루시페라아제 형질도입된 인간 T 세포를 이용한 이중특이적 항체 유도 T 세포 트래피킹 추적

요약

여기에서 우리는 T 세포 참여 이중특이적 항체의 항종양 효능 및 메커니즘을 평가하기 위한 연구에서 종양에 대한 이중특이적 항체 유도 T 세포 이동의 생체 내 추적을 용이하게 하기 위해 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하는 방법을 설명합니다.

초록

T 세포 참여 이중특이성 항체(T-BsAbs)는 고형 종양에 대한 전임상 개발 및 임상 시험의 다양한 단계에 있습니다. 원자가, 공간 배열, 도메인 간 거리 및 Fc 돌연변이와 같은 요인은 일반적으로 T 세포가 종양으로 귀환하는 데 영향을 미침으로써 이러한 치료법의 항종양 효능에 영향을 미치며, 이는 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 여기에서는 활성화된 인간 T 세포를 루시페라아제로 형질도입하여 T-BsAb 요법 연구 동안 T 세포를 생체 내 추적할 수 있는 방법을 설명합니다. T 세포를 종양으로 리디렉션하는 T-BsAbs의 능력은 치료 중 여러 시점에서 정량적으로 평가될 수 있으므로 연구자들은 T-BsAb의 항종양 효능 및 기타 개입을 종양에서 T 세포의 지속성과 연관시킬 수 있습니다. 이 방법은 T 세포 침윤을 조직학적으로 평가하기 위해 치료 동안 동물을 희생할 필요성을 완화하고, 치료 중 및 치료 후에 T 세포 밀매의 동역학을 결정하기 위해 여러 시점에서 반복될 수 있습니다.

서문

T 세포 참여 이중특이적 항체(T-BsAbs)는 하나의 결합 아암을 통해 T 세포를 결합시키고 다른 결합 아암을 통해 종양 항원을 결합시킴으로써 다클론 T 세포에 인공 특이성을 제공하는 데 사용되는 조작된 항체입니다. 이 기술은 혈액암(CD19 표적 블리나투모맙¹)에 성공적으로 적용되었으며, 수많은 T-BsAb가 다양한 고형 종양에 대한 전임상 및 임상 개발 중에 있습니다². T-BsAbs는 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 무관한 방식으로 다클론 T 세포에 관여하므로 인간 백혈구 항원(HLA)을 하향 조절하는 종양도 이러한 유형의 치료에 취약합니다 ^3,4. T-BsAbs는 T 세포와 종양 결합군의 원자가 및 공간 배열, 도메인 간 거리, 반감기에 영향을 미치고 존재하는 경우 이펙터 기능을 유도할 수 있는 Fc 도메인의 포함에 차이가 있는 수십 가지 다양한 형식으로 개발되었다⁵. 본 연구실의 이전 연구에서는 이러한 요인들이 T-BsAb의 항종양 효능에 상당한 영향을 미치며, 효능 차이는 최대 1,000배에 달하는 것으로 나타났다⁶. 이 작업을 통해 우리는 IgG-[L]-scFv 형식이 T-BsAb에 이상적인 플랫폼임을 확인했으며(T-BsAb 형식에 대한 자세한 내용은 대표 결과 섹션 참조), 이 플랫폼을 GD2(신경모세포종), HER2(유방암 및 골육종), GPA33(결장직장암), STEAP1(유잉 육종), CD19(B 세포 악성 종양) 및 CD33(B 세포 악성 종양)^7, 8,9,10,11,12,13.

고형 종양에서 T-BsAb 요법을 성공적으로 시행하기 위한 주요 과제 중 하나는 면역억제 종양 미세환경(TME)을 극복하여 종양으로의 T 세포 이동을 유도하는 것입니다¹⁴. 상술한 T-BsAb 효능에 영향을 미치는 인자는 종양에 대한 T 세포 귀환을 효과적으로 유도하는 T-BsAb의 능력에 상당한 영향을 미치지만, 이 효과는 생체 내 시스템에서 실시간으로 평가하기 어렵다. 이 원고는 치료 중 실험적 면역저하 마우스 모델에서 다양한 조직으로의 T 세포 이동을 평가하기 위해 T-BsAb의 전임상 연구에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 사용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법의 전반적인 목표는 치료 중 동물을 희생할 필요 없이 종양 및 기타 조직에서 T 세포 침윤을 평가할 수 있는 수단뿐만 아니라 T 세포 귀환 동역학 및 지속성에 대한 실시간 통찰력을 제공하는 것입니다. 세포 면역 요법에 중점을 둔 연구자의 수가 증가함에 따라 전임상 동물 모델에서 생체 내에서 T 세포를 추적하는 능력이 중요합니다. 우리는 다른 연구자들이 이 기술을 쉽게 복제할 수 있도록 루시페라아제 형질도입 T 세포를 추적하기 위해 사용한 방법에 대한 철저하고 상세한 설명을 제공하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

다음 절차는 Memorial Sloan Kettering의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 평가하고 승인했습니다.

1. 루시페라아제를 이용한 293T 세포의 형질주입 및 바이러스 상청액 수확

1. 293T 세포의 배양
   1. 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 110mL, 페니실린-스트렙토마이신 11mL를 각각 1리터의 DMEM에 추가하여 배지를 준비합니다.
   2. 5 x 10⁶ 293T 세포를 해동하고, 상기와 같이 제조된 배지와 함께 T175 플라스크에 옮긴다.
   3. 293T 세포를 6일 동안 3일마다 1:10으로 분할합니다. 세포가 90 % 이상 합류하지 않도록하십시오.
2. 293T 세포의 형질주입
   참고: 293T 세포의 T175 플라스크 1개를 형질주입하기 위해 다음의 시약 수량을 계산합니다. 더 많은 플라스크를 변환해야 하는 경우 그에 따라 조정하십시오.
   1. 피펫을 사용하여 1.5mL의 배지를 두 개의 50mL 튜브 각각에 옮깁니다. 하나의 튜브에 VSV-G 플라스미드 10μg, Gag/pol 20μg, 딱정벌레 레드 TD 토마토(CBR-TDR) 루시페라아제 플라스미드 20μg을 넣고 혼합합니다. 다른 튜브에 100 μL의 DNA in vitro transfection 시약을 넣고 혼합합니다. 두 튜브를 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
      참고: 이 원고에 설명된 모든 플라스미드는 Vladimir Ponomarev 박사가 제공했습니다.
   2. 시험 관내 형질주입 시약을 함유하는 배지를 DNA 플라스미드가 들어있는 튜브에 적가하고(약 30초에 걸쳐) 피펫으로 부드럽게 혼합한다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 이 20분 배양 동안 0.05% 트립신 5-10mL를 첨가하여 293T 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 10mL의 배지와 800 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 추가합니다. 1.5mL의 배지에 세포를 재현탁합니다.
   4. DNA 시험 관내 형질주입 시약 및 DNA 플라스미드를 함유하는 배지를 293T 세포에 첨가하고, 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   5. T175 플라스크로 옮기고 18mL의 배지를 추가합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   6. 다음날, 세포를 분리하지 않고 유리 피펫으로 배지를 조심스럽게 흡인하십시오. 18mL의 새 배지로 교체합니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양합니다.
3. 바이러스 상청액 수확
   1. 얼음 위에 놓인 피펫을 사용하여 바이러스 상청액을 제거합니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 펠릿화합니다.
      참고: 세포 펠릿이 크면 상층액을 제거할 때 플라스크에서 세포가 파열되었을 가능성이 있습니다. 이 세포는 새로운 플라스크에서 새로운 배지로 다시 도금 할 수 있습니다.
   2. 0.22 μm 필터를 사용하여 바이러스 상청액을 여과합니다.
   3. 바이러스 상청액을 즉시 사용하십시오. 얼음 또는 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하거나 -80°C에서 냉동하여 장기간 보관할 수 있습니다.

2. 루시페라아제를 이용한 활성화된 인간 T 세포의 확장 및 형질도입

1. 시험관 내에서 인간 T 세포의 활성화
   1. 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 멸균된 15mL 튜브에 첨가하여 비드를 세척하고, 비드(T 세포 2개당 비드 1개)를 추가하고, 자석 랙에 2분 동안 넣고, PBS를 흡입 꺼냈다.
   2. 1.1.1 단계에 설명 된대로 배지를 준비한 다음 IL-2를 최종 농도 30 IU / mL에 추가하고 세척 된 비드를 추가합니다. T 세포 200만 개당 2.5mL의 배지를 만들어 활성화합니다.
   3. T 세포 (갓 정제된 또는 이전에 정제된, 냉동, 해동, 및 세척된)를 혈구계 및 트리판 블루 염색을 사용하여 계수한다. 단계 2.1.2에서 제조된 배지에 T 세포를 첨가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합한다. T 세포는 세포의 출처 및 일반적인 건강 상태에 따라 최소 20배 확장됩니다. 마우스를 치료하는데 필요한 개수를 계산하고 20개로 나누어 활성화할 T 세포의 수를 결정한다. 여기서, 마우스당 20 x 106 T 세포를 예비 실험에 기초하여 사용하였다.
   4. 24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 200만 T 세포, 비드 및 IL-2를 함유하는 배지 2.5mL를 플레이트에 넣었다. 가습된 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.
   5. 다음 3일 동안 매일 20x 현미경으로 T 세포를 검사하여 루시페라아제로 형질도입할 시기를 결정합니다. 세포가 함께 뭉쳐서 배지를 고갈시켜 빨간색/분홍색에서 밝은 주황색으로 변할 때 준비가 된 것입니다.
2. 레트로넥틴 플레이트의 제조
   참고: Retronectin은 유전자 형질도입을 향상시키기 때문에 형질도입에 사용되는 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다¹⁵.
   1. PBS에 20μg/mL 레트로넥틴 2mL를 처리되지 않은 6웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 실온에서 2시간 또는 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 하나의 레트로넥틴-코팅된 웰은 200만 개의 T 세포가 형질도입될 때마다 필요하다.
   2. 플레이트 바닥을 긁지 않고 retronectin을 흡인하십시오.
   3. 6-웰 플레이트에 웰 당 PBS(멸균 여과)에 2% BSA 3mL를 추가합니다. RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
3. 스피노툼
   1. 플레이트 바닥을 긁지 않고 BSA를 흡인합니다.
   2. 웰 당 3 mL의 PBS로 웰을 한 번 세척한다. 계속 또는 새로운 PBS로 교체하고 플레이트를 4°C에서 밤새 덮어 두십시오.
   3. 웰당 2mL의 CBR-TDR 루시페라아제 바이러스 상청액(1.3단계에서 수집)을 추가합니다.
   4. 32°C에서 90분 동안 1,240 x g 로 원심분리합니다.
4. 변환
   1. T 세포를 셉니다.
   2. 플레이트 바닥을 긁지 않고 바이러스 상청액을 흡인합니다.
   3. 30 IU/mL 인간 IL-2를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 6 mL에서 웰당 200만 개의 T 세포를 플레이트합니다.
   4. 매일 T 세포를 검사하십시오. T 세포는 거의 합류할 때, 보통 2일 후에 확장될 준비가 되어 있습니다.
   5. 세포가 거의 융합되면 피펫을 사용하여 플레이트 바닥에서 부드럽게 씻어내고 각 웰을 별도의 T75 플라스크로 옮깁니다. 9mL의 배지를 추가하여 플라스크당 총 15mL의 배지를 만듭니다.
   6. 다음 날 배지 15mL를 더 추가합니다. 세포는 배지를 첨가한 다음 날 생쥐에 주입할 준비가 되어 있어야 합니다. 유세포 분석을 수행하여 성공적인 형질도입을 확인합니다(루시페라아제 구조에는 PE 채널에서 볼 수 있는 TD 토마토 형광단이 포함되어 있음)¹⁶.

3. 면역저하 마우스에서 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 생착

1. 주입을 위해 T 세포를 준비하고 계수합니다.
   1. 플라스크에서 T 세포를 제거하고 계산합니다. 세포는 일반적으로 활성화 후 7일째에 20x-30x 확장되면 주입할 준비가 됩니다.
   2. T 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 2mL의 배지에 재현탁하고 자석 랙을 사용하여 비드를 제거합니다.
   3. T 세포가 이중특이적 항체와 별도로 주입되는 실험의 경우, T 세포를 계수하고 최종 농도가 배지 100μL당 2,000만 T 세포가 되도록 재현탁합니다. 3.2단계로 건너뜁니다. 생체 외 무장 T 세포(EAT)를 사용한 실험의 경우 3.1.4단계로 건너뜁니다.
   4. 생체 외 무장 T 세포를 사용한 실험의 경우, T 세포를 세고 각 그룹마다 개별 1.5mL 튜브로 분리하여 마우스당 2,000만 개의 세포를 사용합니다. 예를 들어, 각각 5마리의 마우스로 구성된 3개의 그룹이 있는 경우 각각 1억 개의 T 세포가 있는 3개의 1.5mL 튜브를 준비합니다.
   5. 1.5mL 튜브를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. T 세포 펠릿을 방해하지 않고 매체를 조심스럽게 제거합니다. 이중특이적 항체를 포함하는 배지 50μL 이하에서 재현탁합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: 이 연구에서 수행된 실험의 목적을 위해 실험실에서 생성된 독점적인 IgG-[L]-scFv T 세포 결합 이중특이적 항체가 사용되었습니다. T 세포 준비를 위해, 20 x 10⁶ T 세포 당 5 μg의 항체를 사용한다. 시판되는 이중특이적 항체도 사용할 수 있다.
   6. 각 튜브에 1,450μL의 배지를 추가하여 과잉 항체를 씻어냅니다. 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 배지를 조심스럽게 흡인하고, 100μL 배지당 2,000만 개의 무장 T 세포 농도로 재현탁합니다.
2. 생쥐에 주입 및 생착
   1. 1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.
      알림: 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 제공하십시오.
   2. 26G 바늘을 사용하여 마우스당 100μL의 배지에 2천만 개의 T 세포를 안와후로 주입합니다.
   3. 생체 내에서 T 세포 생존을 지원하기 위해 1,000U 재조합 IL-2를 피하 투여합니다.
   4. 이중특이적 항체를 안와후(T 세포 주입에 사용되지 않는 눈 내로) 또는 복강내로 투여한다. 생쥐가 마취에서 회복하고 새장으로 돌아갈 수 있도록하십시오.
      참고: 여기서도 실험실에서 생성된 독점 항체가 사용되었지만 상업적으로 이용 가능한 항체를 대신 사용할 수 있습니다. 여기의 실험에서, 투여량당 마우스당 0.3-10 μg의 항체를 투여하였다. 항체는 3-4주 동안 일주일에 두 번 투여되었습니다.

4. 루시페라아제 형질도입 T 세포가 생착된 마우스의 생체 내 이미징

참고: 이 단계는 이미징 당일에 수행되어야 하며, T 세포 및/또는 항체가 마우스에 투여되는 날과 반드시 같은 날은 아닙니다. 전형적으로, 우리는 루시페라아제-형질도입된 T 세포의 투여 후 24시간 후에 이미징을 수행합니다.

1. D-루시페린의 제조
   1. D-루시페린 1g을 멸균 PBS 33.3mL(최종 농도: 30mg/mL)에 녹입니다.
   2. 용해된 D-루시페린을 33 x 1.5 mL 미세원심분리기 튜브에 분취하여 튜브를 -20°C로 유지합니다.
   3. 이미징 당일, 이미징할 동물의 수에 대해 30mg/mL D-루시페린의 충분한 분취량을 해동합니다. 하나의 튜브로 10 마리의 동물에게 충분합니다.
      알림: 사용 후 남은 D-루시페린을 다시 얼리십시오. D-루시페린은 최소 5번의 동결/해동 주기 동안 안정적입니다.
2. 생쥐에 D-루시페린 투여
   참고: D-루시페린을 마우스에 투여하기 전에 이미징 소프트웨어를 열고 시스템을 초기화하십시오. 카메라는 냉각하는 데 몇 분이 걸릴 수 있으며, 이는 마우스에 D-luciferin을 주입하기 전에 수행되어야 기판 투여 후 5분 후에 이미징이 이루어질 수 있습니다.
   1. 1L/min 산소에 3.5%(v/v) 흡입 이소플루란을 공급하는 챔버에서 최대 5마리의 마우스를 마취합니다. 마우스는 뒷다리 페달 철수 반사가 사라졌을 때 완전히 마취됩니다.
   2. 마우스가 완전히 마취되면 26G 바늘로 안와 후 주사로 마우스당 30mg/mL D-루시페린 100μL(마우스당 3mg)를 투여합니다. D-luciferin을 다음 그룹에 투여하기 전에 이 마우스 그룹을 이미지화합니다. 다음 그룹의 마우스를 이소플루란 챔버에 넣어 이전 그룹이 이미징되는 동안 마취합니다.
3. 루시페라아제 형질도입된 T 세포 이미징
   1. 마취된 마우스를 이미저의 기밀 챔버로 옮기고 0.5L/min에서 3% 이소플루란을 계속 투여합니다. 이종 이식편을 지탱하는 측면이 카메라를 향하도록 마우스를 옆으로 눕힙니다. 마우스를 앙와위 자세로 사용하여 폐의 T 세포 존재를 평가하기 위해 또 다른 이미지 세트를 촬영합니다.
   2. 획득 제어판을 사용하여 발광(Luminescent), 사진(Photograph) 및 오버레이(Overlay)를 선택합니다. 노출 시간을 자동으로, 비닝을 중간으로, F/정지를 1로 설정합니다. 이미지를 획득합니다. 첫 번째 이미지 이후에는 첫 번째 이미지에 대해 자동으로 계산된 노출 시간과 일치하도록 노출 시간을 설정하여 후속 이미지를 직접 비교할 수 있습니다. 픽셀 채도 없이 가장 밝은 신호를 얻기 위한 최적의 노출 시간을 결정하기 위해 여러 노출 시간으로 이미지를 캡처하는 것이 유용할 수 있습니다.
   3. 이소플루란에서 생쥐를 제거하고 새장으로 돌아가 깨어 있고 걸을 수 있을 때까지 관찰합니다.
   4. 모든 그룹이 이미지화될 때까지 4.2.1단계부터 단계를 반복합니다.

결과

단계 4.3에 기술된 바와 같이, 마우스는 상이한 조직에서의 T 세포의 존재를 평가하기 위해 영상화 동안 상이한 위치에 배향될 수 있다. 앙와위 자세는 폐의 T 세포를 평가할 수 있게 하며, 이는 주사 후 초기 시점에서 일반적입니다. 피하 이종이편이 위를 향하도록 하는 측면 위치는 종양으로의 T 세포 이동을 가장 잘 평가하는 데 사용됩니다. 암컷 C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rg^tm1Sug/JicTac ...

토론

T-BsAb 블리나투모맙이 CD19 양성 혈액 악성 종양에 대해 승인되었지만 고형 종양에서 T-BsAb를 성공적으로 구현하는 것은 훨씬 더 어려운 것으로 입증되었습니다. 상피세포 부착 분자(EPCAM)에 대한 T-BsAb인 카투막소맙(Catumaxomab)은 난소암 환자의 악성 복수 치료제로 승인되었으나, 이후 상업적 이유로 약물 생산이 중단되었다¹⁹. 다른 T-BsAb는 고형 종양에 대해 승인되지 않았으며, 이는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454