Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Özet

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Özet

T hücresini tutan bispesifik antikorlar (T-BsAbs), solid tümörler için klinik öncesi gelişim ve klinik testlerin çeşitli aşamalarındadır. Değerlik, mekansal düzenleme, alanlar arası mesafe ve Fc mutasyonları gibi faktörler, bu tedavilerin anti-tümör etkinliğini, genellikle T hücrelerinin tümörlere yönlendirilmesini etkileyerek etkiler ve bu da büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, aktif insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tarif ediyoruz, bu da T-BsAb terapi çalışmaları sırasında T hücrelerinin in vivo izlenmesine izin veriyor. T-BsAbs'nin T hücrelerini tümörlere yönlendirme yeteneği, tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında kantitatif olarak değerlendirilebilir ve araştırmacıların T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini ve diğer müdahaleleri tümörlerdeki T hücrelerinin kalıcılığı ile ilişkilendirmelerini sağlar. Bu yöntem, T hücresi infiltrasyonunu histolojik olarak değerlendirmek için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını hafifletir ve tedavi sırasında ve sonrasında T hücresi kaçakçılığının kinetiğinin belirlenmesi için birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir.

Giriş

T hücresine bağlı bispesifik antikorlar (T-BsAbs), T hücrelerini bir bağlanma kolundan ve bir tümör antijenini başka bir bağlanma kolundan geçirerek poliklonal T hücrelerine yapay özgüllük sağlamak için kullanılan mühendislik antikorlarıdır. Bu teknoloji hematolojik kanserlere (CD19 hedefli blinatumomab¹) başarıyla uygulanmıştır ve çok sayıda T-BsAb, çeşitli solid tümörler için preklinik ve klinik gelişim aşamasındadır². T-BsAb'lar, poliklonal T hücrelerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağımsız bir şekilde meşgul eder ve bu nedenle insan lökosit antijenlerini (HLA'lar) aşağı regüle eden tümörler bile bu tür b....

Protokol

Aşağıdaki prosedürler Memorial Sloan Kettering'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır.

1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı

1. 293T hücrelerin kültürü
   1. Her biri bir litre DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek ortam hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.
   2. 5 x 10⁶ 293T hücrelerini çözün ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan ortamla bir T175 şişesine aktarın.
   3. 293T hücrelerini 6 gün boyunca her 3 günde bir 1:10 bölün. Hücrelerin% 90'dan ....

Sonuçlar

Adım 4.3'te açıklandığı gibi, fareler farklı dokulardaki T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için görüntüleme sırasında farklı pozisyonlarda yönlendirilebilir. Sırtüstü konumlandırma, enjeksiyondan sonra erken zaman noktalarında yaygın olan akciğerlerdeki T hücrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Subkutan ksenogreft yukarı bakacak şekilde lateral pozisyonlama, tümöre T hücre kaçakçılığını en iyi şekilde değerlendirmek için kullanılır. Bu makalede açıklanan tüm de.......

Tartışmalar

T-BsAb blinatumomab CD19 pozitif hematolojik maligniteler için onaylanmış olsa da, T-BsAbs'nin solid tümörlerde başarılı bir şekilde uygulanmasının çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Epitel hücre adezyon molekülüne (EPCAM) karşı yönlendirilmiş bir T-BsAb olan Catumaxomab, yumurtalık kanseri hastalarında malign asitlerin tedavisi için onaylandı, ancak ilacın üretimi daha sonra ticari nedenlerle durduruldu¹⁹. Katı tümörler için başka hiçbir T-BsAb onaylanmamışt.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454