık kaynağının üzerine yerleştirin. Numuneleri hafifçe sallayarak 10 dakika boyunca maruz bırakın.
      NOT: UV ışık kaynağının ~ 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel çalkalayıcının üzerine ayarlanması önerilir.
   4. Bir duman davlumbazında, numuneyi yeni bir 15 mL tüpe aktarın. Petri kabını 2,5 mL TE1 çözeltisi ile durulayın ve bunu tüpe ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj edin, süpernatanı uygun şekilde atın ve peleti -20 ° C'de saklayın.
9. DLE testi
   1. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj yapın. Spini tekrarlamadan ve peletleri -20 ° C'de saklamadan önce hücre peletini 2,5 mL soğuk TE1 çözeltisinde yıkayın. Numuneler bir sonraki adıma geçmeden önce 1 haftaya kadar saklanabilir.
10. 0 saatte numune toplamak için,% 20 galaktoz ilavesinden önce örnekleri toplayın. Sonraki zaman noktaları için, kültürlere% 20 galaktoz ekleyerek% 2'lik bir nihai konsantrasyona DSB oluşumunu indükleyin. Kalan örnekleri yukarıda açıklandığı gibi toplayın, pelet ve DSB indüksiyonu sonrası zamana göre dondurun (yani, 4 saatlik örnek,% 20 galaktoz ilavesinden 4 saat sonra toplanır).

2. Hücre sferoplastı, lizis ve restriksiyon bölgesi restorasyonu

1. Örnekleri buz üzerinde çözün. Kuru bir banyoyu önceden 30 ° C'ye ısıtın.
2. Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM sodyum fosfat tamponu pH 7,2, 0,5 mM MgCl₂) yeniden askıya alın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. 3.5 μL zymolyase çözeltisi ekleyin (% 2 glikoz, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mg / mL zymolyase 100T; 17.5 μg / mL zymolyase nihai konsantrasyonu). Dokunarak veya ters çevirerek hafifçe karıştırın. 15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin ve ardından buzun üzerine yerleştirin. 15 dakikalık inkübasyon sırasında sıvı azot veya kuru buz elde edin.
4. 4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika santrifüj yapın ve numuneleri buz üzerine yerleştirin. Numuneleri 1 mL sferoplast tamponda 3 kat yıkayın. Numuneleri 4 °C'de 2.500 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
5. Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat, RT'de 100 μg/mL BSA pH ~8.0) yeniden askıya alın ve 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Yıkamayı 1x tekrarlayın.
6. Numuneleri 1 mL soğuk 1x kısıtlama enzim tamponunda yeniden askıya alın. Numuneyi (her biri 0,5 mL) iki adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne bölün. Numuneleri 4 °C'de 16.000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
7. Her numuneden bir tüpü hibridize oligolarla 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda (bakınız Tablo 2) ve oligoları hibridize etmeden 180 μL 1.4x kısıtlama enzim tamponunda bir tüpü yeniden askıya alın. Her hibridize edici oligo, 1x TE'de (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) yeniden askıya alınır ve 7 nM'lik bir son konsantrasyonda kullanılır. 1x TE, oligoları hibridize etmeden 1.4x kısıtlama enzim tamponundaki hibridize oligoların yerini alır.
   NOT: Hibridize oligolar, çalışma seyreltmesinde küçük alikotlarda -20 ° C'de saklanmalıdır. Hibridize oligoların konsantrasyonu optimizasyon gerektirebilir; bkz: Tartışma.
8. Numuneleri sıvı azot veya kuru buz/etanol içinde çıtçıtla dondurun ve -80 °C'de saklayın. Örnekler bu aşamada birkaç ay saklanabilir.

3. Restriksiyon enzim sindirimi ve intramoleküler ligasyon

1. Örnekleri buz üzerinde çözün. Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın.
2. Pipet 36 μL numuneyi buz üzerinde yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dönüştürür. Kalan numuneyi depolama için derhal -80 ° C'ye iade edin.
3. 4 μL% 1 SDS (% 0.1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve tüpün kenarına hafifçe dokunarak karıştırın. Her 5 dakikada bir hafifçe dokunarak 15 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin. Kuluçkadan hemen sonra buz üzerine numuneler yerleştirin.
   NOT: Bu SDS tedavisi, DNA ile ilişkili proteinlerin denatürasyonunu, nükleer zarfın çözünmesini ve kısıtlama enzimi sindirimi ve molekül içi ligasyon adımlarından önce kromatin erişilebilirliğini teşvik eder.
4. 4,5 μL %10 Triton X-100 (%1 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Her numuneye 20-50 U kısıtlama enzimi (EcoRI-HF veya HindIII-HF) ekleyin ve her 20-30 dakikada bir nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu süre zarfında, kuru bir banyoyu 55 ° C'ye önceden ısıtın ve bir su banyosunu 16 ° C'ye önceden ayarlayın.
5. Her numuneye 8,6 μL %10 SDS (%1,5 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ve kılavuzlama yoluyla karıştırın. 10 dakika boyunca 55 °C'de inkübe edin. Her numuneye 80 μL %10 Triton X-100 (%6 nihai konsantrasyon) ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
6. Her numuneye ATP'siz 660 μL 1x ligasyon tamponu (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,_2.5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA ligaz (8 U/numune) ekleyin ve nazik ters çevirerek karıştırın. Her 30 dakikada bir ters çevirme ile 1,5 saat boyunca 16 °C'de inkübe edin. Örnekleri inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.

4. DNA saflaştırma

1. Bir kuru banyoyu önceden 65 ° C'ye, diğerini 37 ° C'ye ısıtın. Her numuneye 1 μL 10 mg/mL proteinaz K (1x TE pH 8.0'da hazırlanmış) ekleyin (12.5 μg/mL nihai konsantrasyon). 65 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve numuneleri soğuyana kadar inkübasyondan hemen sonra buz üzerine yerleştirin.
2. Numuneleri 2 mL tüplere aktarın. Bir davlumbazda çalışırken, her numuneye eşit miktarda (~800 μL) fenol/kloroform/izoamil alkol (P/C/IA; pH 8.0) ekleyin. Numuneleri ~ 30 s vortekste edin ve numuneleri bir mikrosantrifüjde 16.000 x g'de 5-10 dakika boyunca santrifüj yapın.
3. Her numunenin üst fazının 600 μL'sini yeni bir 1,5 mL'lik tüpe dikkatlice çıkarın. Alt fazı ve 2 mL tüpleri uygun şekilde atın.
4. Her numuneye 1/10 hacim 3 M sodyum asetat pH 5.2 (~60 μL) ekleyerek DNA'yı çökeltin, ardından 1 hacim izopropanol (~ 660 μL). Numuneleri 5x-10x ters çevirin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
5. Numuneleri 2 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin ve ardından numuneleri bir mikrosantrifüjde 4 ° C'de 15 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın. Numuneleri buza geri döndürün, süpernatanı dökün ve tüpü bir kağıt havluya boşaltın.
6. DNA peletini 200 μL% 70 etanol ile yıkayın. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 16.500 x g'de santrifüj yapın, numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin, süpernatanı dökün ve kalan alkolü bir pipetle çıkarın. Numuneleri, tüplerin kapakları 37 °C'de 15-20 dakika açık olacak şekilde kurulayın.
7. DNA peletlerini vorteks yaparak 50 μL 1x TE'de yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, girdap yapın ve daha sonra 30 dakika boyunca kuru bir banyoda 37 ° C'de inkübe edin. Örnekleri tekrar vorteksleyin ve sonra buzun üzerine yerleştirin. Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak çapraz bağlama (yalnızca DLC) ve qPCR adımları için hemen devam etmeniz önerilir.

5. Psoralen çapraz bağlantı tersine çevirme (yalnızca DLC testi için)

1. Pipet 9 μL saflaştırılmış DNA, buz üzerindeki bir PCR tüpüne dönüşür. 1 μL 1 M KOH (0,1 M nihai konsantrasyon) ekleyin. Numuneleri bir termosiklusta 30 dakika boyunca 90 ° C'de inkübe edin.
2. 19.73 μL sodyum asetat çözeltisi ekleyin (0.1 M sodyum asetat, 9.6 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0). Numuneler bu aşamada birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir, ancak hemen qPCR adımına geçmeniz önerilir.

6. Kantitatif PCR, kontroller ve analiz

1. Çapraz bağlantılı veya çapraz bağlanmasız 2 μL saflaştırılmış DNA kullanarak, üreticinin talimatlarına göre 20 μL qPCR reaksiyonu ayarlayın. Her reaksiyonu çift olarak ayarlayın. Hem DLC hem de DLE tahlilleri için, beş kontrol reaksiyonu ve bir DLC / DLE niceleme reaksiyonu veya numune başına toplam altı reaksiyon çift olarak çalıştırılır. Ek Tablo S1 ve Ek Tablo S2 , bu reaksiyonları ve analizleri ayarlamak için bir şablon sağlar ve qPCR primerlerinin dizileri Tablo 3'te listelenmiştir.
2. qPCR bisiklet koşullarının her qPCR kiti için optimize edilmesi gerekir.
   1. Kullanılan qPCR kitlerine bağlı olarak aşağıdaki DLC qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (3 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 25 s için 61 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C).
   2. DLE testi için aşağıdaki qPCR koşullarını kullanın: ilk denatürasyon (5 dakika boyunca 95 °C); 50 tur amplifikasyon (15 s için 95 °C, 30 s için 60 °C, tek bir kazanımla 15 s için 72 °C); erime eğrisi analizi (5 s için 95 °C, 1 dakika için 65 °C, sürekli kazanım ile 97 °C); ve soğutma (30 s için 37 ° C). Farklı qPCR makineleri/kitleri için optimizasyonun gerekli olabileceğini unutmayın.
3. DLC testi
   1. Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını kontrol edin; Ek Sıra Dosyaları 1-5.
      1. ARG4'te Genomik DNA: ARG4'te bulunan dsDNA'yı yükseltmek için olWDH1760 / olWDH1761 kullanın. Bu reaksiyonu bir yükleme kontrolü olarak kullanın ve bu kontrole DLC sinyal reaksiyonu dışındaki diğer tüm reaksiyonları normalleştirin.
      2. DAP2'de intramoleküler ligasyon verimliliği: DLC ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyon için EcoRI sindirimi tarafından oluşturulan 1.904 bp fragmanını kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLC sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.
      3. DSB indüksiyonu: İndüklenen DSB'yi kapsayan bir bölgeyi yükseltmek için olWDH1766/olWDH1767 kullanın.
      4. Psoralen çapraz bağlama ve rezeksiyon: EcoRI tanıma alanının aşağısındaki benzersiz PhiX bölgesini yükseltmek için olWDH2019/olWDH2020 kullanın. Çapraz bağlantı tersine çevirme olmadan, çapraz bağlama verimliliğini belirlemek için ARG4 (çapraz bağlı dsDNA) üzerindeki ssDNA (çapraz bağlanma yok) oranını kullanın. Çapraz bağlantının tersine çevrilmesi ile rezeksiyon, ARG4'e göre sinyalin 1'inden 0.5'ine aşamalı bir düşüşe yol açacaktır.
      5. EkoR I tanıma alanı restorasyonu ve kesme: Rezeke edilen iplikçik üzerinde DSB'nin yukarı yönünde restore edilmiş EcoRI tanıma bölgesini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH1768/olWDH1764 kullanın. olWDH1769/olWDH1763, DAP2'deki EcoRI kısıtlama enzim bölgesini kapsayan bir bölgeyi güçlendirir. İntramoleküler ligasyon kontrolü olarak kullanmak için bu bölgede EcoRI bölünmesi yapın.
   2. DLC sinyali: Rezeke edilmiş (istilacı) ipliğin ve donörün intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH1764 / olWDH1765 kullanın.
   3. Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DAP2'deki molekül içi ligasyon kontrolüne DLC sinyalini normalleştirin. 2 saatte tipik DLC sinyal değerleri için Şekil 3'e bakınız.
4. DLE testi
   1. Denetimler: Tablo 3'teki qPCR primerlerinin listesine bakın. Astar bağlanma bölgelerinin bir haritası Şekil S1'de gösterilmiştir. İlgili genomik özellikler ve amplikonlar için ek dizi dosyaları için, A plazmid Düzenleyicisi (ApE) dosyalarını (Ek Dizi Dosyaları 1-5) kontrol edin.
      1. ARG4'te genomik DNA: Bölüm 6.3.1.1'e bakınız.
      2. YLR050C'de molekül içi ligasyon verimliliği: DLE ligasyonuna paralel olarak intramoleküler ligasyona tabi tutulacak 765 bp'lik bir fragman oluşturmak için HindIII sindirimini kullanın. Bu ligasyon kavşağı boyunca amplifikasyon, molekül içi ligasyon verimliliğini bildirir ve DLE sinyalinin normalleştirildiği bir kontrol görevi görür.
      3. DSB indüksiyonu: Bkz. bölüm 6.3.1.3.
      4. Arjantin III tanıma bölgesi restorasyonu ve kesimi: Sırasıyla rezeke edildiği ve uzatıldığı kırık iplikçik üzerindeki HindIII kısıtlama enzim bölgelerini kapsayan bir bölgeyi büyütmek için olWDH2010/olWDH2012 ve olWDH2009/2011 kullanın.
   2. DLE sinyali: DSB'nin istilacı iplikçik yukarı akışının rezeke edilmiş ucunun DSB'nin yeni genişletilmiş uç aşağı akışına intramoleküler ligasyonu ile oluşturulan kimerik DNA molekülünü yükseltmek için olWDH2009 / olWDH2010 kullanın.
   3. Analiz: Yinelenen reaksiyonların her biri için Cp değerlerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın. Diğer tüm kontrol qPCR'lerini normalleştirmek için ARG4 genomik DNA qPCR Cp değerlerini referans olarak kullanın. DLE sinyalini YLR050C'deki molekül içi ligasyon kontrolüne normalleştirin. 6 saatteki tipik DLE sinyal değerleri Şekil 4 ve önceki yayınlar^9'da bildirilmiştir.

Sonuçlar

DLC testi
DLC testi, bölgeye özgü bir DSB'nin tek bir donöre invazyonuyla oluşan hem yeni ortaya çıkan hem de genişletilmiş D-döngülerini tespit eder (Şekil 2). Psoralen çapraz bağlanması, kırık ipliği ve donörü D-döngüsü içindeki heterodubleks DNA aracılığıyla fiziksel olarak bağlar. Kırılmanın rezeke edilmiş ipliği üzerinde uzun, hibridize edici bir oligo ile restriksiyon enzim bölgesi restorasyonu, restriksiyon enzim bölün...

Tartışmalar

Sunulan testler, yakınlık ligasyonu ve qPCR kullanılarak yeni ortaya çıkan ve genişletilmiş D-döngülerinin (DLC testi), D-döngü uzantısının (DLE testi) ve BIR ürün oluşumunun (hibridize edici oligonükleotid içermeyen DLE testi) tespit edilmesine izin verir. Rad51'in DSB'den uzak bölgelere ChIP-qPCR'si daha önce Rad51 aracılı homoloji araması ve D-döngü oluşumu için bir proxy olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu ChIP-qPCR sinyali, kırılma bölgesi ile potansiyel bir donör arasınd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors