Luciferaz Dönüştürülmüş İnsan T Hücrelerini Kullanarak Bispesifik Antikor Kaynaklı T Hücresi Kaçakçılığını İzleme

Özet

Burada, T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorların anti-tümör etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için yapılan çalışmalarda, bispesifik antikor kaynaklı T hücresi kaçakçılığının tümörlere in vivo izlenmesini kolaylaştırmak için insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Özet

T hücresini tutan bispesifik antikorlar (T-BsAbs), solid tümörler için klinik öncesi gelişim ve klinik testlerin çeşitli aşamalarındadır. Değerlik, mekansal düzenleme, alanlar arası mesafe ve Fc mutasyonları gibi faktörler, bu tedavilerin anti-tümör etkinliğini, genellikle T hücrelerinin tümörlere yönlendirilmesini etkileyerek etkiler ve bu da büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, aktif insan T hücrelerini lusiferaz ile dönüştürmek için bir yöntem tarif ediyoruz, bu da T-BsAb terapi çalışmaları sırasında T hücrelerinin in vivo izlenmesine izin veriyor. T-BsAbs'nin T hücrelerini tümörlere yönlendirme yeteneği, tedavi sırasında birden fazla zaman noktasında kantitatif olarak değerlendirilebilir ve araştırmacıların T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini ve diğer müdahaleleri tümörlerdeki T hücrelerinin kalıcılığı ile ilişkilendirmelerini sağlar. Bu yöntem, T hücresi infiltrasyonunu histolojik olarak değerlendirmek için tedavi sırasında hayvanları kurban etme ihtiyacını hafifletir ve tedavi sırasında ve sonrasında T hücresi kaçakçılığının kinetiğinin belirlenmesi için birden fazla zaman noktasında tekrarlanabilir.

Giriş

T hücresine bağlı bispesifik antikorlar (T-BsAbs), T hücrelerini bir bağlanma kolundan ve bir tümör antijenini başka bir bağlanma kolundan geçirerek poliklonal T hücrelerine yapay özgüllük sağlamak için kullanılan mühendislik antikorlarıdır. Bu teknoloji hematolojik kanserlere (CD19 hedefli blinatumomab¹) başarıyla uygulanmıştır ve çok sayıda T-BsAb, çeşitli solid tümörler için preklinik ve klinik gelişim aşamasındadır². T-BsAb'lar, poliklonal T hücrelerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) bağımsız bir şekilde meşgul eder ve bu nedenle insan lökosit antijenlerini (HLA'lar) aşağı regüle eden tümörler bile bu tür bir tedaviye duyarlıdır ^3,4. T-BsAb'lar, T hücresinin ve tümör bağlama kollarının değerliği ve mekansal düzeni, alanlar arası mesafeler ve yarı ömrü etkileyen ve varsa efektör fonksiyonlarını indükleyebilen bir Fc alanının dahil edilmesindeki farklılıklarla düzinelerce farklı formatta geliştirilmiştir⁵. Laboratuvarımızdaki önceki çalışmalar, bu faktörlerin T-BsAbs'nin anti-tümör etkinliğini önemli ölçüde etkilediğini ve potens^6'da 1.000 kata kadar farklılıklar olduğunu göstermiştir. Bu çalışma sayesinde, IgG-[L]-scFv formatını T-BsAbs için ideal platform olarak tanımladık (T-BsAb formatları hakkında daha fazla ayrıntı için Temsilci Sonuçlar bölümüne bakın) ve bu platformu GD2 (nöroblastom), HER2 (meme kanseri ve osteosarkom), GPA33 (kolorektal kanser), STEAP1 (Ewing Sarkomu), CD19 (B hücreli maligniteler) ve CD33 (B hücreli maligniteler)⁷ dahil olmak üzere hedeflere uyguladık^. 8,9,10,11,12,13.

Katı tümörlerde T-BsAb tedavisinin başarılı bir şekilde uygulanmasındaki en büyük zorluklardan biri, tümörlere T hücresi kaçakçılığını sağlamak için immünosüpresif tümör mikroçevresinin (TME) üstesinden gelmektir¹⁴. Yukarıda tarif edilen T-BsAb etkinliğini etkileyen faktörler, T-BsAbs'nin tümörlere T hücresi homing'i etkili bir şekilde indükleme kabiliyeti üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, ancak bu etkinin in vivo bir sistemde gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi zordur. Bu makalede, tedavi sırasında deneysel immün sistemi baskılanmış fare modellerinde çeşitli dokulara T hücre kaçakçılığını değerlendirmek için T-BsAbs'nin klinik öncesi çalışmalarında lusiferaz transdüne T hücrelerinin kullanımının ayrıntılı bir açıklaması sunulmaktadır. Bu yöntemin genel amacı, tümörlerde ve diğer dokularda T hücresi infiltrasyonunu değerlendirmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, tedavi sırasında hayvanları feda etmeye gerek kalmadan T hücresi homing kinetiği ve kalıcılığı hakkında gerçek zamanlı bir bakış açısı sağlamaktır. Hücresel immünoterapilere odaklanan artan sayıda araştırmacı için, klinik öncesi hayvan modellerinde T hücrelerini in vivo olarak izleme yeteneği çok önemlidir. Diğer araştırmacıların bu tekniği kolayca çoğaltmalarını sağlamak için lusiferaz transdüne T hücrelerini izlemek için kullandığımız yöntemin kapsamlı ve ayrıntılı bir açıklamasını sunmayı amaçlıyoruz.

Protokol

Aşağıdaki prosedürler Memorial Sloan Kettering'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından değerlendirilmiş ve onaylanmıştır.

1. 293T hücrelerinin lusiferaz ile transfeksiyonu ve viral süpernatan hasadı

1. 293T hücrelerin kültürü
   1. Her biri bir litre DMEM'e aşağıdakileri ekleyerek ortam hazırlayın: 110 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin.
   2. 5 x 10⁶ 293T hücrelerini çözün ve yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan ortamla bir T175 şişesine aktarın.
   3. 293T hücrelerini 6 gün boyunca her 3 günde bir 1:10 bölün. Hücrelerin% 90'dan fazla birleşmesine izin vermeyin.
2. 293T hücrelerinin transfeksiyonu
   NOT: Aşağıdaki reaktif miktarları, 293T hücrelerin bir T175 şişesinin transfekte edilmesi için hesaplanmıştır. Daha fazla şişe dönüştürülecekse buna göre ayarlayın.
   1. Bir pipet kullanarak iki 50 mL tüpün her birine 1,5 mL ortam aktarın. Bir tüpe 10 μg VSV-G plazmid, 20 μg Gag / pol ve 20 μg tıklama böceği kırmızı TD domates (CBR-TDR) lusiferaz plazmidi ekleyin ve karıştırın. Diğer tüpe 100 μL DNA in vitro transfeksiyon reaktifi ekleyin ve karıştırın. Her iki tüpü de oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu makalede açıklanan tüm plazmidler Dr. Vladimir Ponomarev tarafından sağlanmıştır.
   2. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini içeren ortamı, DNA plazmidlerini içeren tüpe damla damla aktarın (yaklaşık 30 saniyenin üzerinde) ve bir pipetle hafifçe karıştırın. RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Bu 20 dakikalık inkübasyon sırasında, 5-10 mL% 0.05 tripsin ekleyerek 293T hücrelerini ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, 10 mL ortam ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın. Hücreleri 1.5 mL ortamdaki yeniden askıya alın.
   4. DNA in vitro transfeksiyon reaktifini ve DNA plazmidlerini içeren ortamı 293T hücrelerine ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. Bir T175 şişesine aktarın ve 18 mL ortam ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   6. Ertesi gün, hücreleri ayırmadan ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin. 18 mL taze ortam ile değiştirin. Bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Viral süpernatan hasadı
   1. Viral süpernatantı buza konmuş bir pipet kullanarak çıkarın. Hücreleri ve kalıntıları pelet etmek için 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
      NOT: Hücre peleti büyükse, süpernatant çıkarıldığında hücreler muhtemelen şişeden bozulmuştur. Bu hücreler taze ortam ile yeni bir şişede tekrar kaplanabilir.
   2. Viral süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin.
   3. Viral süpernatantı hemen kullanın. Buz üzerinde veya 24 saate kadar 4 ° C'de saklayın veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de dondurun.

2. Lusiferaz ile aktive edilmiş insan T hücrelerinin genişlemesi ve transdüksiyonu

1. İnsan T hücrelerinin in vitro aktivasyonu
   1. Steril 15 mL'lik bir tüpe %0,1 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek, boncuklar ekleyerek (iki T hücresi başına bir boncuk), 2 dakika boyunca bir mıknatıs rafına yerleştirerek ve PBS'yi emerek boncukları yıkayın.
   2. Ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın, ardından IL-2'yi 30 IU / mL'lik son konsantrasyona ekleyin ve yıkanmış boncukları ekleyin. Aktive edilecek her iki milyon T hücresi için 2,5 mL ortam yapın.
   3. Bir hemositometre ve tripan mavisi leke kullanarak T hücrelerini (taze saflaştırılmış veya önceden saflaştırılmış, dondurulmuş, çözülmüş ve yıkanmış) sayın. Adım 2.1.2'de hazırlanan ortama T hücreleri ekleyin ve karıştırmak için tüpü yavaşça ters çevirin. T hücreleri, hücrelerin kaynağına ve genel sağlığına bağlı olarak en az 20 kat genişleyecektir. Fareleri tedavi etmek için gereken sayıyı hesaplayarak ve 20'ye bölerek aktive edilecek T hücrelerinin sayısını belirleyin. Burada, ön deneylere dayanarak fare başına 20 x 106 T hücre kullanılmıştır.
   4. 24 delikli bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda iki milyon T hücresi, boncuk ve IL-2 içeren 2.5 mL ortam plakası. Nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de kültür.
   5. Lusiferaz ile ne zaman transdübe edileceğini belirlemek için T hücrelerini önümüzdeki 3 gün boyunca her gün 20x mikroskop altında inceleyin. Hücreler bir araya toplandıklarında ve medyayı tükettiklerinde, kırmızı / pembeden açık turuncuya dönüştürdüklerinde hazırdırlar.
2. Retronektin plakalarının hazırlanması
   NOT: Retronektin, gen iletimini arttırdığı için transdüksiyonda kullanılan plakaları kaplamak için kullanılır¹⁵.
   1. PBS'de 2 mL 20 μg / mL retronektin, işlenmemiş 6 delikli bir plakanın kuyucuğuna ekleyin. RT'de 2 saat veya 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Her iki milyon T hücresinin dönüştürülmesi için retronektin kaplı bir kuyu gereklidir.
   2. Plakanın tabanını çizmeden retronektini aspire edin.
   3. 6 delikli plakadaki kuyucuk başına PBS'de (steril filtreli) 3 mL% 2 BSA ekleyin. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
3. Spinokülasyon
   1. BSA'yı plakanın tabanını çizmeden aspire edin.
   2. Kuyucukları bir kez kuyu başına 3 mL PBS ile yıkayın. Devam edin veya taze PBS ile değiştirin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de kapalı bırakın.
   3. Kuyucuk başına 2 mL CBR-TDR lusiferaz viral süpernatant (adım 1.3'te toplanır) ekleyin.
   4. 32 °C'de 90 dakika boyunca 1.240 x g'de santrifüj.
4. Iletim
   1. T hücrelerini sayın.
   2. Viral süpernatantı plakanın dibini çizmeden aspire edin.
   3. 30 IU / mL insan IL-2 içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unun (DMEM) 6 mL'sinde kuyu başına iki milyon T hücresi plakası.
   4. T hücrelerini günlük olarak inceleyin. T hücreleri, genellikle 2 gün sonra, neredeyse birleştiklerinde genişlemeye hazırdır.
   5. Hücreler neredeyse birleştiğinde, bir pipet kullanarak plakanın altından yavaşça yıkayın ve her bir kuyucuğu ayrı bir T75 şişesine aktarın. Şişe başına toplam 15 mL ortam için 9 mL ortam ekleyin.
   6. Ertesi gün, ek olarak 15 mL ortam ekleyin. Hücreler, bu ortam ilavesinden bir gün sonra farelere enjekte edilmeye hazır olmalıdır. Akış sitometrisi yaparak başarılı transdüksiyonu onaylayın (lusiferaz yapısı, PE kanalında görülebilen bir TD domates floroforu içerir)¹⁶.

3. Bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde lusiferaz transdüslü T hücrelerinin engraftmanı

1. T hücrelerini enjeksiyon için hazırlayın ve sayın.
   1. T hücrelerini şişelerden çıkarın ve sayın. Hücreler, 20x-30x genişlediklerinde, genellikle aktivasyon sonrası 7. günde enjekte etmeye hazırdır.
   2. T hücrelerini 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 2 mL ortamda tekrar askıya alın ve bir mıknatıs rafı kullanarak boncukları çıkarın.
   3. T hücrelerinin bispesifik antikorlardan ayrı olarak enjekte edileceği deneyler için, T hücrelerini sayın ve nihai konsantrasyonun 100 μL ortam başına 20 milyon T hücresi olacak şekilde yeniden askıya alın. 3.2 adımına geçin. Ex vivo silahlı T hücreleri (EAT) kullanan deneyler için adım 3.1.4'e atlayın.
   4. Ex vivo silahlı T hücrelerini kullanan deneyler için, T hücrelerini sayın ve bunları fare başına 20 milyon hücre ile her grup için ayrı ayrı 1,5 mL tüplere ayırın. Örneğin, her biri beş fareden oluşan üç grup varsa, her biri 100 milyon T hücreli üç adet 1,5 mL tüp hazırlayın.
   5. 1,5 mL'lik tüpleri 800 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Ortamın T hücresi topaklarını rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın. Bispesifik antikorları içeren en fazla 50 μL'lik ortamda yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Bu çalışmada yapılan deneylerin amaçları doğrultusunda, laboratuvarda üretilen tescilli IgG-[L]-scFv T hücresi ile ilgilenen bispesifik antikorlar kullanılmıştır. T hücresi silahlandırması için, 20 x 10⁶ T hücresi başına 5 μg antikor kullanın. Ticari olarak temin edilebilen bispesifik antikorlar da kullanılabilir.
   6. Her tüpe 1.450 μL ortam ekleyerek fazla antikorları yıkayın. 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj yapın, ortamı dikkatlice aspire edin ve 100 μL ortam başına 20 milyon silahlı T hücresi konsantrasyonunda yeniden askıya alın.
2. Farelere enjeksiyon ve engraftman
   1. Fareleri, 1 L / dak oksijende% 3.5 (v / v) inhale izofluran sağlayan bir odada uyuşturun. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
      NOT: İşlem boyunca termal destek sağlayın.
   2. 26 G'lik bir iğne kullanarak, fare başına geriye dönük olarak 100 μL ortama 20 milyon T hücresi enjekte edin.
   3. T hücresi sağkalımını in vivo olarak desteklemek için 1.000 U rekombinant IL-2'yi deri altından uygulayın.
   4. Bispesifik antikorları retroorbital olarak (T hücresi enjeksiyonu için kullanılmayan göz içine) veya intraperitoneal olarak uygulayın. Farelerin anesteziden kurtulmasına ve kafeslerine dönmesine izin verin.
      NOT: Yine, burada, laboratuarda üretilen tescilli antikorlar kullanıldı, ancak bunun yerine ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılabilir. Buradaki deneylerde, doz başına fare başına 0.3-10 μg antikor uygulandı. Antikorlar 3-4 hafta boyunca haftada iki kez uygulandı.

4. Lusiferaz transdüslü T hücreleri ile aşılanmış farelerin in vivo görüntülemesi

NOT: Bu adım, T hücrelerinin ve / veya antikorların farelere uygulandığı gün olması gerekmeyen görüntüleme gününde gerçekleştirilmelidir. Tipik olarak, lusiferaz transdüe T hücrelerinin uygulanmasından 24 saat sonra görüntüleme yapıyoruz.

1. D-luciferin'in hazırlanması
   1. 1 g D-lusiferini 33.3 mL steril PBS içinde çözün (nihai konsantrasyon: 30 mg / mL).
   2. Çözünmüş D-lusiferini 33 x 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve tüpleri -20 ° C'de tutun.
   3. Görüntüleme gününde, görüntülenecek hayvan sayısı için yeterli miktarda 30 mg / mL D-lusiferin alikotunu çözün. Bir tüp 10 hayvan için yeterlidir.
      NOT: Kullanımdan sonra kalan D-luciferin'i tekrar dondurun. D-lusiferin en az beş donma / çözülme döngüsü için kararlıdır.
2. D-luciferin'in farelere uygulanması
   NOT: D-luciferin'i farelere uygulamadan önce, görüntüleme yazılımını açın ve sistemi başlatın. Kameranın soğuması birkaç dakika sürebilir ve bu, substratın uygulanmasından 5 dakika sonra görüntülemenin yapılabilmesini sağlamak için farelere D-lusiferin enjekte edilmeden önce yapılmalıdır.
   1. 1 L/dak oksijende %3,5 (v/v) solunan izofluran sağlayan bir odada beş fareye kadar anestezi uygulayın. Arka bacak pedalı çekilme refleksi ortadan kalktığında fareler tamamen uyuşturulur.
   2. Fareler tamamen anestezi altına alındıktan sonra, 26 G iğne ile retroorbital enjeksiyonla fare başına 100 μL 30 mg / mL D-lusiferin (fare başına 3 mg) uygulayın. D-luciferin'i bir sonraki gruba uygulamadan önce bu fare grubunu görüntüleyin. Bir sonraki fare grubunu, önceki grup görüntülenirken anestezi uygulanacak izofluran odasına yerleştirin.
3. Lusiferaz transdüne T hücrelerinin görüntülenmesi
   1. Anestezi uygulanan fareleri görüntüleyicinin ışık geçirmez odasına taşıyın ve 0,5 L/dak'da %3 izofluran uygulamaya devam edin. Fareleri, ksenogrefti taşıyan kanat kameraya doğru bakacak şekilde yanlarına yerleştirin. Akciğerlerdeki T hücresi varlığını değerlendirmek için farelerle sırtüstü pozisyonda başka bir dizi görüntü alın.
   2. Edinme Denetim Masası'nı kullanarak Lüminesan, Fotoğraf ve Bindirme'yi seçin. Pozlama süresini otomatik, gruplamayı orta ve F/Stop değerini 1 olarak ayarlayın. Görüntüleri alın. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntülerin doğrudan karşılaştırılabilmesi için pozlama süresini ilk görüntü için otomatik olarak hesaplananla eşleşecek şekilde ayarlayın. Piksel doygunluğu olmadan en parlak sinyali elde etmek için en uygun pozlama süresini belirlemek üzere birden fazla pozlama süresine sahip görüntüler yakalamak yararlı olabilir.
   3. Fareleri izoflurandan çıkarın, kafeslerine geri dönün ve uyanık ve ayakta olana kadar gözlemleyin.
   4. Tüm gruplar görüntülenene kadar adım 4.2.1'deki adımları tekrarlayın.

Sonuçlar

Adım 4.3'te açıklandığı gibi, fareler farklı dokulardaki T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için görüntüleme sırasında farklı pozisyonlarda yönlendirilebilir. Sırtüstü konumlandırma, enjeksiyondan sonra erken zaman noktalarında yaygın olan akciğerlerdeki T hücrelerinin değerlendirilmesine izin verir. Subkutan ksenogreft yukarı bakacak şekilde lateral pozisyonlama, tümöre T hücre kaçakçılığını en iyi şekilde değerlendirmek için kullanılır. Bu makalede açıklanan tüm de...

Tartışmalar

T-BsAb blinatumomab CD19 pozitif hematolojik maligniteler için onaylanmış olsa da, T-BsAbs'nin solid tümörlerde başarılı bir şekilde uygulanmasının çok daha zor olduğu kanıtlanmıştır. Epitel hücre adezyon molekülüne (EPCAM) karşı yönlendirilmiş bir T-BsAb olan Catumaxomab, yumurtalık kanseri hastalarında malign asitlerin tedavisi için onaylandı, ancak ilacın üretimi daha sonra ticari nedenlerle durduruldu¹⁹. Katı tümörler için başka hiçbir T-BsAb onaylanmamışt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454