JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة لتحويل الخلايا التائية البشرية مع لوسيفيراز لتسهيل التتبع في الجسم الحي لتهريب الخلايا التائية التي تسببها الأجسام المضادة ثنائية النوع إلى الأورام في الدراسات لتقييم الفعالية المضادة للورم وآلية الأجسام المضادة ثنائية النوع التي تشارك الخلايا التائية.

Abstract

الأجسام المضادة ثنائية النوع التي تشارك الخلايا التائية (T-BsAbs) في مراحل مختلفة من التطور قبل السريري والاختبارات السريرية للأورام الصلبة. تؤثر عوامل مثل التكافؤ والترتيب المكاني والمسافة بين المجالات وطفرات Fc على الفعالية المضادة للورم لهذه العلاجات ، عادة من خلال التأثير على توجيه الخلايا التائية إلى الأورام ، والتي لا تزال تمثل تحديا كبيرا. هنا ، نصف طريقة لتحويل الخلايا التائية البشرية المنشطة مع لوسيفيراز ، مما يسمح في الجسم الحي بتتبع الخلايا التائية أثناء دراسات العلاج T-BsAb. يمكن تقييم قدرة T-BsAbs على إعادة توجيه الخلايا التائية إلى الأورام كميا في نقاط زمنية متعددة أثناء العلاج ، مما يسمح للباحثين بربط الفعالية المضادة للورم ل T-BsAbs والتدخلات الأخرى مع استمرار الخلايا التائية في الأورام. تخفف هذه الطريقة من الحاجة إلى التضحية بالحيوانات أثناء العلاج لتقييم تسلل الخلايا التائية نسيجيا ويمكن تكرارها في نقاط زمنية متعددة لتحديد حركية الاتجار بالخلايا التائية أثناء العلاج وبعده.

Introduction

الأجسام المضادة ثنائية النوع التي تشارك الخلايا التائية (T-BsAbs) هي أجسام مضادة مصممة هندسيا تستخدم لتوفير خصوصية اصطناعية للخلايا التائية متعددة النسيلة عن طريق إشراك الخلايا التائية من خلال ذراع ربط واحد ومستضد الورم من خلال ذراع ربط آخر. تم تطبيق هذه التقنية بنجاح على سرطانات الدم (CD19-targeting blinatumomab1) ، والعديد من T-BsAbs في التطوير قبل السريري والسريري لمجموعة متنوعة من الأورام الصلبة أيضا2. تقوم T-BsAbs بإشراك الخلايا التائية متعددة النسيلة بطريقة مستقلة عن معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) ، وبالتالي حتى الأورام التي تقلل من تنظيم مستضدات الكريات البيض البشرية (HLAs) عرضة لهذا النوع من العلاج 3,4. تم تطوير T-BsAbs في عشرات الأشكال المختلفة ، مع وجود اختلافات في التكافؤ والترتيب المكاني للخلية التائية وأذرع ربط الورم ، والمسافات بين المجالات ، وإدراج مجال Fc ، مما يؤثر على عمر النصف ويمكن أن يحفز وظائف المستجيب إذا كان موجودا5. أظهر العمل السابق في مختبرنا أن هذه العوامل تؤثر بشكل كبير على فعالية T-BsAbs المضادة للورم ، مع اختلافات تصل إلى 1000 ضعف في الفاعلية6. من خلال هذا العمل ، حددنا تنسيق IgG-[L]-scFv كمنصة مثالية ل T-BsAbs (انظر قسم النتائج التمثيلية لمزيد من التفاصيل حول تنسيقات T-BsAb) ، وطبقنا هذه المنصة على أهداف بما في ذلك GD2 (الورم الأرومي العصبي) ، HER2 (سرطان الثدي وساركوما العظم) ، GPA33 (سرطان القولون والمستقيم) ، STEAP1 (ساركوما إيوينغ) ، CD19 (أورام الخلايا البائية الخبيثة) ، و CD33 (أورام الخلايا البائية الخبيثة)7 ، 8،9،10،11،12،13.

أحد التحديات الرئيسية لتنفيذ علاج T-BsAb بنجاح في الأورام الصلبة هو التغلب على البيئة المكروية للورم المثبطة للمناعة (TME) لدفع تهريب الخلايا التائية إلى الأورام14. العوامل التي تؤثر على فعالية T-BsAb الموصوفة أعلاه لها تأثير كبير على قدرة T-BsAbs على تحفيز الخلايا التائية بشكل فعال على الأورام ، ولكن من الصعب تقييم هذا التأثير في نظام في الجسم الحي في الوقت الفعلي. تقدم هذه المخطوطة وصفا مفصلا لاستخدام الخلايا التائية المتحولة إلى لوسيفيراز في الدراسات قبل السريرية ل T-BsAbs لتقييم الاتجار بالخلايا التائية إلى الأنسجة المختلفة في نماذج الفئران التجريبية التي تعاني من نقص المناعة أثناء العلاج. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير وسيلة لتقييم تسلل الخلايا التائية في الأورام والأنسجة الأخرى ، بالإضافة إلى نظرة ثاقبة في الوقت الفعلي لحركية الخلايا التائية الموجهة واستمرارها ، دون الحاجة إلى التضحية بالحيوانات أثناء العلاج. بالنسبة للعدد المتزايد من الباحثين الذين يركزون على العلاجات المناعية الخلوية ، فإن القدرة على تتبع الخلايا التائية في الجسم الحي في النماذج الحيوانية قبل السريرية أمر بالغ الأهمية. نهدف إلى تقديم وصف شامل ومفصل للطريقة التي استخدمناها لتتبع الخلايا التائية المستحثة بالسيفيراز لتمكين الباحثين الآخرين من تكرار هذه التقنية بسهولة.

Protocol

تم تقييم الإجراءات التالية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في Memorial Sloan Kettering.

1. نقل الخلايا التائية 293 مع لوسيفيراز وحصاد المواد الطافية الفيروسية

  1. ثقافة الخلايا التائية 293
    1. تحضير الوسائط عن طريق إضافة ما يلي إلى لتر من DMEM لكل منهما: 110 مل من مصل الجنين البقري المعطل بالحرارة (FBS) ، 11 مل من البنسلين والستربتومايسين.
    2. قم بإذابة الخلايا التائية 5 × 106 293T وانقلها إلى قارورة T175 مع الوسائط المعدة كما هو موضح أعلاه.
    3. قم بتقسيم خلايا 293T 1:10 كل 3 أيام لمدة 6 أيام. لا تسمح للخلايا أن تصبح أكثر من 90٪ متقاربة.
  2. نقل الخلايا التائية 293
    ملاحظة: يتم حساب الكميات التالية من الكواشف لنقل قارورة T175 واحدة من الخلايا التائية 293. اضبط وفقا لذلك إذا كان سيتم تحويل المزيد من القوارير.
    1. انقل 1.5 مل من الوسائط إلى كل من أنبوبي سعة 50 مل باستخدام ماصة. إلى أنبوب واحد ، أضف 10 ميكروغرام من بلازميد VSV-G ، و 20 ميكروغرام من Gag / pol ، و 20 ميكروغرام من طماطم خنفساء النقر الحمراء TD (CBR-TDR) لوسيفيراز بلازميد واخلطها. إلى الأنبوب الآخر ، أضف 100 ميكرولتر من الحمض النووي في كاشف نقل المختبر واخلطه. احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: تم توفير جميع البلازميدات الموصوفة في هذه المخطوطة من قبل الدكتور فلاديمير بونوماريف.
    2. انقل الوسائط التي تحتوي على كاشف نقل الحمض النووي في المختبر بالتنقيط إلى الأنبوب الذي يحتوي على بلازميدات الحمض النووي (أكثر من 30 ثانية تقريبا) واخلطها برفق مع ماصة. احتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
    3. خلال هذه الحضانة التي تستغرق 20 دقيقة ، افصل الخلايا التائية 293 بإضافة 5-10 مل من 0.05٪ تربسين. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف 10 مل من الوسائط وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا في 1.5 مل من الوسائط.
    4. أضف الوسائط التي تحتوي على كاشف نقل الحمض النووي في المختبر وبلازميدات الحمض النووي إلى الخلايا 293T واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. انقله إلى قارورة T175 وأضف 18 مل من الوسائط. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط بعناية باستخدام ماصة زجاجية دون فصل الخلايا. استبدل ب 18 مل من الوسائط الطازجة. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة.
  3. حصاد طاف فيروسي
    1. قم بإزالة المادة الطافية الفيروسية باستخدام ماصة وضعت على الثلج. أجهزة الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 5 دقائق لتكوير الخلايا والحطام.
      ملاحظة: إذا كانت حبيبات الخلية كبيرة ، فمن المحتمل أن تكون الخلايا قد تعطلت من القارورة عند إزالة المادة الطافية. يمكن طلاء هذه الخلايا مرة أخرى في قارورة جديدة مع وسائط جديدة.
    2. قم بتصفية المادة الطافية الفيروسية باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    3. استخدم المادة الطافية الفيروسية على الفور. احتفظ بها على الثلج أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة ، أو قم بتجميدها عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

2. توسيع ونقل الخلايا التائية البشرية المنشطة مع لوسيفيراز

  1. تنشيط الخلايا التائية البشرية في المختبر
    1. اغسل الخرزات بإضافة 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 2 mM من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) إلى أنبوب معقم سعة 15 مل ، وإضافة حبات (حبة واحدة لكل خليتين T) ، ووضعها في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين ، وشفط PBS.
    2. قم بإعداد الوسائط كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 ، ثم أضف IL-2 إلى تركيز نهائي قدره 30 وحدة دولية / مل وأضف الخرزات المغسولة. اصنع 2.5 مل من الوسائط لكل مليوني خلية تائية يتم تنشيطها.
    3. عد الخلايا التائية (التي تم تنقيتها حديثا أو تنقيتها مسبقا وتجميدها وإذابتها وغسلها) باستخدام مقياس الدم وبقعة التريبان الزرقاء. أضف الخلايا التائية إلى الوسائط المعدة في الخطوة 2.1.2 واقلب الأنبوب برفق للخلط. سوف تتوسع الخلايا التائية 20x على الأقل اعتمادا على المصدر والصحة العامة للخلايا. حدد عدد الخلايا التائية المراد تنشيطها عن طريق حساب العدد اللازم لعلاج الفئران والقسمة على 20. هنا ، تم استخدام 20 × 106 خلية تائية لكل فأر بناء على التجارب الأولية.
    4. لوحة 2.5 مل من الوسائط التي تحتوي على مليوني خلية تائية وخرز و IL-2 في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. استزرع عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 مرطبة بنسبة 5٪.
    5. افحص الخلايا التائية تحت مجهر 20x كل يوم لمدة 3 أيام قادمة لتحديد وقت التحويل باستخدام لوسيفيراز. تكون الخلايا جاهزة عندما تتجمع معا وتستنفد الوسائط ، وتحولها من الأحمر / الوردي إلى البرتقالي الفاتح.
  2. إعداد لوحات ريترونيكتين
    ملاحظة: يستخدم Retronectin لتغليف الألواح المستخدمة في النقل لأنه يعزز نقل الجينات15.
    1. أضف 2 مل من 20 ميكروغرام / مل من الارتكارونيكتين في برنامج تلفزيوني إلى بئر من صفيحة 6 آبار غير معالجة. احتضان لمدة 2 ساعة في RT أو 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. مطلوب بئر واحد مطلي بالارتونيكتين لكل مليوني خلية تائية يتم تحويلها.
    2. نضح الريترونيكتين دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
    3. أضف 3 مل من 2٪ BSA في PBS (مصفاة معقمة) لكل بئر في لوحة 6 آبار. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. سبينوكولاتيونال
    1. نضح BSA دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
    2. اغسل الآبار مرة واحدة باستخدام 3 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر. استمر أو استبدله ب PBS جديد واترك الطبق مغطى عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    3. أضف 2 مل من المادة الطافية الفيروسية CBR-TDR luciferase (التي تم جمعها في الخطوة 1.3) لكل بئر.
    4. جهاز طرد مركزي عند 1240 × جم لمدة 90 دقيقة عند 32 درجة مئوية.
  4. النقل
    1. عد الخلايا التائية.
    2. نضح طاف الفيروسية دون خدش الجزء السفلي من اللوحة.
    3. صفيحة مليوني خلية تائية لكل بئر في 6 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco يحتوي على 30 وحدة دولية / مل IL-2 للإنسان.
    4. افحص الخلايا التائية يوميا. الخلايا التائية جاهزة للتوسع عندما تكون متقاربة تقريبا ، عادة بعد 2 أيام.
    5. عندما تكون الخلايا متقاربة تقريبا ، اغسلها برفق من قاع اللوحة باستخدام ماصة وانقل كل بئر إلى قارورة T75 منفصلة. أضف 9 مل من الوسائط ليصبح المجموع 15 مل من الوسائط لكل دورق.
    6. في اليوم التالي ، أضف 15 مل إضافية من الوسائط. يجب أن تكون الخلايا جاهزة للحقن في الفئران في اليوم التالي لإضافة هذه الوسائط. تأكد من نجاح النقل عن طريق إجراء قياس التدفق الخلوي (يحتوي بناء لوسيفيراز على فلوروفور طماطم TD مرئي في قناة PE)16.

3. تطعيم الخلايا التائية المستحثة باللوسيفيراز في الفئران التي تعاني من نقص المناعة

  1. تحضير الخلايا التائية وعدها للحقن.
    1. أزل الخلايا التائية من القوارير وعد من القوارير. تكون الخلايا جاهزة للحقن عندما تتوسع 20x-30x ، عادة بحلول اليوم 7 بعد التنشيط.
    2. أجهزة الطرد المركزي للخلايا التائية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. أعد التعليق في 2 مل من الوسائط وقم بإزالة الخرزات باستخدام رف مغناطيسي.
    3. بالنسبة للتجارب التي سيتم فيها حقن الخلايا التائية بشكل منفصل عن الأجسام المضادة ثنائية النوع، عد الخلايا التائية وأعد تعليقها بحيث يكون التركيز النهائي 20 مليون خلية تائية لكل 100 ميكرولتر من الوسائط. انتقل إلى الخطوة 3.2. للتجارب التي تستخدم الخلايا التائية المسلحة خارج الجسم الحي (EATs) ، انتقل إلى الخطوة 3.1.4.
    4. بالنسبة للتجارب التي تستخدم الخلايا التائية المسلحة خارج الجسم الحي ، عد الخلايا التائية وافصلها إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مل لكل مجموعة ، مع 20 مليون خلية لكل فأر. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك ثلاث مجموعات من خمسة فئران لكل منها ، فقم بإعداد ثلاثة أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي كل منها على 100 مليون خلية تائية.
    5. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 1.5 مل في 800 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الوسائط بعناية دون إزعاج حبيبات الخلايا التائية. إعادة التعليق في ما لا يزيد عن 50 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على الأجسام المضادة ثنائية النوع. احتضان في RT لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لأغراض التجارب التي أجريت في هذه الدراسة ، تم استخدام الأجسام المضادة ثنائية النوع الخاصة بالخلايا IgG-[L]-scFv T التي تم إنشاؤها في المختبر. لتسليح الخلايا التائية ، استخدم 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل 20 × 106 خلايا تائية. يمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة ثنائية النوع المتاحة تجاريا.
    6. اغسل الأجسام المضادة الزائدة عن طريق إضافة 1450 ميكرولتر من الوسائط إلى كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق ، واستنشاق الوسائط بعناية ، وإعادة التعليق بتركيز 20 مليون خلية تائية مسلحة لكل وسائط 100 ميكرولتر.
  2. الحقن والنقش في الفئران
    1. تخدير الفئران في غرفة توفر 3.5٪ (v / v) من الإيزوفلوران المستنشق في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. يتم تخدير الفئران بالكامل عندما يختفي منعكس سحب دواسة الطرف الخلفي.
      ملاحظة: توفير الدعم الحراري طوال العملية.
    2. باستخدام إبرة 26 G ، قم بحقن 20 مليون خلية T في 100 ميكرولتر من الوسائط بأثر رجعي لكل فأر.
    3. إدارة 1000 U IL-2 المؤتلف تحت الجلد لدعم بقاء الخلايا التائية في الجسم الحي.
    4. إدارة الأجسام المضادة ثنائية النوع بأثر رجعي (في العين لا تستخدم لحقن الخلايا التائية) أو داخل الصفاق. السماح للفئران بالتعافي من التخدير والعودة إلى أقفاصها.
      ملاحظة: مرة أخرى ، هنا ، تم استخدام الأجسام المضادة المسجلة الملكية التي تم إنشاؤها في المختبر ، ولكن يمكن استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا بدلا من ذلك. في التجارب هنا ، تم إعطاء 0.3-10 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل فأر لكل جرعة. تم إعطاء الأجسام المضادة مرتين في الأسبوع لمدة 3-4 أسابيع.

4. التصوير في الجسم الحي للفئران المطعمة بالخلايا التائية المستحثة بالسيفيراز

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة في يوم التصوير ، وهو ليس بالضرورة نفس اليوم الذي يتم فيه إعطاء الخلايا التائية و / أو الأجسام المضادة للفئران. عادة ، نقوم بإجراء التصوير بعد 24 ساعة من إعطاء الخلايا التائية المتحولة إلى لوسيفيراز.

  1. إعداد د-لوسيفيرين
    1. قم بإذابة 1 جم من د-لوسيفيرين في 33.3 مل من برنامج تلفزيوني معقم (التركيز النهائي: 30 ملغ/مل).
    2. قم بقسمة D-luciferin المذابة في أنابيب طرد مركزي دقيقة 33 × 1.5 مل وحافظ على الأنابيب عند -20 درجة مئوية.
    3. في يوم التصوير ، قم بإذابة ما يكفي من القسومة من 30 مجم / مل D-luciferin لعدد الحيوانات المراد تصويرها. أنبوب واحد يكفي ل 10.
      ملاحظة: أعد تجميد د-لوسيفيرين المتبقي بعد الاستخدام. D-luciferin مستقر لمدة خمس دورات تجميد / ذوبان على الأقل.
  2. إعطاء د-لوسيفيرين للفئران
    ملاحظة: قبل إعطاء D-luciferin للفئران ، افتح برنامج التصوير وقم بتهيئة النظام. قد تستغرق الكاميرا عدة دقائق لتبرد ، ويجب القيام بذلك قبل حقن الفئران ب D-luciferin لضمان إمكانية إجراء التصوير بعد 5 دقائق من إعطاء الركيزة.
    1. تخدير ما يصل إلى خمسة فئران في غرفة توفر 3.5٪ (v / v) إيزوفلوران مستنشق في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين. يتم تخدير الفئران بالكامل عندما يختفي منعكس سحب دواسة الطرف الخلفي.
    2. بمجرد تخدير الفئران بالكامل ، يتم تطبيق 100 ميكرولتر من 30 مجم / مل D-luciferin لكل فأر (3 مجم لكل فأر) عن طريق الحقن خلف الحجاج بإبرة 26 جرام. تخيل هذه المجموعة من الفئران قبل إعطاء D-luciferin للمجموعة التالية. ضع المجموعة التالية من الفئران في غرفة الأيزوفلوران ليتم تخديرها أثناء تصوير المجموعة السابقة.
  3. تصوير الخلايا التائية المستحثة بإنزيم لوسيفيراز
    1. انقل الفئران المخدرة إلى الحجرة الضيقة للتصوير واستمر في إعطاء 3٪ إيزوفلوران عند 0.5 لتر / دقيقة. ضع الفئران على جوانبها بحيث يكون الجناح الذي يحمل الطعم الأجنبي متجها لأعلى نحو الكاميرا. التقط مجموعة أخرى من الصور مع الفئران في وضع ضعيف لتقييم وجود الخلايا التائية في الرئتين.
    2. باستخدام لوحة التحكم في الاكتساب، حدد اللومينسنت والصور الفوتوغرافية والتراكب. اضبط وقت التعرض على تلقائي ، والتجميع على متوسط ، و F / Stop على 1. الحصول على الصور. بعد الصورة الأولى، اضبط وقت التعرض لمطابقة ما تم حسابه تلقائيا للصورة الأولى بحيث يمكن مقارنة الصور اللاحقة مباشرة. قد يكون من المفيد التقاط صور بأوقات تعريض متعددة لتحديد وقت التعرض الأمثل لتحقيق أسطع إشارة بدون تشبع البكسل.
    3. إزالة الفئران من isoflurane ، والعودة إلى أقفاصها ، ومراقبة حتى تكون مستيقظة ومتنقلة.
    4. كرر الخطوات من الخطوة 4.2.1 حتى يتم تصوير كافة المجموعات.

النتائج

كما هو موضح في الخطوة 4.3 ، يمكن توجيه الفئران في مواضع مختلفة أثناء التصوير لتقييم وجود الخلايا التائية في الأنسجة المختلفة. يسمح وضع الاستلقاء بتقييم الخلايا التائية في الرئتين ، وهو أمر شائع في النقاط الزمنية المبكرة بعد الحقن. يتم استخدام الوضع الجانبي مع توجيه الطعم الأجنبي تحت الجلد ?...

Discussion

في حين تمت الموافقة على T-BsAb blinatumomab للأورام الخبيثة الدموية الإيجابية CD19 ، فقد ثبت أن التنفيذ الناجح ل T-BsAbs في الأورام الصلبة أكثر صعوبة. تمت الموافقة على Catumaxomab ، وهو T-BsAb موجه ضد جزيء التصاق الخلايا الظهارية (EPCAM) ، لعلاج الاستسقاء الخبيث في مرضى سرطان المبيض ، ولكن تم إيقاف إنتاج الدواء لاح?...

Disclosures

تقارير NKC تلقي منح البحوث التجارية من Y-mAbs العلاجات. NKC هو مخترع ومالك براءات الاختراع الصادرة المرخصة من قبل MSK إلى Y-mAbs Therapeutics و Biotec Pharmacon / Lallemand و Abpro-labs. لدى MSK و NKC مصلحة مالية في Y-mAbs. تقارير NKC تلقي خيارات الأسهم من Eureka Therapeutics. ليس لدى HFG و MEC أي إفصاحات ذات صلة.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور فلاديمير بونوماريف على مشاركة تركيبات لوسيفيراز المستخدمة في التجارب الموضحة في قسم النتائج التمثيلية من هذه المقالة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
293T cellsATCCCRL-11268
BSASigma AldrichA7030-10G
CD3/CD28 beadsGibco (ThermoFisher)11161D
D-Luciferin, Potassium SaltGoldbioLUCK-1G
DMEMGibco (ThermoFisher)11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)SignaGen LaboratoriesSL100688
EDTASigma AldrichE9884-100G
FBSGibco (ThermoFisher)10437028
Gag/pol plasmidAddgene14887
GFP plasmidAddgene11150-DNA.cg
Penicilin-StreptomycinGibco (ThermoFisher)15140122
Recombinant human IL-2R&D Systems202-IL-010/CF
RetronectinTakaraT100B
TrypsinGibco (ThermoFisher)25-300-120
VSV-G plasmidAddgene8454

References

  1. Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
  2. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24 (1), 50 (2018).
  3. Dreier, T., et al. T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct. The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).
  4. Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells. Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).
  5. Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy. Frontiers in Oncology. 10, 628005 (2020).
  6. Santich, B. H., et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies. Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315 (2020).
  7. Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency. Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).
  8. Park, J. A., Cheung, N. V. GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172 (2020).
  9. Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).
  10. Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114 (2021).
  11. Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626 (2020).
  12. Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia. Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).
  13. Hoseini, S. S., et al. T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509 (2021).
  14. Li, H., Er Saw, P., Song, E. Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).
  15. Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
  16. Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).
  17. Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222 (2021).
  18. Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142 (2021).
  19. Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis. Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).
  21. Skovgard, M. S., et al. Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications. Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved