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要約

ここでは、抗腫瘍効果とT細胞関与二重特異性抗体のメカニズムを評価する研究において、腫瘍への二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の in vivo 追跡を容易にするために、ルシフェラーゼでヒトT細胞を形質導入する方法について説明します。

要約

T細胞関与型二重特異性抗体(T-BsAbs)は、固形腫瘍の前臨床開発および臨床試験のさまざまな段階にあります。原子価、空間的配置、ドメイン間距離、およびFc変異などの要因は、一般に腫瘍へのT細胞のホーミングに影響を与えることによって、これらの治療法の抗腫瘍効果に影響を及ぼしますが、これは依然として大きな課題です。ここでは、活性化ヒトT細胞をルシフェラーゼで形質導入し、T-BsAb療法研究中のT細胞の in vivo 追跡を可能にする方法について説明します。T-BsAbsがT細胞を腫瘍にリダイレクトする能力は、治療中の複数の時点で定量的に評価できるため、研究者はT-BsAbsの抗腫瘍効果やその他の介入を腫瘍におけるT細胞の持続性と相関させることができます。この方法は、T細胞浸潤を組織学的に評価するために治療中に動物を犠牲にする必要性を軽減し、治療中および治療後のT細胞輸送の動態を決定するために複数の時点で繰り返すことができます。

概要

T細胞関与二重特異性抗体(T-BsAbs)は、1つの結合アームを介してT細胞を関与させ、別の結合アームを介して腫瘍抗原を関与させることにより、ポリクローナルT細胞に人工的な特異性を提供するために使用される操作された抗体です。この技術は血液がん(CD19を標的とするブリナツモマブ1)への適用に成功しており、さまざまな固形腫瘍に対しても多数のT-BsAbが前臨床および臨床開発中です2。T-BsAbsは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)非依存的にポリクローナルT細胞に作用するため、ヒト白血球抗原(HLA)を下方制御する腫瘍でさえ、このタイプの治療を受けやすいのです3,4。T-BsAbsは数十の異なるフォーマットで開発されており、T細胞と腫瘍結合アームの原子価と空間配置、ドメイン間距離、および半減期に影響を与え、存在する場合はエフェクター機能を誘導できるFcドメインの包含に違いがあります5。私たちの研究室での以前の研究では、これらの要因がT-BsAbsの抗腫瘍効果に大きく影響し、効力に最大1,000倍の違いがあることが示されています6。この研究を通じて、IgG-[L]-scFvフォーマットがT-BsAbの理想的なプラットフォームであることを特定し(T-BsAbフォーマットの詳細については代表的な結果のセクションを参照)、GD2(神経芽細胞腫)、HER2(乳がんおよび骨肉腫)、GPA33(結腸直腸がん)、STEAP1(ユーイング肉腫)、CD19(B細胞悪性腫瘍)、CD33(B細胞悪性腫瘍)などの標的に適用しました7。 8,9,10,11,12,13。

固形腫瘍にT-BsAb療法を成功裏に実施するための主要な課題の1つは、免疫抑制性腫瘍微小環境(TME)を克服して腫瘍へのT細胞輸送を促進することです14。上記のT-BsAbの有効性に影響を与える因子は、T-BsAbsが腫瘍へのT細胞ホーミングを効果的に誘導する能力に大きな影響を与えますが、この効果を in vivo システムでリアルタイムで評価することは困難です。この原稿は、治療中の実験的免疫不全マウスモデルにおける様々な組織へのT細胞輸送を評価するためのT-BsAbsの前臨床試験におけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の使用の詳細な説明を提供する。この方法の全体的な目標は、治療中に動物を犠牲にすることなく、腫瘍および他の組織におけるT細胞浸潤を評価する手段、ならびにT細胞ホーミング動態および持続性に関するリアルタイムの洞察を提供することである。細胞免疫療法に焦点を当てる研究者の数が増えているため、前臨床動物モデルで in vivo でT細胞を追跡する能力は非常に重要です。私たちは、ルシフェラーゼ形質導入T細胞を追跡するために採用した方法の徹底的で詳細な説明を提供し、他の研究者がこの技術を簡単に複製できるようにすることを目指しています。

プロトコル

以下の手順は、メモリアルスローンケタリングの施設動物管理および使用委員会によって評価および承認されています。

1. 293T細胞へのルシフェラーゼのトランスフェクションとウイルス上清の回収

  1. 293T細胞の培養
    1. それぞれ1リットルのDMEMに以下を加えて培地を調製します:110 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、11 mLのペニシリン-ストレプトマイシン。
    2. 5 x 106 293T細胞を解凍し、上記のように調製した培地と共にT175フラスコに移します。
    3. 293T細胞を3日ごとに1:10で6日間分割します。細胞が90%を超えてコンフルエントにならないようにしてください。
  2. 293T細胞のトランスフェクション
    注:以下の試薬量は、293T細胞の1つのT175フラスコをトランスフェクトするために計算されます。より多くのフラスコを形質導入する場合は、それに応じて調整してください。.
    1. ピペットを使用して、1.5 mLの培地を2本の50 mLチューブのそれぞれに移します。1本のチューブに、VSV-Gプラスミド10 μg、Gag/pol20 μg、カブトムシレッドTDトマト(CBR-TDR)ルシフェラーゼプラスミド20 μgを加えて混合します。もう一方のチューブに、100 μLのDNA インビトロ トランスフェクション試薬を加えて混合します。両方のチューブを室温(RT)で5分間インキュベートします。
      注:この原稿に記載されているすべてのプラスミドは、ウラジミール・ポノマレフ博士によって提供されました。
    2. DNA in vitro トランスフェクション試薬を含む培地を、DNAプラスミドを含むチューブに滴下し(約30秒以上)、ピペットで穏やかに混合します。RTで20分間インキュベートします。
    3. この20分間のインキュベーション中に、5〜10 mLの0.05%トリプシンを添加して293T細胞を剥離します。細胞が剥離したら、10 mLの培地を加え、800 x g で5分間遠心分離します。細胞を1.5 mLの培地に再懸濁します。
    4. DNA in vitro トランスフェクション試薬と DNA プラスミドを含む培地を 293T 細胞に加え、37°C で 30 分間インキュベートします。
    5. T175フラスコに移し、18 mLの培地を加えます。37°Cで一晩インキュベートします。
    6. 翌日、細胞を剥離せずにガラスピペットで培地を注意深く吸引します。18 mLの新しい培地と交換してください。インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。
  3. ウイルス上清の採取
    1. 氷の上に置いたピペットを使用してウイルス上清を除去します。800 x g で5分間遠心分離し、細胞と破片をペレット化します。
      注:細胞ペレットが大きい場合、上清を除去したときに細胞がフラスコから破壊された可能性があります。これらの細胞は、新鮮な培地と共に新しいフラスコに再度プレーティングすることができる。
    2. 0.22 μmフィルターを用いてウイルス上清をろ過します。
    3. ウイルス上清をすぐに使用してください。氷上または4°Cで最大24時間保管するか、-80°Cで凍結して長期保管します。

2. ルシフェラーゼによる活性化ヒトT細胞の増殖と形質導入

  1. インビトロでのヒトT細胞の活性化
    1. 滅菌した15 mLチューブに0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)と2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)10 mLを加え、ビーズ(T細胞2個あたりビーズ1個)を加え、マグネットラックに2分間入れ、PBSを吸引してビーズを洗浄します。
    2. ステップ1.1.1で説明した培地を調製し、IL-2を最終濃度30 IU/mLまで添加し、洗浄ビーズを添加します。活性化するT細胞200万個ごとに2.5 mLの培地を作ります。
    3. 血球計算盤とトリパンブルー染色を使用してT細胞(新たに精製または以前に精製、凍結、解凍、および洗浄)をカウントします。ステップ2.1.2で準備した培地にT細胞を加え、チューブを静かに反転させて混合します。T細胞は、細胞の供給源と一般的な健康状態に応じて、少なくとも20倍に拡大します。マウスの治療に必要な数を計算し、20で割ることにより、活性化するT細胞の数を決定します。ここでは、マウスあたり20 x 106個のT細胞を予備実験に基づいて使用した。
    4. 200万個のT細胞、ビーズ、およびIL-2を含む培地2.5 mLを24ウェル組織培養プレートの各ウェルにプレートします。加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで培養する。
    5. T細胞を次の3日間毎日20倍の顕微鏡で調べて、ルシフェラーゼで形質導入する時期を決定します。細胞が凝集して培地を使い果たし、赤/ピンクから淡いオレンジに変わると、細胞は準備が整います。
  2. レトロネクチンプレートの調製
    注:レトロネクチンは、遺伝子導入15を増強するため、形質導入に使用されるプレートをコーティングするために使用されます。
    1. PBS中の20 μg/mLレトロネクチン2 mLを未処理の6ウェルプレートのウェルに加えます。RTで2時間、または37°Cで1時間インキュベートします。 200万個のT細胞が形質導入されるごとに1つのレトロネクチンコーティングウェルが必要です。
    2. プレートの底を傷つけずにレトロネクチンを吸引します。
    3. 6ウェルプレートのウェルあたり3 mLのPBS(滅菌ろ過済み)中の2%BSAを追加します。RTで30分間インキュベートします。
  3. スピノキュレーション
    1. プレートの底を傷つけずにBSAを吸引します。
    2. ウェルあたり3 mLのPBSでウェルを1回洗浄します。続行するか、新しいPBSと交換し、プレートを4°Cで一晩覆ったままにします。
    3. ウェルあたり2 mLのCBR-TDRルシフェラーゼウイルス上清(ステップ1.3で収集)を追加します。
    4. 1,240 x g で 32 °C で 90 分間遠心分離します。
  4. 伝達
    1. T細胞を数えます。
    2. プレートの底を傷つけずにウイルス上清を吸引します。
    3. 30 IU/mLのヒトIL-2を含む6 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にウェルあたり200万個のT細胞をプレートします。
    4. T細胞を毎日調べます。T細胞は、コンフルエントに近いとき、通常は2日後に増殖する準備ができています。
    5. 細胞がほぼコンフルエントになったら、ピペットを使用してプレートの底から細胞を静かに洗い流し、各ウェルを別々のT75フラスコに移します。9 mLの培地を加えて、フラスコあたり合計15 mLの培地を加えます。
    6. 翌日、さらに15 mLの培地を追加します。細胞は、この培地添加の翌日にマウスに注射する準備ができているはずです。フローサイトメトリー(ルシフェラーゼコンストラクトには、PEチャネルに見えるTDトマト蛍光色素が含まれています)16を実行して、形質導入が成功したことを確認します。

3. 免疫不全マウスにおけるルシフェラーゼ形質導入T細胞の生着

  1. 注射用のT細胞を準備してカウントします。
    1. フラスコからT細胞を取り出し、カウントします。細胞は、通常、活性化後7日目までに、20倍〜30倍に拡大したときに注入する準備ができています。
    2. T細胞を800 x g で5分間遠心分離します。2 mLの培地に再懸濁し、マグネットラックを使用してビーズを取り外します。
    3. T細胞を二重特異性抗体とは別に注入する実験では、T細胞をカウントし、最終濃度が培地100 μLあたり2,000万個のT細胞になるように再懸濁します。手順 3.2 に進みます。 ex vivo 武装T細胞(EAT)を使用した実験の場合は、ステップ3.1.4に進みます。
    4. ex vivoで武装したT細胞を用いた実験では、T細胞を数え、マウスあたり2,000万個の細胞を使用して、グループごとに個別の1.5 mLチューブに分離します。例えば、それぞれ5匹のマウスからなる3つのグループがある場合、それぞれ1億個のT細胞を含む3つの1.5mLチューブを用意する。
    5. 1.5 mLチューブを800 x g で5分間遠心分離します。T細胞ペレットを乱さずに培地を慎重に取り出します。二重特異性抗体を含む50 μL以下の培地に再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。
      注:この研究で実施された実験の目的のために、実験室で生成された独自のIgG-[L]-scFv T細胞関与二重特異性抗体を使用しました。T細胞アーミングには、20 x 106 T細胞あたり5 μgの抗体を使用します。市販の二重特異性抗体も使用することができる。
    6. 各チューブに1,450 μLの培地を加えて、余分な抗体を洗い流します。800 x g で5分間遠心分離し、培地を注意深く吸引し、100 μL培地あたり2,000万個の武装T細胞の濃度で再懸濁します。
  2. マウスへの注射と生着
    1. 1 L / minの酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバーでマウスを麻酔します。.マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔される。
      メモ: 手順全体を通して熱サポートを提供します。
    2. 26G針を用いて、1匹のマウスあたり眼窩後方向に100μLの培地に2000万個のT細胞を注入する。
    3. 1,000 U組換えIL-2を皮下投与して、 in vivoでのT細胞の生存をサポートします。
    4. 二重特異性抗体を眼窩後(T細胞注射に使用しない眼内)または腹腔内に投与します。マウスが麻酔から回復し、ケージに戻るのを待ちます。
      注:ここでも、ラボで生成された独自の抗体が使用されましたが、代わりに市販の抗体を使用することもできます。ここでの実験では、1用量あたりマウスあたり0.3〜10μgの抗体を投与しました。抗体を週に2回、3〜4週間投与した。

4. ルシフェラーゼ形質導入T細胞を生着させたマウスの in vivo イメージング

注:このステップは、イメージングの日に実行されるべきであり、必ずしもT細胞および/または抗体がマウスに投与されるのと同じ日ではない。通常、ルシフェラーゼ形質導入T細胞の投与から24時間後にイメージングを行います。

  1. D-ルシフェリンの調製
    1. 1 gのD-ルシフェリンを33.3 mLの滅菌PBS(最終濃度:30 mg / mL)に溶解します。
    2. 溶解したD-ルシフェリンを33 x 1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、チューブを-20°Cに保ちます。
    3. イメージング当日に、イメージングする動物の数に対して30 mg / mLのD-ルシフェリンの十分なアリコートを解凍します。1本のチューブで10匹の動物に十分です。
      注意: 使用後、残りのD-ルシフェリンを再凍結してください。D-ルシフェリンは、少なくとも5回の凍結/解凍サイクルで安定しています。
  2. マウスへのD-ルシフェリンの投与
    注:D-ルシフェリンをマウスに投与する前に、イメージングソフトウェアを開き、システムを初期化してください。カメラの冷却には数分かかる場合があり、これはマウスにD-ルシフェリンを注射する前に行い、基質の投与後5分でイメージングが確実に行えるようにする必要があります。
    1. 1 L / minの酸素中に3.5%(v / v)吸入イソフルランを供給するチャンバー内で最大5匹のマウスに麻酔をかけます。.マウスは、後肢ペダル離脱反射が消失したときに完全に麻酔される。
    2. マウスが完全に麻酔されたら、26 G針による眼窩後注射により、マウスあたり100 mg / mLの30 mg / mL D-ルシフェリン(マウスあたり3 mg)を投与します。.D-ルシフェリンを次のグループに投与する前に、このグループのマウスを画像化します。前のグループが画像化されている間に麻酔されるイソフルランチャンバーにマウスの次のグループを配置します。
  3. ルシフェラーゼ形質導入T細胞のイメージング
    1. 麻酔したマウスをイメージャーの遮光チャンバーに移動し、3%イソフルランを0.5 L/minで投与し続けます。異種移植片を支える側面がカメラに向かって上を向くように、マウスを横に置きます。マウスを仰臥位にして別の一連の画像を撮影し、肺におけるT細胞の存在を評価します。
    2. 画像取り込みコントロールパネルを使用して、[発光、写真、オーバーレイ]を選択します。露出時間を自動、ビニングを中、F/停止時間を1に設定します。画像を取得します。最初の画像の後、最初の画像に対して自動的に計算された露出時間と一致するように露出時間を設定して、後続の画像を直接比較できるようにします。ピクセル飽和なしで最も明るい信号を達成するための最適な露光時間を決定するために、複数の露光時間で画像をキャプチャすることが有用な場合があります。
    3. マウスをイソフルランから取り出し、ケージに戻り、目覚めて歩行可能になるまで観察します。
    4. すべてのグループがイメージ化されるまで、手順4.2.1の手順を繰り返します。

結果

ステップ4.3で説明したように、マウスは、異なる組織におけるT細胞の存在を評価するために、画像化中に異なる位置に配向され得る。仰臥位は、注射後の早い時点で一般的である肺のT細胞の評価を可能にする。皮下異種移植片を上に向けた横方向の位置配置は、腫瘍へのT細胞輸送を最もよく評価するために使用されます。雌の C.Cg-Rag2 tm1Fwa Il2rgtm1Sug/JicTacマウスを、こ...

ディスカッション

T-BsAbブリナツモマブはCD19陽性血液悪性腫瘍に対して承認されていますが、固形腫瘍へのT-BsAbsの実装の成功ははるかに困難であることが証明されています。上皮細胞接着分子(EPCAM)に対するT-BsAbであるカツマキソマブは、卵巣がん患者の悪性腹水の治療薬として承認されましたが、その後、商業上の理由で薬の生産が中止されました19。固形腫瘍に対して承認された他のT-BsAbs?...

開示事項

NKCは、Y-mAbs Therapeuticsから商業研究助成金を受け取ったと報告しています。NKCは、MSKがY-mAbs Therapeutics、Biotec Pharmacon/Lallemand、Abpro-labsにライセンス供与した発行済み特許の発明者および所有者です。MSKとNKCはY-mAbsに金銭的利害関係を有しています。NKCは、ユーレカセラピューティクスからストックオプションを受け取ったと報告しています。HFGおよびMECには関連する開示はありません。

謝辞

著者らは、この記事の代表的な結果のセクションで説明されている実験で使用されたルシフェラーゼ構築物を共有してくれたウラジミール・ポノマレフ博士に感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
293T cellsATCCCRL-11268
BSASigma AldrichA7030-10G
CD3/CD28 beadsGibco (ThermoFisher)11161D
D-Luciferin, Potassium SaltGoldbioLUCK-1G
DMEMGibco (ThermoFisher)11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)SignaGen LaboratoriesSL100688
EDTASigma AldrichE9884-100G
FBSGibco (ThermoFisher)10437028
Gag/pol plasmidAddgene14887
GFP plasmidAddgene11150-DNA.cg
Penicilin-StreptomycinGibco (ThermoFisher)15140122
Recombinant human IL-2R&D Systems202-IL-010/CF
RetronectinTakaraT100B
TrypsinGibco (ThermoFisher)25-300-120
VSV-G plasmidAddgene8454

参考文献

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