Rastreando o Tráfico de Células T Induzido por Anticorpos Biespecíficos Usando Células T Humanas Transduzidas por Luciferase

Resumo

Aqui, descrevemos um método para transdução de células T humanas com luciferase para facilitar o rastreamento in vivo do tráfego de células T induzido por anticorpos biespecíficos para tumores em estudos para avaliar a eficácia antitumoral e o mecanismo de anticorpos biespecíficos que envolvem células T.

Resumo

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e testes clínicos para tumores sólidos. Fatores como valência, arranjo espacial, distância entre domínios e mutações Fc afetam a eficácia antitumoral dessas terapias, comumente influenciando o homing de células T para tumores, o que continua sendo um grande desafio. Aqui, descrevemos um método para transduzir células T humanas ativadas com luciferase, permitindo o rastreamento in vivo de células T durante estudos de terapia com T-BsAb. A capacidade dos T-BsAbs de redirecionar células T para tumores pode ser avaliada quantitativamente em vários momentos durante o tratamento, permitindo que os pesquisadores correlacionem a eficácia antitumoral de T-BsAbs e outras intervenções com a persistência de células T em tumores. Este método alivia a necessidade de sacrificar animais durante o tratamento para avaliar histologicamente a infiltração de células T e pode ser repetido em vários pontos de tempo para determinar a cinética de tráfego de células T durante e após o tratamento.

Introdução

Os anticorpos biespecíficos que envolvem células T (T-BsAbs) são anticorpos projetados usados para fornecer especificidade artificial às células T policlonais, engajando as células T através de um braço de ligação e um antígeno tumoral através de outro braço de ligação. Essa tecnologia tem sido aplicada com sucesso em cânceres hematológicos (blinatumomab¹ direcionado para CD19), e numerosos T-BsAbs estão em desenvolvimento pré-clínico e clínico para uma variedade de tumores sólidos também². Os T-BsAbs envolvem células T policlonais de maneira independente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e, portanto, m....

Protocolo

Os procedimentos a seguir foram avaliados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Memorial Sloan Kettering.

1. Transfecção de células 293T com luciferase e colheita do sobrenadante viral

1. Cultura de células 293T
   1. Preparar o meio adicionando a um litro de DMEM cada: 110 mL de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor, 11 mL de penicilina-estreptomicina.
   2. Descongelar células 5 x 10⁶ 293T e transferi-las para um balão T175 com o meio preparado como descrito acima.
   3. Divida as células 293T 1:10 a cada 3 dias por 6 dias. Não permita que as células se t....

Resultados

Como descrito na etapa 4.3, camundongos podem ser orientados em diferentes posições durante a aquisição de imagens para avaliar a presença de células T em diferentes tecidos. O posicionamento supino permite a avaliação das células T nos pulmões, o que é comum nos primeiros momentos após a injeção. O posicionamento lateral com o xenoenxerto subcutâneo virado para cima é usado para melhor avaliar o tráfego de células T para o tumor. Camundongos fêmeas C.Cg-Rag2^tm1Fwa Il2rg^tm1Sug.......

Discussão

Enquanto o T-BsAb blinatumomab foi aprovado para neoplasias hematológicas CD19-positivas, a implementação bem-sucedida de T-BsAbs em tumores sólidos tem se mostrado muito mais difícil. O catumaxomabe, um T-BsAb dirigido contra a molécula de adesão de células epiteliais (EPCAM), foi aprovado para o tratamento de ascite maligna em pacientes com câncer de ovário, mas a produção do fármaco foi posteriormente interrompida por razões comerciais¹⁹. Nenhum outro T-BsAbs foi aprovado para tum.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454