Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

Resumo

Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.

Resumo

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e testes clínicos para tumores sólidos. Fatores como valência, arranjo espacial, distância entre domínios e mutações Fc afetam a eficácia antitumoral dessas terapias, comumente influenciando o homing de células T para tumores, o que continua sendo um grande desafio. Aqui, descrevemos um método para transduzir células T humanas ativadas com luciferase, permitindo o rastreamento in vivo de células T durante estudos de terapia com T-BsAb. A capacidade dos T-BsAbs de redirecionar células T para tumores pode ser avaliada quantitativamente em vários momentos durante o tratamento, permitindo que os pesquisadores correlacionem a eficácia antitumoral de T-BsAbs e outras intervenções com a persistência de células T em tumores. Este método alivia a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento para avaliar histologicamente a infiltração de células T e pode ser repetido em vários pontos de tempo para determinar a cinética de tráfego de células T durante e após o tratamento.

Introdução

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) são anticorpos projetados usados para fornecer especificidade artificial às células T policlonais, engajando as células T através de um braço de ligação e um antígeno tumoral através de outro braço de ligação. Essa tecnologia tem sido aplicada com sucesso em cânceres hematológicos (blinatumomab¹ direcionado para CD19), e numerosos T-BsAbs estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico para uma variedade de tumores sólidos também². Os T-BsAbs envolvem células T policlonais de maneira independente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e, portanto, mesmo tumores que regulam negativamente os antígenos leucocitários humanos (HLAs) são suscetíveis a esse tipo de terapia ^3,4. Os T-BsAbs foram desenvolvidos em dezenas de formatos diferentes, com diferenças na valência e arranjo espacial dos braços de ligação de células T e tumores, distâncias interdomínios e a inclusão de um domínio Fc, que afeta a meia-vida e pode induzir funções efetoras se^presente5. Trabalhos anteriores em nosso laboratório mostraram que esses fatores afetam significativamente a eficácia antitumoral dos T-BsAbs, com diferenças de até 1.000 vezes na^potência6. Através deste trabalho, identificamos o formato IgG-[L]-scFv como a plataforma ideal para T-BsAbs (veja a seção Resultados Representativos para mais detalhes sobre os formatos T-BsAb), e aplicamos essa plataforma a alvos incluindo GD2 (neuroblastoma), HER2 (câncer de mama e osteossarcoma), GPA33 (câncer colorretal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (malignidades de células B) e CD33 (malignidades de células B)^7, 8,9,10,11,12,13.

Um dos principais desafios para implementar com sucesso a terapia com T-BsAb em tumores sólidos é superar um microambiente tumoral imunossupressor (TME) para direcionar o tráfego de células T para tumores¹⁴. Os fatores que afetam a eficácia do T-BsAb descritos acima têm um impacto significativo na capacidade dos T-BsAbs de induzir efetivamente o homing de células T para tumores, mas esse efeito é difícil de avaliar em um sistema in vivo em tempo real. Este manuscrito fornece uma descrição detalhada do uso de células T transduzidas por luciferase em estudos pré-clínicos de T-BsAbs para avaliar o tráfego de células T para vários tecidos em modelos experimentais de camundongos imunocomprometidos durante o tratamento. O objetivo geral deste método é fornecer um meio para avaliar a infiltração de células T em tumores e outros tecidos, bem como informações em tempo real sobre a cinética e persistência de células T, sem a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento. Para o número crescente de pesquisadores com foco em imunoterapias celulares, a capacidade de rastrear células T in vivo em modelos animais pré-clínicos é crucial. Nosso objetivo é fornecer uma descrição completa e detalhada do método que empregamos para rastrear células T transduzidas por luciferase para permitir que outros pesquisadores repliquem facilmente esta técnica.

Protocolo

Os procedimentos a seguir foram avaliados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Memorial Sloan Kettering.

1. Transfecção de células 293T com luciferase e colheita do sobrenadante viral

1. Cultura de células 293T
   1. Preparar o meio adicionando a um litro de DMEM cada: 110 mL de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor, 11 mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Descongelar células 5 x 10⁶ 293T e transferi-las para um balão T175 com o meio preparado como descrito acima.
   3. Divida as células 293T 1:10 a cada 3 dias por 6 dias. Não permita que as células se tornem mais de 90% confluentes.
2. Transfecção de células 293T
   NOTA: As seguintes quantidades de reagentes são calculadas para transfecção de um frasco T175 de células 293T. Ajustar em conformidade se for necessário transduzir mais frascos.
   1. Transfira 1,5 mL de meio para cada um dos dois tubos de 50 mL usando uma pipeta. A um tubo, adicione 10 μg de plasmídeo VSV-G, 20 μg de Gag/pol e 20 μg de plasma de luciferase de tomate TD TD (CBR-TDR) e misture. Ao outro tubo, adicionar 100 μL de DNA in vitro transfecção reagente e misturar. Incubar ambos os tubos à temperatura ambiente (TR) por 5 min.
      NOTA: Todos os plasmídeos descritos neste manuscrito foram fornecidos pelo Dr. Vladimir Ponomarev.
   2. Transfira o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA gota a gota para o tubo contendo os plasmídeos de DNA (acima de aproximadamente 30 s) e misture suavemente com uma pipeta. Incubar em TR por 20 min.
   3. Durante esses 20 min de incubação, separar as células 293T adicionando 5-10 mL de tripsina a 0,05%. Uma vez que as células tenham se destacado, adicionar 10 mL de meio e centrifugar a 800 x g por 5 min. Ressuspender as células em 1,5 mL de meio.
   4. Adicionar o meio contendo o reagente de transfecção in vitro de DNA e os plasmídeos de DNA às células 293T e incubar a 37 °C por 30 min.
   5. Transferir para um balão T175 e adicionar 18 ml de meio. Incubar a 37 °C durante a noite.
   6. No dia seguinte, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro sem desprender as células. Substitua por 18 mL de meio fresco. Incubar a 37 °C durante a noite numa incubadora.
3. Colheita do sobrenadante viral
   1. Retire o sobrenadante viral usando uma pipeta colocada no gelo. Centrifugar a 800 x g por 5 min para peletizar as células e detritos.
      NOTA: Se o pellet de células for grande, as células foram provavelmente interrompidas do frasco quando o sobrenadante foi removido. Estas células podem ser novamente plaqueadas em um novo frasco com meio fresco.
   2. Filtrar o sobrenadante viral usando um filtro de 0,22 μm.
   3. Use o sobrenadante viral imediatamente. Mantenha-o no gelo ou a 4 °C por até 24 h, ou congele-o a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.

2. Expansão e transdução de células T humanas ativadas com luciferase

1. Ativação de células T humanas in vitro
   1. Lavar as esferas adicionando 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM a um tubo estéril de 15 mL, adicionando esferas (uma conta para cada duas células T), colocando em um rack magnético por 2 min e aspirando o PBS.
   2. Preparar o meio conforme descrito na etapa 1.1.1, adicionar IL-2 a uma concentração final de 30 UI/mL e adicionar as esferas lavadas. Fazer 2,5 mL de meio para cada dois milhões de células T a serem ativadas.
   3. Conte as células T (recém-purificadas ou previamente purificadas, congeladas, descongeladas e lavadas) usando um hemocitômetro e coloração de azul de tripano. Adicionar células T ao meio preparado no passo 2.1.2 e inverter suavemente o tubo para misturar. As células T se expandirão pelo menos 20x, dependendo da fonte e da saúde geral das células. Determine o número de células T a serem ativadas calculando o número necessário para tratar os camundongos e dividindo por 20. Aqui, 20 x 106 células T por camundongo foram usadas com base em experimentos preliminares.
   4. Placa de 2,5 mL de meio contendo dois milhões de células T, contas e IL-2 em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Cultura a 37 °C em estufa umidificada a 5% CO₂ .
   5. Examine as células T sob um microscópio de 20x todos os dias durante os próximos 3 dias para determinar quando transduzir com luciferase. As células estão prontas quando se amontoam e esgotam a mídia, transformando-a de vermelho/rosa para laranja claro.
2. Preparação de placas de retronectina
   NOTA: A retronectina é usada para revestir as placas usadas na transdução, pois aumenta a transdução gênica¹⁵.
   1. Adicionar 2 mL de 20 μg/mL de retronectina em PBS a um poço de uma placa de 6 poços não tratada. Incubar durante 2 h a TR ou 1 h a 37 °C. Um poço revestido com retronectina é necessário para cada dois milhões de células T a serem transduzidas.
   2. Aspirar a retronectina sem riscar o fundo da placa.
   3. Adicionar 3 mL de BSA a 2% em PBS (filtrado estéril) por poço na placa de 6 poços. Incubar por 30 min no TR.
3. Espinoculação
   1. Aspirar a BSA sem riscar o fundo da placa.
   2. Lave os poços uma vez com 3 mL de PBS por poço. Continue ou substitua por PBS fresco e deixe a placa coberta a 4 °C durante a noite.
   3. Adicionar 2 ml de sobrenadante viral CBR-TDR luciferase (recolhido no passo 1.3) por poço.
   4. Centrifugar a 1.240 x g por 90 min a 32 °C.
4. Transdução
   1. Conte as células T.
   2. Aspirar o sobrenadante viral sem arranhar o fundo da placa.
   3. Placa de dois milhões de células T por poço em 6 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 30 UI/mL de IL-2 humana.
   4. Examine as células T diariamente. As células T estão prontas para serem expandidas quando estiverem quase confluentes, geralmente após 2 dias.
   5. Quando as células estiverem quase confluentes, lave-as suavemente do fundo da placa usando uma pipeta e transfira cada poço para um balão T75 separado. Adicionar 9 ml de meio para um total de 15 ml de meio por frasco.
   6. No dia seguinte, adicionar mais 15 mL de mídia. As células devem estar prontas para injetar em camundongos no dia seguinte a essa adição de meio. Confirme o sucesso da transdução realizando citometria de fluxo (a construção luciferase contém um fluoróforo de tomate TD visível no canal de PE)¹⁶.

3. Enxertia de células T transduzidas com luciferase em camundongos imunocomprometidos

1. Preparar e contar as células T para injeção.
   1. Retire as células T dos frascos e conte. As células estão prontas para injetar quando tiverem expandido 20x-30x, geralmente no 7º dia pós-ativação.
   2. Centrifugar as células T a 800 x g por 5 min. Ressuspenda em 2 mL de mídia e remova as contas usando um rack magnético.
   3. Para experimentos em que as células T serão injetadas separadamente dos anticorpos biespecíficos, conte as células T e ressuspenda de modo que a concentração final seja de 20 milhões de células T por 100 μL de meio. Pule para a etapa 3.2. Para experiências que utilizem células T armadas ex vivo (EATs), avance para o passo 3.1.4.
   4. Para experimentos com células T armadas ex vivo , conte as células T e separe-as em tubos individuais de 1,5 mL para cada grupo, com 20 milhões de células por camundongo. Por exemplo, se houver três grupos de cinco camundongos cada, prepare três tubos de 1,5 mL com 100 milhões de células T cada.
   5. Centrifugar os tubos de 1,5 mL a 800 x g por 5 min. Remova o meio cuidadosamente sem perturbar o pellet de células T. Ressuspender em no máximo 50 μL de meios contendo os anticorpos biespecíficos. Incubar em TR por 30 min.
      NOTA: Para fins de experimentos conduzidos neste estudo, anticorpos patenteados IgG-[L]-scFv T cell-engaging biespecíficos gerados em laboratório foram usados. Para o armamento de células T, use 5 μg de anticorpo por 20 x 10⁶ células T. Anticorpos biespecíficos comercialmente disponíveis também podem ser usados.
   6. Lave o excesso de anticorpos adicionando 1.450 μL de meio a cada tubo. Centrifugar a 800 x g por 5 min, aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender a uma concentração de 20 milhões de células T armadas por meio de 100 μL.
2. Injeção e enxertia em camundongos
   1. Anestesiar os camundongos em uma câmara que fornece 3,5% (v/v) de isoflurano inalado em 1 L/min de oxigênio. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
      NOTA: Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento.
   2. Usando uma agulha de 26 G, injete 20 milhões de células T em 100 μL de meio retroorbitalmente por camundongo.
   3. Administrar 1.000 U de IL-2 recombinante por via subcutânea para apoiar a sobrevivência de células T in vivo.
   4. Administrar os anticorpos biespecíficos retroorbitalmente (no olho não utilizado para injeção de células T) ou intraperitonealmente. Permita que os ratos se recuperem da anestesia e retornem às suas gaiolas.
      NOTA: Novamente, aqui, anticorpos patenteados que foram gerados em laboratório foram usados, mas os anticorpos disponíveis comercialmente poderiam ser usados em vez disso. Nos experimentos, 0,3-10 μg de anticorpo por camundongo por dose foram administrados. Os anticorpos foram administrados duas vezes por semana durante 3-4 semanas.

4. Imagem in vivo de camundongos enxertados com células T transduzidas por luciferase

NOTA: Esta etapa deve ser realizada no dia da aquisição de imagens, que não é necessariamente o mesmo dia em que as células T e/ou anticorpos são administrados aos camundongos. Tipicamente, realizamos exames de imagem 24 h após a administração das células T transduzidas pela luciferase.

1. Preparação de D-luciferina
   1. Dissolver 1 g de D-luciferina em 33,3 mL de PBS estéril (concentração final: 30 mg/mL).
   2. Aliquot a D-luciferina dissolvida em tubos de microcentrífuga de 33 x 1,5 mL e mantenha os tubos a -20 °C.
   3. No dia da imagem, descongelar alíquotas suficientes de 30 mg/mL de D-luciferina para o número de animais a serem fotografados. Um tubo é suficiente para 10 animais.
      NOTA: Recongele a D-luciferina restante após o uso. A D-luciferina é estável por pelo menos cinco ciclos de congelamento/descongelamento.
2. Administração de D-luciferina em camundongos
   NOTA: Antes de administrar D-luciferina aos ratos, abra o software de imagem e inicialize o sistema. A câmera pode levar vários minutos para esfriar, e isso deve ser feito antes que os camundongos sejam injetados com D-luciferina para garantir que a imagem possa ocorrer 5 minutos após a administração do substrato.
   1. Anestesiar até cinco camundongos em uma câmara que fornece isoflurano inalatório a 3,5% (v/v) em 1 L/min de oxigênio. Os camundongos são totalmente anestesiados quando o reflexo de retirada do pedal do membro posterior desaparece.
   2. Uma vez que os camundongos estejam totalmente anestesiados, administrar 100 μL de 30 mg/mL de D-luciferina por camundongo (3 mg por camundongo) por injeção retroorbital com uma agulha de 26 G. Imagine este grupo de camundongos antes de administrar D-luciferina ao próximo grupo. Coloque o próximo grupo de camundongos na câmara de isoflurano para ser anestesiado enquanto o grupo anterior está sendo fotografado.
3. Imagem de células T transduzidas por luciferase
   1. Mover os camundongos anestesiados para a câmara estanque do imageador e continuar administrando isoflurano a 3% a 0,5 L/min. Coloque os ratos de lado de tal forma que o flanco que suporta o xenoenxerto esteja virado para cima em direção à câmera. Tire outro conjunto de imagens com os camundongos em posição supina para avaliar a presença de células T nos pulmões.
   2. Usando o Painel de Controle de Aquisição, selecione Luminescente, Fotografia e Sobreposição. Defina o tempo de exposição como automático, o binning como médio e F/Stop como 1. Adquirir imagens. Após a primeira imagem, defina o tempo de exposição para corresponder ao que foi calculado automaticamente para a primeira imagem para que as imagens subsequentes possam ser comparadas diretamente. Pode ser útil capturar imagens com vários tempos de exposição para determinar o tempo de exposição ideal para alcançar o sinal mais brilhante sem saturação de pixels.
   3. Retire os camundongos do isoflurano, retorne para suas gaiolas e observe até que estejam acordados e deambulando.
   4. Repita as etapas da etapa 4.2.1 até que todos os grupos tenham sido imageados.

Resultados

Como descrito na etapa 4.3, camundongos podem ser orientados em diferentes posições durante a aquisição de imagens para avaliar a presença de células T em diferentes tecidos. O posicionamento supino permite a avaliação das células T nos pulmões, o que é comum nos primeiros momentos após a injeção. O posicionamento lateral com o xenoenxerto subcutâneo virado para cima é usado para melhor avaliar o tráfego de células T para o tumor. Camundongos fêmeas C.Cg-Rag2^tm1Fwa Il2rg^tm1Sug...

Discussão

Enquanto o T-BsAb blinatumomab foi aprovado para neoplasias hematológicas CD19-positivas, a implementação bem-sucedida de T-BsAbs em tumores sólidos tem se mostrado muito mais difícil. O catumaxomabe, um T-BsAb dirigido contra a molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM), foi aprovado para o tratamento de ascite maligna em pacientes com câncer de ovário, mas a produção do fármaco foi posteriormente interrompida por razões comerciais¹⁹. Nenhum outro T-BsAbs foi aprovado para tum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454