Monitoraggio del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici utilizzando cellule T umane trasdotte dalla luciferasi

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane con luciferasi per facilitare il monitoraggio in vivo del traffico di cellule T indotto da anticorpi bispecifici ai tumori in studi per valutare l'efficacia antitumorale e il meccanismo degli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T.

Abstract

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono in varie fasi di sviluppo preclinico e test clinici per i tumori solidi. Fattori come la valenza, la disposizione spaziale, la distanza interdominio e le mutazioni Fc influenzano l'efficacia antitumorale di queste terapie, comunemente influenzando l'homing delle cellule T nei tumori, che rimane una grande sfida. Qui, descriviamo un metodo per trasdurre le cellule T umane attivate con luciferasi, consentendo il tracciamento in vivo delle cellule T durante gli studi di terapia T-BsAb. La capacità di T-BsAbs di reindirizzare le cellule T ai tumori può essere valutata quantitativamente in più punti temporali durante il trattamento, consentendo ai ricercatori di correlare l'efficacia antitumorale di T-BsAbs e altri interventi con la persistenza delle cellule T nei tumori. Questo metodo allevia la necessità di sacrificare gli animali durante il trattamento per valutare istologicamente l'infiltrazione delle cellule T e può essere ripetuto in più punti temporali per determinare la cinetica del traffico di cellule T durante e dopo il trattamento.

Introduzione

Gli anticorpi bispecifici che coinvolgono le cellule T (T-BsAbs) sono anticorpi ingegnerizzati utilizzati per fornire specificità artificiale alle cellule T policlonali coinvolgendo le cellule T attraverso un braccio legante e un antigene tumorale attraverso un altro braccio legante. Questa tecnologia è stata applicata con successo ai tumori ematologici (CD19-targeting blinatumomab¹), e numerosi T-BsAb sono in fase di sviluppo preclinico e clinico per una varietà di tumori solidi così come². I T-BsAb coinvolgono le cellule T policlonali in modo indipendente dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e quindi anche i tumori che sottoregolano gli antigeni dei leucociti umani (HLA) sono suscettibili a questo tipo di terapia ^3,4. I T-BsAb sono stati sviluppati in dozzine di formati diversi, con differenze nella valenza e nella disposizione spaziale delle cellule T e dei bracci leganti il tumore, le distanze interdomini e l'inclusione di un dominio Fc, che influenza l'emivita e può indurre funzioni effettrici se presente⁵. Precedenti lavori nel nostro laboratorio hanno dimostrato che questi fattori influenzano significativamente l'efficacia antitumorale di T-BsAbs, con differenze fino a 1.000 volte nella potenza⁶. Attraverso questo lavoro, abbiamo identificato il formato IgG-[L]-scFv come la piattaforma ideale per T-BsAbs (vedere la sezione Risultati rappresentativi per maggiori dettagli sui formati T-BsAb) e abbiamo applicato questa piattaforma a target tra cui GD2 (neuroblastoma), HER2 (cancro al seno e osteosarcoma), GPA33 (cancro del colon-retto), STEAP1 (sarcoma di Ewing), CD19 (tumori maligni delle cellule B) e CD33 (tumori maligni delle cellule B)^7, 8,9,10,11,12,13.

Una delle principali sfide per implementare con successo la terapia T-BsAb nei tumori solidi è superare un microambiente tumorale immunosoppressivo (TME) per guidare il traffico di cellule T verso i tumori¹⁴. I fattori che influenzano l'efficacia di T-BsAb sopra descritti hanno un impatto significativo sulla capacità di T-BsAbs di indurre efficacemente l'homing delle cellule T ai tumori, ma questo effetto è difficile da valutare in un sistema in vivo in tempo reale. Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata dell'uso delle cellule T trasdotte dalla luciferasi negli studi preclinici di T-BsAbs per valutare il traffico di cellule T verso vari tessuti in modelli murini immunocompromessi sperimentali durante il trattamento. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un mezzo per valutare l'infiltrazione delle cellule T nei tumori e in altri tessuti, nonché una visione in tempo reale della cinetica e della persistenza delle cellule T, senza la necessità di sacrificare animali durante il trattamento. Per il crescente numero di ricercatori che si concentrano sulle immunoterapie cellulari, la capacità di tracciare le cellule T in vivo in modelli animali preclinici è fondamentale. Miriamo a fornire una descrizione completa e dettagliata del metodo che abbiamo impiegato per tracciare le cellule T trasdotte dalla luciferasi per consentire ad altri ricercatori di replicare facilmente questa tecnica.

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Protocollo

Le seguenti procedure sono state valutate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Memorial Sloan Kettering.

1. Trasfezione di cellule 293T con luciferasi e prelievo di surnatante virale

1. Coltura di cellule 293T
   1. Preparare i terreni aggiungendo quanto segue a un litro di DMEM ciascuno: 110 ml di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 11 ml di penicillina-streptomicina.
   2. Scongelare 5 x 10⁶ 293T e trasferirle in un matraccio T175 con i mezzi preparati come descritto sopra.
   3. Dividere le celle 293T 1:10 ogni 3 giorni per 6 giorni. Non permettere alle cellule di diventare più del 90% confluenti.
2. Trasfezione di cellule 293T
   NOTA: Le seguenti quantità di reagenti sono calcolate per trasfettare un matraccio T175 di cellule 293T. Regolare di conseguenza se devono essere trasdotti più palloni.
   1. Trasferire 1,5 mL di fluido in ciascuna delle due provette da 50 mL utilizzando una pipetta. A una provetta, aggiungere 10 μg di plasmide VSV-G, 20 μg di Gag/pol e 20 μg di plasmide luciferasi, pomodoro rosso coleottero click beetle (CBR-TDR) e mescolare. All'altra provetta, aggiungere 100 μL di reagente di trasfezione in vitro del DNA e mescolare. Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti.
      NOTA: Tutti i plasmidi descritti in questo manoscritto sono stati forniti dal Dr. Vladimir Ponomarev.
   2. Trasferire il mezzo contenente il reagente di trasfezione in vitro del DNA goccia a goccia sulla provetta contenente i plasmidi del DNA (oltre circa 30 s) e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare a RT per 20 min.
   3. Durante questa incubazione di 20 minuti, staccare le cellule 293T aggiungendo 5-10 ml di tripsina allo 0,05%. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 ml di fluido e centrifugare a 800 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 1,5 ml di supporto.
   4. Aggiungere i terreni contenenti il reagente di trasfezione in vitro del DNA e i plasmidi del DNA alle cellule 293T e incubare a 37 °C per 30 minuti.
   5. Trasferire in un matraccio T175 e aggiungere 18 mL di supporto. Incubare a 37 °C durante la notte.
   6. Il giorno dopo, aspirare con cura il supporto con una pipetta di vetro senza staccare le celle. Sostituire con 18 mL di terreno fresco. Incubare a 37 °C durante la notte in un'incubatrice.
3. Raccolta di supernatante virale
   1. Rimuovere il surnatante virale usando una pipetta messa sul ghiaccio. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti per pellettare le cellule e i detriti.
      NOTA: Se il pellet cellulare è grande, le cellule sono state probabilmente interrotte dal pallone quando il surnatante è stato rimosso. Queste celle possono essere nuovamente placcate in un nuovo pallone con terreni freschi.
   2. Filtrare il surnatante virale utilizzando un filtro da 0,22 μm.
   3. Utilizzare immediatamente il surnatante virale. Conservalo su ghiaccio o a 4 °C per un massimo di 24 ore o congelalo a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

2. Espansione e trasduzione di cellule T umane attivate con luciferasi

1. Attivazione di cellule T umane in vitro
   1. Lavare le perle aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in un tubo sterile da 15 ml, aggiungendo perline (una perla per due cellule T), mettendo in un rack magnetico per 2 minuti e aspirando il PBS.
   2. Preparare i terreni come descritto al punto 1.1.1, quindi aggiungere IL-2 ad una concentrazione finale di 30 UI/ml e aggiungere le perle lavate. Crea 2,5 ml di media per ogni due milioni di cellule T da attivare.
   3. Contare le cellule T (appena purificate o precedentemente purificate, congelate, scongelate e lavate) utilizzando un emocitometro e una macchia blu tripano. Aggiungere le cellule T al mezzo preparato al punto 2.1.2 e capovolgere delicatamente il tubo per miscelare. Le cellule T si espanderanno almeno 20 volte a seconda della fonte e della salute generale delle cellule. Determinare il numero di cellule T da attivare calcolando il numero necessario per trattare i topi e dividendo per 20. Qui, sono state utilizzate 20 x 106 cellule T per topo sulla base di esperimenti preliminari.
   4. Piastra 2,5 ml di terreno contenente due milioni di cellule T, perline e IL-2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Coltura a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
   5. Esaminare le cellule T al microscopio 20x ogni giorno per i prossimi 3 giorni per determinare quando trasdurre con luciferasi. Le cellule sono pronte quando si aggregano e impoveriscono il supporto, trasformandolo da rosso / rosa ad arancione chiaro.
2. Preparazione di piastre retronectina
   NOTA: La retronectina viene utilizzata per rivestire le piastre utilizzate nella trasduzione in quanto migliora la trasduzione genica¹⁵.
   1. Aggiungere 2 mL di 20 μg/mL di retronectina in PBS in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti non trattata. Incubare per 2 ore a RT o 1 ora a 37 °C. È necessario un pozzetto rivestito di retronectina per ogni due milioni di cellule T da trasdurre.
   2. Aspirare la retronectina senza graffiare il fondo della piastra.
   3. Aggiungere 3 ml di BSA al 2% in PBS (filtrato sterile) per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare per 30 minuti a RT.
3. Spinoculazione
   1. Aspirare il BSA senza graffiare il fondo della piastra.
   2. Lavare i pozzetti una volta con 3 ml di PBS per pozzetto. Continuare o sostituire con PBS fresco e lasciare la piastra coperta a 4 °C per una notte.
   3. Aggiungere 2 ml di surnatante virale CBR-TDR luciferasi (raccolto nella fase 1.3) per pozzetto.
   4. Centrifugare a 1.240 x g per 90 minuti a 32 °C.
4. Trasduzione
   1. Conta le cellule T.
   2. Aspirare il surnatante virale senza graffiare il fondo del piatto.
   3. Placcare due milioni di cellule T per pozzetto in 6 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 30 UI/mL di IL-2 umana.
   4. Esaminare le cellule T ogni giorno. Le cellule T sono pronte per essere espanse quando sono quasi confluenti, di solito dopo 2 giorni.
   5. Quando le cellule sono quasi confluenti, lavarle delicatamente dal fondo della piastra usando una pipetta e trasferire ciascun pozzetto in un matraccio T75 separato. Aggiungere 9 mL di supporto per un totale di 15 mL di supporto per pallone.
   6. Il giorno successivo, aggiungere altri 15 ml di supporto. Le cellule dovrebbero essere pronte per l'iniezione nei topi il giorno dopo questa aggiunta di media. Confermare la corretta trasduzione eseguendo la citometria a flusso (il costrutto di luciferasi contiene un fluoroforo di pomodoro TD visibile nel canale PE)¹⁶.

3. Attecchimento di cellule T trasdotte dalla luciferasi in topi immunocompromessi

1. Preparare e contare le cellule T per l'iniezione.
   1. Rimuovere le cellule T dai palloni e contare. Le cellule sono pronte per l'iniezione quando si sono espanse 20x-30x, di solito entro il giorno 7 dopo l'attivazione.
   2. Centrifugare le cellule T a 800 x g per 5 minuti. Risospendere in 2 ml di supporto e rimuovere le perline utilizzando un rack magnetico.
   3. Per gli esperimenti in cui le cellule T saranno iniettate separatamente dagli anticorpi bispecifici, contare le cellule T e risospendere in modo che la concentrazione finale sia di 20 milioni di cellule T per 100 μL di mezzo. Andare al passaggio 3.2. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo (EAT), andare al punto 3.1.4.
   4. Per gli esperimenti che utilizzano cellule T armate ex vivo , contare le cellule T e separarle in singoli tubi da 1,5 ml per ciascun gruppo, con 20 milioni di cellule per topo. Ad esempio, se ci sono tre gruppi di cinque topi ciascuno, preparare tre tubi da 1,5 ml con 100 milioni di cellule T ciascuno.
   5. Centrifugare i tubi da 1,5 mL a 800 x g per 5 minuti. Rimuovere accuratamente il supporto senza disturbare il pellet di cellule T. Risospendere in non più di 50 μL di terreno contenente gli anticorpi bispecifici. Incubare a RT per 30 min.
      NOTA: Ai fini degli esperimenti condotti in questo studio, sono stati utilizzati anticorpi bispecifici proprietari IgG-[L]-scFv che coinvolgono le cellule T generati in laboratorio. Per l'armamento delle cellule T, utilizzare 5 μg di anticorpi per 20 x 10⁶ cellule T. Potrebbero essere utilizzati anche anticorpi bispecifici disponibili in commercio.
   6. Lavare via gli anticorpi in eccesso aggiungendo 1.450 μL di fluido a ciascuna provetta. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti, aspirare accuratamente il fluido e risospendere ad una concentrazione di 20 milioni di cellule T armate per 100 μL di media.
2. Iniezione e attecchimento nei topi
   1. Anestetizzare i topi in una camera che fornisce il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
      NOTA: Fornire supporto termico durante tutta la procedura.
   2. Utilizzando un ago da 26 G, iniettare 20 milioni di cellule T in 100 μL di terreno retroorbitalmente per topo.
   3. Somministrare 1.000 U ricombinante IL-2 per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza delle cellule T in vivo.
   4. Somministrare gli anticorpi bispecifici retroorbitalmente (nell'occhio non utilizzati per l'iniezione di cellule T) o intraperitonealmente. Consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia e tornare alle loro gabbie.
      NOTA: Ancora una volta, qui, sono stati utilizzati anticorpi proprietari generati in laboratorio, ma potrebbero essere utilizzati anticorpi disponibili in commercio. Negli esperimenti qui, sono stati somministrati 0,3-10 μg di anticorpi per topo per dose. Gli anticorpi sono stati somministrati due volte a settimana per 3-4 settimane.

4. Imaging in vivo di topi innestati con cellule T trasdotte da luciferasi

NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno dell'imaging, che non è necessariamente lo stesso giorno in cui le cellule T e / o gli anticorpi vengono somministrati ai topi. Tipicamente, eseguiamo l'imaging 24 ore dopo la somministrazione delle cellule T trasdotte dalla luciferasi.

1. Preparazione di D-luciferina
   1. Sciogliere 1 g di D-luciferina in 33,3 mL di PBS sterile (concentrazione finale: 30 mg/ml).
   2. Aliquot la D-luciferina disciolta in provette da microcentrifuga da 33 x 1,5 mL e mantenere le provette a -20 °C.
   3. Il giorno dell'imaging, scongelare aliquote sufficienti di 30 mg / mL di D-luciferina per il numero di animali da fotografare. Un tubo è sufficiente per 10 animali.
      NOTA: Ricongelare la D-luciferina rimanente dopo l'uso. La D-luciferina è stabile per almeno cinque cicli di congelamento/scongelamento.
2. Somministrazione di D-luciferina ai topi
   NOTA: Prima di somministrare D-luciferina ai topi, aprire il software di imaging e inizializzare il sistema. La fotocamera può richiedere diversi minuti per raffreddarsi, e questo dovrebbe essere fatto prima che i topi vengano iniettati con D-luciferina per garantire che l'imaging possa avvenire 5 minuti dopo la somministrazione del substrato.
   1. Anestetizzare fino a cinque topi in una camera che forniscono il 3,5% (v/v) di isoflurano inalato in 1 L/min di ossigeno. I topi sono completamente anestetizzati quando il riflesso di ritiro del pedale dell'arto posteriore è scomparso.
   2. Una volta che i topi sono completamente anestetizzati, somministrare 100 μL di 30 mg/mL di D-luciferina per topo (3 mg per topo) mediante iniezione retroorbitale con un ago da 26 G. Immagina questo gruppo di topi prima di somministrare D-luciferina al gruppo successivo. Posizionare il gruppo successivo di topi nella camera di isoflurano da anestetizzare mentre viene visualizzata l'immagine del gruppo precedente.
3. Imaging delle cellule T trasdotte dalla luciferasi
   1. Spostare i topi anestetizzati nella camera a tenuta di luce dell'imager e continuare a somministrare isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Posizionare i topi sui fianchi in modo tale che il fianco che porta lo xenotrapianto sia rivolto verso la fotocamera. Prendi un'altra serie di immagini con i topi in posizione supina per valutare la presenza di cellule T nei polmoni.
   2. Utilizzando il Pannello di controllo acquisizione, selezionate Luminescente, Fotografia e Sovrapposizione. Impostare il tempo di esposizione su auto, il binning su medio e F/Stop su 1. Acquisire immagini. Dopo la prima immagine, impostare il tempo di esposizione in modo che corrisponda a quello calcolato automaticamente per la prima immagine in modo che le immagini successive possano essere confrontate direttamente. Può essere utile acquisire immagini con più tempi di esposizione per determinare il tempo di esposizione ottimale per ottenere il segnale più luminoso senza saturazione di pixel.
   3. Rimuovere i topi dall'isoflurano, tornare alle loro gabbie e osservare fino a quando non sono svegli e deambulanti.
   4. Ripetere i passaggi dal passaggio 4.2.1 fino a quando non è stata creata la visualizzazione di tutti i gruppi.

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Risultati

Come descritto nella fase 4.3, i topi possono essere orientati in diverse posizioni durante l'imaging per valutare la presenza di cellule T in diversi tessuti. Il posizionamento supino consente la valutazione delle cellule T nei polmoni, che è comune nei primi punti temporali dopo l'iniezione. Il posizionamento laterale con lo xenotrapianto sottocutaneo rivolto verso l'alto viene utilizzato per valutare al meglio il traffico di cellule T verso il tumore. Topi femmina C.Cg-Rag2^tm1Fwa Il2rg^tm1Sug...

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Discussione

Mentre il T-BsAb blinatumomab è stato approvato per le neoplasie ematologiche CD19-positive, l'implementazione di successo di T-BsAbs nei tumori solidi si è dimostrata molto più difficile. Catumaxomab, un T-BsAb diretto contro la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM), è stato approvato per il trattamento dell'ascite maligna in pazienti con cancro ovarico, ma la produzione del farmaco è stata successivamente interrotta per motivi commerciali¹⁹. Nessun altro T-BsAbs è stato app...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454